способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий

Классы МПК:A61K38/37 факторы VIII
A61K35/16 плазма; сыворотка
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-03-13
публикация патента:

Изобретение относится к области препаративной биохимии, фармации и медицины и касается способа получения концентрата VIII фактора свертывания крови и продукта его содержащего. Способ включает использование в качестве источника криопреципитата плазмы крови, добавление гепарина, ПЭГ-4000, центрифугирование, к супернатанту добавляют трибутилфосфат и твин 80, повторное центрифугирование, осадок, отмытый хлористым натрием, растворяют в трис-HCl буфере с добавками, пропускают через колонку, заполненную гелем с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда, элюцию фактора VIII, диализ. Полученный концентрат не содержит фактора Виллебранда и имеет активность не менее 300 МЕ/мг белка с чистотой не менее 98%, и содержит альбумин до концентрации 0,1%. Продукт лиофилизован с последующей термообработкой. Изобретение позволяет получить продукт, который является апирогенным, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывает аллергических реакций и может быть использован в медицине, в ветеренарии, в научно-исследовательских целях. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области препаративной биохимии, фармации и медицины и касается способа получения концентрата VIII фактора свертывания крови и продукта его содержащего.

Фактор VIII играет важную роль в системе свертывания крови и является основным компонентом лекарственных средств, предназначенных для лечения гемофилии. В плазме крови его содержание невелико и составляет десятитысячные доли процента по отношению к общему белку. Это и определяет главную проблему в создании препаратов, содержащих данный фактор - необходимость в высокой эффективности технологических процессов их получения, учитывая главную составляющую себестоимости - стоимость плазмы крови человека. Все препараты, содержащие данный фактор, делятся по способу их получения на генно-инженерные и препараты, полученные из плазмы крови человека. Последняя группа представляет собой концентраты разной степени очистки. Максимальная очистка достигается с использованием моноклональных антител, пришитых к тому или иному носителю, минимальная - заключается в двух-трех нехроматографических стадиях очистки криопреципитата. Препараты промежуточной степени очистки получают с использованием комбинации тех или иных хроматографических методов. Такое разнообразие препаратов, содержащих фактор VIII, объясняется отсутствием единого мнения о необходимой и достаточной степени очистки от других компонентов плазмы крови.

Принципиальное различие технологий базируется на разном подходе к спектру белков, находящихся в конечной готовой лекарственной форме фактора VIII. Прежде всего это касается вопроса о необходимости очистки от фактора Виллебранда. Дело в том, что с одной стороны, фактор Виллебранда, находясь в комплексе с фактором VIII, стабилизирует последний, с другой, субъединицы фактора Виллебранда образуют огромные комплексы между собой. Поэтому, даже если очиститься от всех остальных белков плазмы крови, удельная активность фактора VIII в таком препарате будет далека от оптимальной (когда фактора Виллебранда в препарате нет вообще или молярное отношение фактор VIII: фактор Виллебранда 1:1) и будет определяться соотношением факторов. Известно, что такое отношение in vitro может достигать 1:100. А, учитывая еще и большую молекулярную массу фактора Виллебранда по отношению к фактору VIII, становится очевидной необходимость разрушения такого надмолекулярного комплекса фактора Виллебранда. В этом случае независимо от использования других технологических приемов можно ожидать больший выход и большую удельную активность фактора VIII в конечном препарате как высокой, так и низкой степени очистки.

Вопрос о том, как и на каком этапе выделения фактора VIII необходимо разрушить агрегат фактора Виллебранда, тесно связан с проблемой поддержания стабильности фактора VIII в процессе его выделения и очистки. После удаления факторов, понижающих стабильность фактора VIII, таких как протромбин и тромбин, наибольшее инактивирующее воздействие на него могут оказать процедуры вирусной инактивации. Дело в том, что это довольно жесткие процедуры и их проведение тем или иным способом требует наличия стабилизирующих факторов. Отчасти сам комплекс фактора VIII и фактора Виллебранда выполняет такую функцию. Поэтому разрушение надмолекулярных агрегатов фактора Виллебранда надо проводить либо после процедуры вирусной инактивации, либо искусственно вводить дополнительные стабилизаторы.

Известны способы получения концентрата фактора VIII, в частности, описанные в патентах RU 2025129, RU 2148411, RU 2055593.

Наиболее близким является способ, описанный в патенте RU 2253475.

Суть настоящего изобретения заключается в том, что разработан способ получения препаратов, содержащих фактор VIII, отличающийся тем, что с помощью тиол-дисульфидного обмена разрушались надмолекулярные комплексы фактора Виллебранда, активность фактора VIII при этом не затрагивалась. Предлагаемый способ позволил разработать метод получения препаратов, содержащих фактор VIII, отличающийся большей эффективностью и удельным содержанием по сравнению с аналогичными методами, но не включающими эту стадию.

Другим аспектом заявленного изобретения является продукт для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях, содержащий концентрат активного VIII фактора свертывания крови человека с удельной активностью не менее 300 МЕ/мг и 0,1% альбумина, и чистотой более 98%, полученный способом, приведенным в описании и в формуле.

Продукт может быть представлять собой раствор или лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом). В случае необходимости он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного - струйно или инфузией, внутримышечного, интраназального) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам. Наполнителями являются, например, сахара (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза или их смеси), восстановительные сахара (эритрол, маннитол и др.) в физиологически приемлемых концентрациях, в случае необходимости - антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. Дополнительно продукт может содержать неорганические и/или органические соли и их сочетания для поддержания приемлемых значений рН.

Растворителями для лиофилизированного продукта могут служить дистиллированная апирогенная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор.

Также можно лиофилизировать готовый продукт, содержащий концентрат VIII фактора и любой из перечисленных, вспомогательных веществ, в частности альбумин или их сочетание.

Продукт может иметь соответствующую упаковку и, необязательно, инструкцию по применению.

Осуществление способа поясняется следующими примерами.

Пример 1.

1 кг криопреципитата плазмы крови растворяли в течение 1 часа в воде, содержащей гепарин (3 ед./мл) при температуре 25°С. Добавляли гидроокись алюминия, доводили рН до 7,0 и после 15 минутной инкубации центрифугировали. К полученному супернатанту добавляли гепарин до конечной концентрации 3 ед./мл, после этого добавляли 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 2 мМ и инкубировали в течение часа, затем добавляли полиэтиленгликоль - 4000 до конечной концентрации 2%. После доведения рН до 6,6 инкубировали в течение 15 минут и центрифугировали. Осадок отбрасывали, а супернатант диализовали против воды, содержащей гепарин (3 ед./мл), добавляли глицин до конечной концентрации 13% и инкубировали в течение часа. Затем центрифугировали, осадок отбрасывали. К супернатанту добавляли трибутилфосфат до конечной концентрации 0,3% и твин 80 до конечной концентрации 1%, подводили рН до 7,2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 6 часов. После этого добавляли хлорид натрия до конечной концентрации 14%, инкубировали в течение часа и центрифугировали. Осадок отмывали раствором хлорида натрия и диализовали против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина. Удельная активность составляла около 60 МЕ/мг общего белка. Добавляли альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтровали и подвергали лиофилизации в сочетании с последующей термообработкой. Выход процесса по активности фактора VIII составлял около 60%.

Пример 2. Предпочтительный вариант осуществления способа.

Осадок концентрата фактора VIII получали, как в примере 1. После отмывания осадка раствором хлорида натрия его растворяли в 10 мМ трис HCl буфере, содержащем 100 мМ хлорид натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 10 мМ лизин и 5 ед./мл гепарина. Раствор пропускали через аффинную колонку, содержащую 1 л геля с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда (anti-vWF gel, Immunotech, France). Элюцию фактора VIII проводили после промывки 8 колоночными объемами уравновешивающего буфера. В состав элюирующего буфера входили 10 мМ трис HCl, 250 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, 2,5 мМ хлорида кальция, 250 мМ сульфата аммония, 2,55% глицерина. Полученный раствор диализовали против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина. Удельная активность составляла около 300 МЕ/мг. Добавляли альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтровали и подвергали лиофилизации в сочетании с последующей термообработкой. Выход процесса по активности фактора VIII составлял около 70%.

Чистота продукта не менее 98%.

Полученный продукт является апирогенным, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывает аллергических реакций и может быть использован в медицине, в ветеренарии, в научно-исследовательских целях.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения концентрата VIII фактора свертывания крови человека, характеризующийся тем, что криопреципитат плазмы крови растворяют в воде, содержащей 3 ед./мл гепарина при температуре 25°С, добавляют гидроокись алюминия, доводят рН до 7,0, инкубируют, центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют гепарин, затем 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 3 ед./мл и 2 мМ соответственно, инкубируют в течение часа, добавляют полиэтиленгликоль - 4000 до конечной концентрации 2%, доводят рН до 6,6, инкубируют 15 мин, центрифугируют, супернатант диализуют против воды, содержащей гепарин 3 ед./мл, далее добавляют глицин до конечной концентрации 13%, инкубируют в течение часа, центрифугируют, к супернатанту добавляют трибутилфосфат до конечной концентрации 0,3% и твин 80 до конечной концентрации 1%, доводят рН до 7,2, инкубируют при комнатной температуре в течение 6 ч, после этого добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 14%, инкубируют в течение часа, центрифугируют, осадок отмывают раствором хлорида натрия, растворяют в 10 мМ трис HCl буфере, содержащем 100 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 10 мМ лизина и 5 ед./мл гепарина, раствор пропускают через колонку, заполненную гелем с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда, элюируют буфером, состоящим из 10 мМ трис HCl, 250 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, 2,5 мМ хлорида кальция, 250 мМ сульфата аммония, 2,55% глицерина, полученный раствор диализируют против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина, к полученному концентрату, имеющему удельную активность не менее 300 МЕ/мг белка, добавляют альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтруют, лиофилизируют и подвергают термообработке.

2. Продукт, представляющий собой концентрат VIII фактора свертывания крови, характеризующийся тем, что получен способом по п.1, имеет удельную активность не менее 300 МЕ/мг белка с чистотой не менее 98% и содержит альбумин до концентрации 0,1%.

3. Продукт по п.2, характеризующийся тем, что представляет собой раствор или лиофилизированный порошок.

4. Продукт по п.2, характеризующийся тем, что дополнительно содержит фармацевтические наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального введения.

5. Продукт по любому из пп.2-4 для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях.

6. Продукт по п.5 для лечения или предупреждения состояний, связанных с недостатком VIII фактора.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2326689

patent-2326689.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K38/37 факторы VIII

Патенты РФ в классе A61K38/37:
новые защитные композиции для рекомбинантного фактора viii -  патент 2510279 (27.03.2014)
стабилизация жидких растворов рекомбинантного белка для хранения в замороженном состоянии -  патент 2469739 (20.12.2012)
способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека -  патент 2445974 (27.03.2012)
сайт-направленная модификация fviii -  патент 2423380 (10.07.2011)
способ получения концентрата фактора фон виллебранда или комплекса "фактор viii/фактор фон виллебранда" и его применение -  патент 2417096 (27.04.2011)
выделенный полипептид ib альфа гликопротеина тромбоцитов человека, слитый белок, молекула днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), клетка (варианты), способ экспрессии полипептида, способ экспрессии слитого белка, фармацевтическая композиция (варианты), способ ингибирования прикрепления клетки крови к биологической ткани в биологической системе, способ ингибирования прикрепления белка к биологической ткани в биологической системе и способ лечения нарушения -  патент 2403262 (10.11.2010)
композиции и способы терапии и диагностики рака молочной железы -  патент 2344831 (27.01.2009)
способ получения препарата фактора свертывания viii крови человека -  патент 2324495 (20.05.2008)
стабильная фармацевтическая композиция, содержащая фактор viii -  патент 2314825 (20.01.2008)
комбинированное применение полипептидов фактора vii и полипептидов фактора viii -  патент 2311923 (10.12.2007)

Класс A61K35/16 плазма; сыворотка

Патенты РФ в классе A61K35/16:
способ лечения язвенного пилородуоденального стеноза -  патент 2527336 (27.08.2014)
фармацевтическая композиция и способ получения противовирусных фракций (антивирус-с) -  патент 2526799 (27.08.2014)
способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови -  патент 2522237 (10.07.2014)
способ пластики костных дефектов -  патент 2517563 (27.05.2014)
способ лечения заболеваний, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов -  патент 2517060 (27.05.2014)
способ хирургического лечения несросшихся переломов и ложных суставов трубчатых костей при наличии дефицита мягких тканей в проекции несросшихся переломов и ложных суставов -  патент 2515146 (10.05.2014)
способ лечения эректильной дисфункции -  патент 2514639 (27.04.2014)
способ нормализации репродуктивной функции -  патент 2508117 (27.02.2014)
способ профилактики гнойно-воспалительных осложнений при лечении травматолого-ортопедических пациентов с использованием аппаратов внешней фиксации -  патент 2508062 (27.02.2014)
иммуномодулятор -  патент 2504371 (20.01.2014)


Наверх