способ лечения больных с хронической сердечной недостаточностью

Формула изобретения

Способ лечения больных с хронической сердечной недостаточностью, включающий забор у больного аутологичных клеток костного мозга (ККМ), выделение мононуклеарной фракции ККМ in vitro, культивирование этой фракции в газовой среде с последующим введением больному интрамиокардиально или интракоронарно, отличающийся тем, что культивирование мононуклеарной фракции ККМ осуществляют в течение 7-10 сут, при этом больному дополнительно вводят иммунокорригирующие препараты как во время культивирования клеток, так и после их трансплантации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и, и может найти применение в лечении больных с хронической сердечной недостаточностью.

Несмотря на успехи медицинской науки последних лет, количество пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) увеличивается с каждым годом, что является одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира.

По прогнозам департамента здоровья и человеческих ресурсов США в стране будет продолжаться неуклонный рост числа больных с ХСН, и к 2050 г. в США уже будет насчитываться таких больных более 16 миллионов человек [1].

Увеличение частоты развития ХСН в человеческой популяции заставляет специалистов разрабатывать принципиально новые, доступные и эффективные методы лечения ХСН.

Одним из таких методов является пересадка в миокард малодифференцированных клеток с мощным потенциалом к пролиферации и дифференцировке с целью улучшения сократительной способности миокарда, регуляции процессов ремоделирования левого желудочка (ЛЖ) после инфаркта миокарда (ИМ), лечения дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) и других патологий. [2, 3].

В эксперименте было доказано, что восстановление функции миокарда может быть достигнуто путем повышения функционального резерва кардиомиоцитов реципиента за счет стимуляции в них процессов гиперплазии и неоангиогенза, а также ингибирования апоптоза. [2, 3, 4].

Из различных направлении клеточной трансплантации наиболее перспективным является трансплантация прокультивированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) аутологичного костного мозга [2, 3, 5]. Эти клетки, будучи аутологичными для реципиента, снимают с врача этические, юридические и организационные проблемы получения донорских клеток, а также устраняют необходимость иммуносупрессивной терапии, которая обычно требуется после трансплантации эмбриональных и фетальных клеток [6]. Среди МСК костного мозга выделяют две популяции клеток: популяцию гемопоэтических стволовых клеток, которые способны пролиферировать и дифференцироваться в элементы красной и белой крови, и популяцию стромальных пластик - адгезивных клеток, которые при культивировании могут дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, в том числе и в кардиомиоциты [2, 3, 4].

Прокультивированные в течение нескольких дней в питательной среде, с обработкой в течение 24 часов 5-азацитидином, аутологичные МСК костного мозга, очищенные от эритроидных и тромбоцитарных элементов, после пересадки в зону кардиосклероза, вызванного криоповреждением, - вызвали у крыс ограничение экспансии рубца и левожелудочковой дилатации, улучшение коронарной перфузии и насосной функции сердца. Также было показано, что прокультивированные МСК костного мозга после пересадки в миокард, дифференцировались в клетки эндотелия, гладкомышечные клетки, и в кардиомиоциты, образуя щелевые контакты [6, 4]. Аналогичные и весьма обнадеживающие результаты трансплантации пластик-адгезивных МСК в эксперименте были получены в лаборатории биотехнологии стволовых клеток нашего института [2, 3].

В то же время наш опыт выполнения более 160 трансплантаций аутологичных МСК костного мозга кардиологическим больным в клинике ФГУ НИИТ и ИО Росздрава, позволяет констатировать, что достоверно позитивный клинический эффект наблюдается только у 60% пациентов с хронической СН. Такой вывод подтверждается и зарубежными авторами. Многофакторный анализ причин низкой эффективности терапии клетками KM у значительной части больных, учитывающий результаты клинического, лабораторного и инструментального исследования различных систем организма в зависимости от тяжести течения ХСН и сроков заболевания, позволили заключить, что эффективность клеточной трансплантации во многом определяется состоянием иммунной системы пациентов, особенно на момент забора костного мозга. Ранее в НИИТ и ИО Росздрава было показано, что хронические заболевания сердечно-сосудистой системы, а также прогрессирование ХСН сопровождаются дизрегуляцией функций иммунной системы с развитием вторичного иммунодефицита [7].

Иммунная дизрегуляция характеризуется резкой активацией клеток моноцитарно-макрофагального звена с развитием в организме системной воспалительной реакции и угнетением лимфоидного звена иммунитета. Последнее характеризуется снижением общего количества лимфоцитов в периферической крови, а также снижением количества и функциональной активности Т-клеток, которая сопровождается дисбалансом Т-хелперов и Т-супрессоров - ответственных за процессы восстановительной регенерации органов и тканей. Убедительные доказательства преобладающей активации при ХСН системного воспаления получены сотрудниками института. Показано, что с повышением функционального класса сердечной недостаточности - повышается содержанием в плазме крови маркеров воспаления - С-реактивного белка и неоптерина; вместе с тем показатели сократительной функции миокарда - ФИ и УО - находятся в обратной зависимости от содержания в плазме крови этих маркеров воспаления. Развитие системной воспалительной реакции не только тормозит процессы восстановительной регенерации клеток поврежденных органов, в том числе клеток иммунной системы, но тормозит и процессы популяционного обновления, пролиферации и дифференцировки самих стволовых клеток КМ - главного органа иммуногенеза в организме.

Это означает, что нарушение функционального состояния клеток иммунной системы периферической крови, отражая функциональное состояние стволовых клеток костного мозга у больных с хронической СН, вызывает более слабый регенерационный эффект от их применения.

Прототипом нашего изобретения является способ лечения больных с ХСН, включающий введение аутологичных клеток костного мозга (ККМ) в организм больного интракоронарно или интрамиокардиально [8]. Однако предложенный способ, как уже отмечалось выше, не учитывает патогенез развития ХСН, в связи с чем по нашим наблюдениям позитивный клинический эффект наблюдается только у 60% пациентов с ХСН.

Резюмируя все вышеуказанное, нами предложен способ лечения больных с ХСН, при котором перед проведением трансплантации за 7-10 суток у больного осуществляют забор аутологичных клеток костного мозга (ККМ), выделяют мононуклеарную фракцию ККМ in vitro, культивируют данную фракцию клеток в газовой среде от 7 до 10 суток, с последующим введением их больному, при этом осуществляют терапию больного иммунокоррегирующими препаратами как во время культивирования клеток, так и после их трансплантации.

Предложенный нами метод позволяет повысить эффективность трансплантации аутологичных клеток костного мозга у больных с ХСН, что в конечном итоге будет пролонгировать сроки клинической ремиссии у пациентов, ожидающих трансплантацию сердца.

Способ осуществляется следующим образом.

Получение аутологичных клеток костного мозга проводили в условиях операционной при соблюдении всех правил асептики.

Под местным обезболиванием, с помощью иглы Кассирского прокалывали кортикальную пластинку переднего гребня подвздошной кости и аспирировали костный мозг из губчатого вещества кости. Аспират в количестве 150-300 мл помещали в пробирки, содержащие гепарин, затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин; полученный осадок клеток ресуспендировали в лизирующем гипотоническом растворе, затем интенсивно перемешивали и вновь центрифугировали в течение 5 мин в том же режиме.

Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок свободный от эритроидных и тромбоцитарных элементов клеток ресуспендировали в ростовой среде. Суспензию клеток затем высевали для культивирования на чашки Петри d=150 мм и культивировали при 37°С в CO ₂-инкубаторе, при атмосфере с 5% CO₂ и 95% влажности в течение от 7 до 10 суток. После чего клетки, оставшиеся после культивирования, центрифугировали, к осадку добавляли р-р Хенкса (5 мл) и полученную взвесь клеток вводилась реципиенту. Введение взвеси клеток осуществляют любым известным образом, изложенным, например в [8] или [9]

Срок культивирования, а именно от 7 до 10 суток, был выбран в результате проведенных нами экспериментальных исследований, поскольку за данный срок (7 суток), клетки не только освобождались от иммуносупрессирующих факторов их микроокружения в больном организме, но и повышали (восстанавливали) свою функциональную активность, больше же 10 суток культивирования их функциональная активность снижалась.

Во время культивирования клеток, а также после трансплантации больному проводилась иммунокоррегирующая терапия с использованием иммунокорректоров.

Для проведения иммунокоррекции были использованы следующие препараты:

- полиоксидоний (N-оксидированное производное полиэтиленпиперозина с высоким молекулярным весом), ООО «Иммафарма» (Москва);

- имунофан (синтетический гексапептид, представляет собой 32-36 аминокислотные остатки тимопоэтина), НПП «Бионокс» (Москва);

- циклоферон (низкомолекулярный индуктор интерферона - N-метилглюкаминовая соль карбоксиметилакридона), ООО «НТФФ Полисан» (Санкт-Петербург);

- реаферон ( -2 интерферон), ЗАО «Вектор-Медика» (Россия).

Иммуномодуляторы назначались по стандартным схемам, рекомендованным в аннотациях к препаратам.

Подтверждение полученных результатов.

Все реципиенты аутологичных мононуклеарных клеток были разделены на 2 группы, 1-я контрольная (n=15); 2-я группа, получавшая иммунокоррекцию до и после трансплантации ККМ (n=18).

Статистическая обработка материала проводилась с помощью пакета прикладных программ обработки данных «Statistica 6.0.» (Statsoft, США, 2002). Достоверность различий между экспериментальными группами по изучаемым параметрам оценивались с помощью t-критерия Стьюдента для нормально распределенных количественных признаков с равными выборочными дисперсиями. Критическим уровнем статистической значимости при проверке статистических гипотез считали p 0,05 [Реброва О.Ю., 2002].

Группы больных не отличались между собой по медианам таких параметров, как возраст, длительность сердечной недостаточности, количество перенесенных инфарктов миокарда. У этих больных до и после трансплантации аутологичных мононуклеарных клеток определяли значения объемных характеристик левого желудочка (ЛЖ): конечный систолический объем левого желудочка (КСО ЛЖ), конечный диастолический объем левого желудочка (КДО ЛЖ), конечный систолический размер левого желудочка (КСР ЛЖ), конечный диастолический размер левого желудочка (КДР ЛЖ), фракция изгнания левого желудочка (ФИ ЛЖ) и рассчитывали прирост этих показателей, которые обозначали в виде ( =((Показатель после лечения - Показатель до лечения)/Показатель до лечения)·100%).

Проводя иммунокоррекцию, до и после трансплантации аутологичных ККМ удалось повысить эффективность проводимой клеточной терапии. Как видно из таблицы 1 в группе пациентов, которым проводили иммунокоррекцию до и после трансплантации аутологичных ККМ, через 6 месяцев после трансплантации клинический эффект был достоверно более выражен по сравнению с группой больных без иммунокоррекции.

Способ также иллюстрируется следующими клиническими примерами:

Пример №1. Пациентка Р., 60 лет, поступила в отделение коронарной хирургии и трансплантации сердца с жалобами на жгучие боли за грудиной при минимальной физической нагрузке, редко в покое; одышку.

Из анамнеза: ангинозный анамнез более 3-х лет. Ухудшение состояния с июля 2005 года, когда был диагностирован острый не Q-образующий ИМ в области ПСЛЖ. Более 10-ти лет страдает артериальной гипертонией. Поступила для проведения коронарографии и определения дальнейшей тактики лечения.

Сопутствующие заболевания: Гипертоническая болезнь 2 ст. Сахарный диабет 2-го типа, средне-тяжелого течения.

Аллергоанамнез - не отягощен.

При поступлении: общее состояние средней тяжести, повышенного питания, отеков нет. Над общими сонными и бедренными артериями шумов нет. В легких дыхание жесткое, проводится во все отделы, хрипов нет, ЧДД-16 в 1 мин. Границы сердца расширены влево, верхушечный толчок разлитой. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, акцент 2-го тона на ЛА, ЧСС - 68 в 1 мин, АД - 140/80 мм рт.ст. Живот при пальпации мягкий, б/б, печень не пальпируется. Дизурии нет, симптом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Отеков нет. ЦНС - без грубой патологии.

Обследование в отделении: данные общеклинических анализов крови и мочи в пределах нормы. При R-графии органов гр. кл. патологии не выявлено.

Анализы на ВИЧ, РВ, ГЕПАТИТЫ В и С - отрицательные

ЭКГ: ритм синусовый, ЧСС=69. Диффузное снижение амплитуды зубца «Т».

ЭХОКГ: Ао-3,4, ЛП-4,2, ПЖ-3,1, ЛЖ: КДР-4,6, КДО-95, КСР-3,1, КСО-36, УО-59, ФИ-62%. Объемные характеристики ЛЖ не увеличены. Клапанный аппарат интактен. ДЛА 12 мм рт.ст.

На основании данных обследования больному определен диагноз: ИБС: нестабильная (прогрессирующая) стенокардия. Постинфарктный кардиосклероз. Недостаточность кровообращения 2а. Гипертоническая болезнь 2 ст. Сахарный диабет 2-го типа, средне-тяжелого течения.

Пациентка была включена в научно-клиническую программу трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга в миокард. Был произведен забор костного мозга с дальнейшей сепарацией клеток костного мозга. Аутологичные мононуклеарные клетки культивировались в течение 7 дней и было произведено их интракоронарное и системное (нисходящий отдел аорты) введение. Без осложнений.

Для повышения клинического эффекта больной была проведена иммунокоррегирующая терапия полиоксидонием, который был назначен следующим курсом: 1-й день после забора 12 мг в/м, 2-й день 6 мг в/м, 3-й день 6 мг в/м, затем через день по 6 мг в/м в течение 10 дней.

На контрольном обследовании через 1 месяц после трансплантации клеток было установлено выраженное повышение показателей гемодинамики ( КДО - 10%, КСО - 8,5%, ФИ 12%) и перфузии миокарда, что может быть обусловлено улучшением микроциркуляции за счет неоангиогенеза.

Пример №2. Больной Г., 62 лет, поступил в отделение коронарной хирургии и трансплантации сердца, на момент поступления жалоб не предъявлял.

Из анамнеза: длительное время страдает артериальной гипертензией с максимальными подъемами АД до 170/100 мм рт ст. Без предшествующего ангинозного анамнеза 18.06.05 перенес крупноочаговый ИМ в области задней стенки ЛЖ с переходим на ПЖ. Поступил для проведениея КГВГ, при которой выявлено множественное стенотическое поражение коронарных артерий.

Сопутствующие заболевания: язвенная болезнь желудка в стадии ремиссии (в 1980 г. - операция "Б-2" по поводу прободной язвы), ГБ - II.

Аллергоанамнез - не отягощен.

При поступлении: общее состояние относительно удовлетворительное, отеков нет. В легких дыхание везикулярное, проводится во все отделы, хрипов нет, ЧДД-16 в 1 мин. Границы сердца не расширены. Тоны сердца приглушены, негрубый систолический шум на верхушке, ЧСС - 64 в 1 мин, АД-100/70 мм рт.ст. Живот при пальпации мягкий, б/б, печень не пальпируется. Дизурии нет, симптом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Отеков нет. ЦНС - без грубой патологии.

Обследование в отделении: данные общеклинических анализов крови и мочи в пределах нормы.

ЭКГ: ритм синусовый, ЧСС=64, PQ-0,14, QRS-0,09, QT-0,360. Динамика очаговых изменений по заднедиафрагмальному отделу. Повышение электрической активности ЛЖ.

ЭХОКГ: Ао-2,9, ЛП-3,6, ПЖ-2,3, ЛЖ: КДР-5,0, КДО-120, КСР-3,2, КСО-42, УО-78, ФИ-64%; по формуле «Симпсон»: КДО-106, КСО-43, УО-63, ФИ 56%. ТМЖП - 1,0, ТЗСТ - 0,8. Диастолическая функция: пик Е - 0,83, пик А - 0,68, Т1/2Е - 190. АК - створки атеросклеротически изменены, регургитация в ЛЖ - 0-1 ст. Мк - без особенностей, регургитация в ЛП - 0-1 ст. ТК - без особенностей, КЛА - регургитация в ПП - 0-1 ст. Рла ср - 25 мм рт ст. Объемные характеристики ЛЖ в пределах нормы. Сократительная способность удовлетворительная. Гипокинез нижней стенки с выраженнам гипокинезом базальных отделов, гипокинезия МЖП с участками акинеза.

КГВГ: ДАВЛЕНИЕ В ПОЛОСТЯХ СЕРДЦА И КРУПНЫХ СОСУДАХ: Левый желудочек: 140/0 мм рт.ст. КДД - 8 мм рт.ст. ВЕНТРИКУЛОГРАФИЯ: Объемные характеристики ЛЖ не увеличены, гипокинезия заднебазального сегмента ЛЖ. КОРОНАРОГРАФИЯ: ЛЕВАЯ КОРОНАРНАЯ АРТЕРИЯ (ЛКА): Ствол ЛКА: стенотического поражения не выявлено. Передняя межжелудочковая ветвь (ПМЖВ): стеноз 2-й степени в проксимальной трети, стеноз 3-й степени в средней трети. Огибающая ветвь (ОВ): стеноз 2-й степени в проксимальной трети ВТК, стеноз 3-й степени в средней трети ВТК. ПРАВАЯ КОРОНАРНАЯ АРТЕРИЯ (ПКА): Окклюзия на границе проксимальной и средней трети с заполнением дистального русла по межартериальным анастомозам.

ФЭГДС: оперированный желудок - вероятно Б-II.

На основании данных обследования больному выставлен диагноз: ИБС: нестабильная (ранняя постинфарктная) стенокардия. Q-образующий ИМ от 18.06.05, НК 1. Язвенная болезнь желудка в стадии ремиссии (состояние после операции по поводу прободной язвы желудка Б-II в 1980 году), ГБ - II.

14.07.2005 у больного произведен забор костного мозга с дальнейшей сепарацией культуры аутологичных стволовых клеток.

22.07.2005 пациенту выполнена трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга в миокард.

Для повышения клинического эффекта больной была проведена иммунокоррегирующая терапия циклофероном, который был назначен следующим курсом: 1 ампула (2 мл 12,5% раствора) в/м через день в течение 20 дней.

Результат. На контрольном обследовании через 1 месяц после трансплантации клеток было установлено выраженное повышение показателей гемодинамики ( КДО -15%, КСО -9,0%, ФИ 18%) и перфузии миокарда, что может быть обусловлено улучшением микроциркуляции за счет неоангиогенеза.

Таким образом, мы считаем, что иммунокоррекция больных с ХСН до и после трансплантации СК будет способствовать улучшению результатов трансплантации СК КМ у больных и будут пролонгированы сроки клинической ремиссии у пациентов, ожидающих трансплантацию сердца.

Литература

1. Yutaka Sakakibara; Keiichi Tambara; Fanglin Lu; Takeshi Nishina; Genichi Sakaguchi; Noritoshi Nagaya; Kazunobu Nishimura; Ren-Ke Li; Richard D.Weisel; Masashi Komeda. Combined Procedure of Surgical Repair and Cell Transplantation for Left: Ventricular Aneurysm: An Experimental Study. Circulation, 2002; 106: 1-193.

2. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Потапов И.В., Башкина Л.В., Берсенев А.В. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2002, 4, 3-6.

3. Потапов И.В., Башкина Л.В., Зайденов В.А., Аврамов П.В. Влияние пересадки эмбриональных кардиомиоцитов и мезенхимальных клеток костного мозга на сократительную функцию сердца при экспериментальном инфаркте миокарда. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002, 3, стр.88-89.

4. Гендлин Г.Е., Самсонова Е.В., Бухало О.В. Методики исследования качества жизни у больных хронической сердечной недостаточностью. Сердечная недостаточность, том 1, 2, 2000.

5. ь, Kocher AA, Schuster, Szabolcs MJ, Takuma S, Burkhoff D, Wang J, Homma S, Edwards NM, Itescu S. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med. 2001 Apr; 7 (4): 412-3.

6. Jih-Shiuan Wang, Dominique Shum-Tim, Jacques Galipeau, Edgar Chedrawy, Nicoletta Eliopoulos, Ray C.-J. Chiu. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: Feasibility and potential clinical advantages: J Thorac Cardiovasc Surg, 2000; 120: 999-1006.

7. Ермакова Л.П. Состояние иммунной системы у кардиологических больных при искусственном кровообращении и внутриаортальной контрпульсации. Автореферат кандидатской диссертации 2001, М., 26 с.

8. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А. и др. Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда. Российский кардиологический журнал, №5 2003, 42-50 с.

9. RU 2250772 от 27.04.2005.

Таблица 1.
Сравнение параметров объемных характеристик ЛЖ у пациентов без и с предварительной иммунокоррекцией через 6 месяцев после клеточной терапии.
Параметры	Группа без иммунокоррекции	Группа с иммунокоррекцией	p-level*
КДО	-1.7±9.4	-20.3±4.3*	0.04
КСО	-11.9±17.8	-26.3±3.3*	0.04
КДР ЛЖ	3.8±18.4	-3.2±1.6
ФИ	11.2±17.7	35.0±4.9*	0.015
* - достоверно по отношению к группе без иммунокоррекции (р<0.05)