способ получения трансплантата для лечения сахарного диабета у собак и кошек и способ лечения сахарного диабета у собак и кошек

Формула изобретения

1. Способ получения трансплантата для лечения сахарного диабета у собак и кошек, включающий извлечение поджелудочной железы, ее механическое измельчение, обработку диспергирующими растворами, повторное измельчение, промывку раствором Хенкса, помещение в культуральную среду и выделение -клеток, отличающийся тем, что для извлечения поджелудочной железы используют 26±2-дневные плоды кроликов или 56±3 - дневные плоды кошек или собак, повторное измельчение поджелудочной железы проводят до размера 0,1-1,0 мм, в культуральную питательную среду добавляют 5-10% фетальной коровьей сыворотки, а выделение -клеток осуществляют путем смены культуральной среды через каждые 3-4 дня на протяжении 10-14 дней культивирования, после чего полученные -клетки отмывают от питательной среды и сыворотки раствором Хенкса и помещают в стерильный физиологический раствор.

2. Способ лечения сахарного диабета у собак и кошек, включающий трансплантацию им -клеток поджелудочной железы, отличающийся тем, что для трансплантации используют трансплантат, полученный по п.1, который путем 5-7 инъекций в дозе по 0,2 мл вводят собакам и кошкам непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени под контролем ультразвукового исследования.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной медицины и клеточной биотехнологии, в частности к получению материала поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом животным, и способ лечения сахарного диабета методом трансплантации.

В настоящее время актуальной является проблема лечения сахарного диабета у людей, однако, эта проблема остро стоит также в отношении животных, представляющих породную и продуктивную ценность, поэтому разработка эффективных способов лечения сахарного диабета животных является актуальной.

Известен способ получения клеточного материала, содержащего -клетки от млекопитающих для трансплантации. Для этого полученную поджелудочную железу измельчают, обрабатывают диспергирующими растворами протеолитических ферментов (коллагеназа, трипсин) и после ресуспендирования помещают островки -клеток в питательную среду с добавлением 5-10% плодной сыворотки коровы [1].

Известен также способ получения трансплантата, содержащего -клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом людям и способ лечения сахарного диабета людей методом трансплантации. При этом для трансплантации больным сахарным диабетом используют поджелудочную железу новорожденного кролика, плода человека или другого млекопитающего. Промывают железу в растворе Хэнкса с добавлением антибиотиков, разрезают ее на фрагменты и засевают полученным материалом культуральные матрасы, добавляя культуральную (ростовую) среду и сыворотку млекопитающих, и обеспечивают режим, при котором -клетки свободно мигрируют из культивируемых микрофрагментов поджелудочной железы на дно культурального матраса, для чего осуществляют инкубацию при температуре 35-40°С в продолжение от двух суток до шести недель с однократным или многократным снижением температуры до 4-25°С и выдержкой при пониженной температуре, а также с временным однократным или периодическим снижением концентрации сыворотки, затем собирают - клетки со дна культурального матраса и получают материал для трансплантации.

Для лечения сахарного диабета людей проводят трансплантацию материала, содержащего -клетки поджелудочной железы, полученные с использованием феномена миграции -клеток, при этом материал может быть трансплантирован в различные органы и ткани: внутримышечно, в частности, в прямую мышцу живота, в печень (непосредственно в паренхиму или через воротную вену или ее ветви), в пульпу селезенки, в селезеночную вену, в полость брюшины, в специально создаваемый мышечный карман, в большой сальник [2].

В задачу наших исследований входило - получить трансплантат от животных, содержащий -клетки поджелудочной железы с последующей трансплантацией животным, больным сахарным диабетом, направленной на нормализацию уровня глюкозы в крови, снижение дозы вводимого экзогенного инсулина и предотвращение сопутствующих течению сахарного диабета сосудистых осложнений.

Это удалось достичь благодаря тому, что в качестве материала были использованы поджелудочные железы плодов животных на сроках гестации - 26±2 дня для кроликов, 56±3 дня для собак, 56±3 дня для кошек. Извлеченные поджелудочные железы промывают раствором Хэнкса, механически измельчают, обрабатывают диспергирующими растворами, повторяют измельчение до размера 0,1-1 мм, промывают раствором Хэнкса и помещают в культуральную питательную среду с добавлением 5-10% фетальной коровьей сыворотки; далее через каждые 3-4 дня проводят смену среды до получения чистой культуры - 10-14 дней, после чего полученные -клетки отмывают от питательной среды и сыворотки раствором Хэнкса и помещают в стерильный физиологический раствор; о качестве трансплантата судят по снижению уровня глюкозы в крови больного животного.

Полученный трансплантат вводят больным сахарным диабетом животным, преимущественно собакам и кошкам, непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени 5-7 уколов по 0,2 мл суспензии, под контролем ультразвукового исследования; о результатах выздоровления больного животного судят по снижению уровня глюкозы в крови до физиологической нормы.

Сущность предложенного способа получения трансплантата заключается в следующем: извлеченную поджелудочную железу помещают в раствор Хэнкса с антибиотиками. Удаляют капсулу, прослойки соединительной ткани с кровеносными сосудами и основными разветвлениями выводных протоков. Декапсулированную поджелудочную железу помещают в глубокое часовое стекло и разрезают на фрагменты размером 2-3 мм. Измельченный материал промывают раствором Хэнкса с антибиотиком. После этого фрагменты заливают 0,1-0,3% раствором коллагеназы на растворе Хэнкса при комнатной температуре на 10-15 мин, отмывают раствором Хэнкса и тщательно измельчают глазными ножницами на микрофрагменты размером 0,1-1 мм. Материал промывают средой 199 с 5-10% фетальной сыворотки и помещают в культуральный матрас. Смена среды 1 раз в 3-4 дня в течение 10-14 дней.

Способ лечения сахарного диабета животных заключается в следующем - перед трансплантацией больному животному проводят инсулиновую терапию, направленную на нормализацию уровня глюкозы в крови, за 3 дня до трансплантации -клеток больному животному назначают терапию антикоагулянтными средствами. Перед трансплантацией кожу животного обрабатывают стандартно для ультразвукового исследования, выбривают, обрабатывают антисептиком, увлажняют. Общей анестезии и обездвиживания животного не проводят. Трансплантат, представляющий собой суспензию -клеток в физиологическом растворе, набирают в шприц с длинной иглой с мандреном для спинномозговой пункции. Прокол брюшной стенки проводят левее белой линии на уровне конца мечевидного отростка грудины под контролем ультразвука. Иглой чрескожно и через мышечную брюшную стенку попадают в паренхиму левой доли печени и после удаления мандрена инъецируют трансплантат порциями по 0,2 мл в 5-7 точек. Иммуносупрессивной терапии после трансплантации не проводят. Контроль результатов трансплантации оценивают по снижению уровня глюкозы в крови до физиологической нормы и, соответственно, по снижению дозы вводимого инсулина.

Конкретные примеры отражены в таблицах.

Табл.1. Изменения уровня глюкозы у клинических пациентов, выражается в ммоль/л
	До трансплантации	Сутки, после трансплантации
		-1	1	7	14	30	60	90	120	150	180	210	240	270	300	330	360
Стафф.	19,3	19	5,2	4,4	4,2	-	3,9	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Кот "М"	44,3	7,8	6,4	4,2	3,7	6,6	4,4	4,1	3,8	3,7	4,7	4,6	3,9	4,6	4,5	5,8	4,1
Англ.сеттер	32,6	33	20	7,2	-	8	22	11	5,8	31	11	3,3	2,7	-	-	-	-
Ирл.сеттер	26,7	9,7	11	4,5	4,7	4,8	5,3	4,8	4,8	4,8	4,3	4,3	4,3	-	-	-	-
Кот "К"	20,9	5,1	4,1	5,7	4,1	5,2	4,5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Ризен.	21,3	12	15	20	11	16	8,3	13	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Перс	18,8	9,7	5	4,7	10	7,7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Табл.2. Изменения доз вводимого экзогенного инсулина у клинических пациентов, выражается в мкИЕд
	Сутки, после трансплантации
	-1	1	7	14	30	60	90	120	150	180	210	240	270	300	330	360
Стафф.	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Кот "М"	10	0	3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Англ.сеттер	44	44	20	18	16	12	18	14	20	14	20	14
Ирл.сеттер	30	30	30	16	0	0	0	0	0	0	0	0
Кот "К"	15	15	3	9	12	7	6	5
Ризен.	40	40	15	40	28	30	36
Перс	20	18	11	18	23

Техническая значимость предложенного способа получения трансплантата состоит в следующем:

- получаемый материал, содержащий -клетки поджелудочной железы животных, не имеет «зрелых» антигенов видовой специфичности, что позволяет трансплантировать эти клетки без иммуносупрессивной терапии реципиента;

- благодаря отсутствию «узнаваемости» позволяет проводить ксеногенную (межвидовую) трансплантацию материала (кролик - собака, кролик - кошка) без применения иммуносупрессантов и без отторжения трансплантата.

Предложенный способ лечения сахарного диабета животных позволяет:

- неинвазинвным способом провести трансплантацию -клеток поджелудочной железы животных чрезкожно, под контролем ультразвука в паренхиму печени, без общей анестезии, без обездвиживания животного, без лапаротомии;

- благодаря трансплантации -клеток поджелудочной железы животных нормализовать уровень глюкозы в крови больных животных и, соответственно, значительно снизить дозы либо отказаться вообще от введения экзогенного инсулина;

- предотвратить развитие сопутствующих течению сахарного диабета сосудистых осложнений (нефропатий, ангиопатий, ретинопатий), приводящих к необратимым изменениям почек, слепоте, сосудистым нарушениям.

Предложенный способ получения трансплантата и способ лечения сахарного диабета животных апробирован нами в 2005-2006 гг. с положительными результатами в отделе клеточной биотехнологии ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, на базе ветеринарной клиники «Биоконтроль» Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН и на базе Московской скорой ветеринарной помощи «Аверс-Вет».

Предложенный способ лечения найдет применение в области ветеринарной медицины для лечения сахарного диабета и позволит сохранить высокоценных животных.

Источники информации.

1. Petropavlovskaia M., Rosenberg L. Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells? Cell Tissue Res. 2002 Oct; 310 (1):51-8.

2. Патент RU 2135193 C1, А61К 35/39, 1999 г.