способ определения эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы

Формула изобретения

1. Способ определения наличия эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы, отличающийся тем, что сыворотку крови освобождают от высокомолекулярных белков кипячением с последующим центрифугированием, затем выполняют спектрофотометрирование водного раствора супернатанта в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм, после чего производят расчет оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле:

где D_x( ) - спектр оптической плотности раствора супернатанта, полученного из образца сыворотки крови;

- средний спектр оптической плотности, полученный путем усреднения индивидуальных спектров поглощения растворов супернатанта из сыворотки крови здоровых доноров;

- длина волны света,

и при значении более 50% определяют наличие эндогенной интоксикации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кипячение сыворотки крови проводят в течение 3 мин при температуре 100°С и центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин, затем супернатант разводят дистиллированной водой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для определения эндогенной интоксикации при различных заболеваниях, сопровождающихся патологическим белковым катаболизмом и развитием токсических состояний. Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы.

Известен способ определения эндогенной интоксикации, включающий разведение 0,1 мл сыворотки крови 0,9 мл физиологического раствора перед проведением депротеинезации, осаждение белков путем прибавления к полученному раствору 0,5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, разведение полученного супернатанта в десять раз дистиллированной водой и измерение оптической плотности полученного раствора на длине волны 254 нм. О наличии эндогенной интоксикации судят по величине оптической плотности, полагая, что для практически здоровых людей единиц оптической плотности, а для больных D _больн.(254 нм) 0,136 единиц оптической плотности (патент RU №2193780, МКИ G01N 33/68, 33/48 от 27.11.2002).

Недостатком данного способа является то, что на результаты исследований влияет зависимость оптической плотности растворов от трудно учитываемых физико-химических свойств препаратов трихлоруксусной кислоты и ее концентрации (Ковалевский А.Н., Нифантьев О.Е. Замечания по скрининговому методу определения молекул средней массы. // Лабораторное дело. - 1989. - № 10. - С.35-39). Кроме того, разность между максимальным значением оптической плотности для практически здоровых людей и минимальным значением оптической плотности, при котором фиксируется наличие эндогенной интоксикации у больных, составляет всего 0,012 единиц оптической плотности. Из практики измерения оптической плотности по двулучевой методике известно, что в ультрафиолетовой области спектра (200-300 нм) разница в спектральных свойствах кювет, устанавливаемых в опорном и измерительном каналах, может приводить к систематическим ошибкам до 0,05-0,06 единиц оптической плотности (Зайдель А.Н., Островская Г.В., Островский Ю.И. Техника и практика спектроскопии. // М.: Наука, 2-е изд. - 1976. - С.88-94). Вследствие этого достоверность определения наличия эндогенной интоксикации по данному способу невысока.

Наиболее близким к предлагаемому способу является скрининговый способ определения эндогенной интоксикации, заключающийся в определении содержания веществ низкой и средней молекулярной массы в биологических жидкостях (Медицинские лабораторные технологии // под. ред. А.И.Карпищенко, С.-Петербург, "Интермедика", 1999 г., т.2, С.29-31).

Данный способ включает осаждение высокомолекулярных белков из исследуемой жидкости 10% раствором трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием (3000 об/мин, 20 минут) и определением коэффициента поглощения света разведенной в 10 раз надосадочной жидкостью. Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны света 254 и 280 нм против дистиллированной воды. Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в исследуемой жидкости характеризуют величиной оптической плотности, так как согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра величина оптической плотности раствора поглощающих центров пропорциональна их концентрации. По значениям оптической плотности при длинах волн 254 и 280 нм и судят о наличии эндогенной интоксикации. Этот способ страдает рядом недостатков:

1) Наличие в надосадочной жидкости неконтролируемого остаточного количества трихлоруксусной кислоты вносит погрешность в определение концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы при измерении на длине волны 254 нм против дистиллированной воды.

2) Условие пропорциональности между оптической плотностью и концентрацией поглощающих центров (закон Бугера-Ламберта-Бэра) выполняется только для однокомпонентного раствора. В многокомпонентной системе, какой является сыворотка крови, пропорциональность между оптической плотностью и концентрацией веществ низкой и средней молекулярной массы зависит не только от их суммарного содержания, но и от хромофорного состава веществ низкой и средней молекулярной массы. Поэтому при некоторых заболеваниях наличие эндогенной интоксикации не приводит к заметному изменению оптической плотности супернатанта на длинах волн 254 или 280 нм.

3) Вещества низкой и средней молекулярной массы состоят из олигопептидов с молекулярной массой 500-6000 дальтон и малых молекул с массой 150-300 дальтон. Следовательно, хромофорными фрагментами веществ низкой и средней молекулярной массы являются, в основном, аминокислотные остатки. Поэтому спектр поглощения супернатанта в ультрафиолетовой области будет определяться суммой спектров поглощения аминокислотных остатков. Из 20 аминокислот, участвующих в образовании белков и пептидов, только три содержат ароматический радикал - триптофан, тирозин, фенилаланин, поэтому большая часть хромофоров, входящих в состав веществ низкой и средней молекулярной массы, интенсивно поглощает свет в диапазоне от 200 до 230 нм (область поглощения пептидной связи) и слабо в диапазоне 250-300 нм (Досон Р., Эллиот В., Эллиот У., Джонс К. // Справочник биохимика, М., Мир, 1991, с.15-65). Поскольку трихлоруксусная кислота интенсивно поглощает свет именно в диапазоне 200-250 нм, постольку известный способ не позволяет использовать для диагностики наиболее информативную область спектра от 200 до 230 нм.

4) Существенным недостатком известного способа является также и то, что в качестве оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы используют величину оптической плотности. Величина оптической плотности зависит не только от концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы, но и условий проведения измерений (толщина и качество применяемых кювет, спектральное разрешение, погрешность и динамический диапазон используемого спектрофотометра), что сказывается на результатах определения эндогенной интоксикации.

Задачей изобретения является получение нового технического результата, заключающегося в повышении чувствительности и достоверности способа определения эндогенной интоксикации за счет устранения основных недостатков известного способа, а именно за счет создания условий для расширения диапазона спектрофотометрирования в сторону коротких длин волн до 200 нм с включением в анализ диагностически наиболее информативной области от 200 до 230 нм, характерной для пептидной связи.

Поставленная задача решается тем, что сыворотку крови освобождают от высокомолекулярных белков кипячением с последующим центрифугированием, затем выполняют спектрофотометрирование водного раствора супернатанта в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм, после чего производят расчет оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле:

где D_х( ) - спектр оптической плотности раствора супернатанта, полученного из образца сыворотки крови;

- средний спектр оптической плотности, полученный путем усреднения индивидуальных спектров поглощения растворов супернатанта из сыворотки крови здоровых доноров;

- длина волны света.

По величине оценочного показателя определяют наличие эндогенной интоксикации у пациента.

В частности, при определении эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом кипячение сыворотки крови проводят в течение 3 минут при температуре 100°С и центрифугируют в течение 5 минут при 6000 об/мин, затем супернатант разводят дистиллированной водой и спектрофотометрируют его в диапазоне длин волн от 200 до 230 нм, после чего оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы вычисляют по формуле:

и при значении оценочного показателя более 50% определяют наличие эндогенной интоксикации у больного острым деструктивным панкреатитом.

В отличие от известного способа, в заявляемом способе осаждение высокомолекулярных белков осуществляют кипячением с последующим центрифугированием, а не путем обработки сыворотки крови трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием.

Отсутствие в супернатанте следовых количеств трихлоруксусной кислоты позволяет расширить диапазон спектрофотометрирования с 250-330 до 200-330 нм.

Замена способа депротеинизации сыворотки крови позволяет исключить влияние концентрации и трудно учитываемых физико-химических свойств препаратов трихлоруксусной кислоты на величину оптической плотности растворов супернатанта.

В результате повышается точность определения содержания веществ низкой и средней молекулярной массы в сыворотке крови.

С целью определения эффективности осаждения высокомолекулярных белков кипячением сыворотки крови нами были проведены исследования супернатанта из сыворотки крови донора и больного деструктивным панкреатитом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Из хроматограммы, где по оси Х отмечена молекулярная масса, а по оси Y - интенсивность пика (см. чертеж) видно, что как в супернатанте из сыворотки крови донора (1), так и в супернатанте из сыворотки крови больного деструктивным панкреатитом (2), содержание фракции веществ с молекулярной массой менее 10000 дальтон составляет от 60 до 80%. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективность применяемой методики осаждения белка.

Важным отличием способа является введение нового оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы в крови пациента. В качестве оценочного показателя в заявляемом способе используют относительное превышение концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы в растворе супернатанта из исследуемого образца сыворотки крови над средней концентрацией веществ низкой и средней молекулярной массы в растворе супернатанта из сыворотки крови здоровых доноров. Для вычисления по заявляемому способу используют интегральное значение оптической плотности в спектральном диапазоне, соответствующем поглощению основных хромофоров веществ низкой и средней молекулярной массы.

Интервал интегрирования по длинам волн выбирают исходя из значений оптической плотности супернатанта в доступном спектрофотометрированию и наиболее информативном при конкретном заболевании диапазоне. В известном способе содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в крови характеризуют значением оптической плотности при фиксированной длине волны в спектре поглощения раствора супернатанта из образца сыворотки крови. В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бэра и свойством аддитивности спектров поглощения, величина оптической плотности раствора будет зависеть от условий проведения измерения (толщина и спектральные свойства кювет) и хромофорного состава основных компонентов входящих в пул веществ низкой и средней молекулярной массы:

где _j( ) - коэффициент молярной экстинкции j-го хромофора;

C_j - молярная концентрация j-го хромофора;

l - толщина кюветы.

Из приведенного выражения следует, что в известном способе на заключение о наличии эндогенной интоксикации оказывают влияние условия проведения измерений и тип заболевания.

В заявляемом способе применение оценочного показателя , который вычисляют, используя интегральные значения оптической плотности, позволяет устранить влияние условий проведения измерений на заключение о наличие эндогенной интоксикации. Кроме того, заявляемый способ расчета оценочного показателя в меньшей мере зависит от типа заболевания.

Справедливость этого утверждения следует из того, что выражение для вычисления оценочного показателя содержания веществ низкой и средней молекулярной массы можно преобразовать к виду, с полной очевидностью не зависящему от свойств применяемых кювет и длины волны измерения оптической плотности:

где - интегральный коэффициент экстинкции j-го хромофора в исследуемом образце;

- интегральный коэффициент экстинкции j-го хромофора в составе веществ низкой и средней молекулярной массы у здоровых доноров;

- концентрация веществ низкой и средней молекулярной массы в исследуемом образце;

- средняя концентрация веществ низкой и средней молекулярной массы в супернатанте из крови здоровых доноров.

Таким образом, применение интегральных значений оптической плотности позволяет определить процент превышения содержания веществ низкой и средней молекулярной массы с точностью до незначительной разницы в хромофорном составе пула веществ низкой и средней молекулярной массы (если хромофорный состав меняется незначительно, то и

Заявленный способ не очевиден для специалистов, работающих в данной области. Метод определения эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы известен и применяется давно, но никто из специалистов в данной области не использовал для осаждения крупномолекулярных белков сыворотки крови термический способ. Кажущаяся простота такого решения на самом деле потребовала длительных экспериментов в связи с высокой ответственностью получения значимых для диагностики и лечения результатов.

Неочевидность способа связана с точкой зрения, что необходимо осаждать крупномолекулярные белки сыворотки крови исключительно неорганическими кислотами. Нами впервые применен способ депротеинизации, который позволил устранить погрешности, связанные с содержанием в опытных образцах остатка неорганических кислот. Ценность такого нового подхода убедительно обоснована высокоэффективной жидкостной хроматографией. Отсутствие в опытных образцах остатка неорганических кислот позволяет в диагностике эндогенной интоксикации использовать наиболее информативную область спектра 200-230 нм, характерную для пептидных связей низкомолекулярных веществ.

Нами впервые в заявленном способе применен новый количественный показатель , который вычислен нами с учетом интегральных значений оптической плотности супернатанта сыворотки крови. Впервые устранено влияние условий проведения измерений на заключение о наличии эндогенной интоксикации. Кроме того, заявляемый способ расчета оценочного показателя в меньшей мере зависит от типа заболевания.

Для заявляемого способа характерны повышенная точность диагностики, а также стабильность и сопоставимость результатов исследования, что крайне важно для лечения данной группы больных. Показатель эндогенной интоксикации является основным критерием для определения прогноза, тяжести и исхода заболевания, а также выбора экстракорпоральных методов детоксикации.

Найденное техническое решение явилось результатом длительных поисков и экспериментов и в какой-то мере оказалось для нас неожиданно.

В настоящее время заявленный способ является способом выбора в определении веществ низкой и средней молекулярной массы для диагностики эндогенной интоксикации, в частности у больных хирургического профиля.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1.

Обследованы 15 здоровых доноров, результаты сопоставлены с данными обследования 15 больных с различными хирургическими заболеваниями, связанными с наличием синдрома эндогенной интоксикации организма (аппендицит, острый панкреатит, гнойная инфекция мягких тканей).

Определение степени эндогенной интоксикации определяли по заявляемому способу № 1 следующим образом.

Пробирки, содержащие 1,0 мл сыворотки крови 15 больных и 15 здоровых доноров, помещали на водяную баню и выдерживали 3 минуты при температуре 100°С. Затем в пробирки добавляли 4 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивали и центрифугировали образцы в течение 5 минут при 6000 об/мин. В чистые пробирки, содержащие 7 мл дистиллированной воды, добавляли по 0,5 мл полученного супернатанта и тщательно перемешивали. Растворы супернатанта наливали в кварцевые кюветы и измеряли спектры поглощения в диапазоне от 200 до 330 нм против дистиллированной воды, с шагом измерения 4 нм. Для каждого образца вычисляли интегральное поглощение в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм и оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле

где

Сопоставительный анализ критериев Стьюдента в таблице 1 свидетельствуют о том, что отношение разности между средними значениями оценочных показателей эндогенной интоксикации , определяемых по заявленному способу для группы больных и доноров, к стандартной ошибке разности этих показателей превышает 12,2, что свидетельствует о высокой степени достоверности различий (99,99%) средних оценочных показателей эндогенной интоксикации между группой больных и группой доноров с уровнем значимости р<0,0001.

Аналогичное сопоставление для тех же образцов крови по показателям эндогенной интоксикации, определяемых известным способом на длине волны 254 и 280 нм, показало, что отношение разности средних значений оптических плотностей для групп больных и доноров, определяемых на длине волны 254 и 280 нм по известному способу, к стандартной ошибке разности этих показателей составило 1,2 и 1,4 соответственно. Полученные результаты свидетельствует о том, что достоверность различия между оптическими плотностями для группы больных и здоровых доноров, определяемых известным способом, не превышает 76 и 83% с уровнем значимости р 0,24 и 0,17 соответственно.

Таким образом, сопоставление критериев Стьюдента для двух способов показало, что определение эндогенной интоксикации по заявляемому способу превосходит известный способ по достоверности различий между группами здоровых и больных. Вероятность ошибки в определении эндогенной интоксикации у больного по заявляемому способу составляет 0,01%. Известный способ не обеспечивает такой достоверности.

Пример 2.

Больной Б-ев Н.А., 50 лет. Поступил в хирургическое отделение ГКБ № 13 с жалобами на боли в правом подреберье, рвоту, повышенную температуру до 38°С.

При осмотре: больной бледный, вялый, пониженного питания. Язык сухой, обложен белым налетом. Частота сердечных сокращений 120 ударов в минуту, частота дыхания 22 в минуту. Живот симметричный, в дыхании не участвует, при пальпации резко болезненный в правом подреберье, напряжен, симптомы раздражения брюшины резко положительные, перистальтика кишечника резко ослаблена. После дополнительных инструментальных исследований был поставлен диагноз: Острый калькулезный обтурационный холецистит. Перивезикальный абсцесс. Эндогенную интоксикацию определяли по уровню веществ низкой и средней массы способом №2 следующим образом. Из кубитальной вены брали 5 мл крови, для отделения сыворотки от форменных элементов центрифугировали при 6000 оборотах 5 минут. Затем 1 мл сыворотки помещали в пробирку и нагревали на водяной бане до 100° в течение 3 минут. После этого в пробирку с денатурированным белком добавляли 4 мл дистиллированной воды и стеклянной палочкой тщательно перемешивали, далее пробирку для осаждения осадка центрифугировали при 6000 оборотах 5 минут. После этого отбирали 0,5 мл осветленного надосадка и прибавляли 7 мл дистиллированной воды. Затем на спектрофотометре определяли оптическую плотность раствора в диапазоне 200-230 нм, с шагом измерения 2 нм. Для определения уровня эндогенной интоксикации вычисляли оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле

где

Таким образом, уровень эндогенной интоксикации у данного больного составил 89%, что свидетельствовало о средней тяжести эндогенной интоксикации.

Стандартные данные клинико-лабораторного обследования подтверждали наличие выраженной эндогенной интоксикации. Анализ крови: эритроциты 4,7×10¹², гемоглобин 98 г/л, лейкоциты 21,1×10⁹ , эозинофилы - 1, палочкоядерные нейтрофилы - 41, сегментоядерные нейтрофилы - 40, лимфоциты - 10, моноциты - 8; СОЭ - 28 мм/ч.

Пример 3.

Больная О-ва М.М., 67 лет, находилась на лечении в отделении интенсивной терапии ГКБ №13 по поводу: Смешанного панкреонекроза с поражением забрюшинной клетчатки с двух сторон. Диффузного ферментативного перитонита.

Больной при поступлении проведено наряду с общим обследованием определение эндогенной интоксикации по заявленному способу так, как описано в примере 2. Уровень эндогенной интоксикации, который определяли, по заявленному способу составил 241%.

Учитывая степень эндогенной интоксикации больной, решено к проводимой комплексной терапии добавить экстракорпоральную детоксикацию.

На вторые сутки больной провели сеанс плазмосорбции. Исходный уровень эндогенной интоксикации, определенный по заявленному способу, с 241% снизился до 133%.

Как видно из примера, предлагаемый способ позволяет не только оценивать тяжесть эндогенной интоксикации, но и контролировать эффективность экстракорпоральных методов детоксикации.

Пример 4.

Обследованы 30 здоровых доноров, результаты сопоставлены с данными обследования 30 больных с некротическим панкреатитом.

Определение степени эндогенной интоксикации определяли по заявленному способу так, как описано в примере 2.

Для каждого образца вычисляли оценочный показатель содержания веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле:

где

Полученные результаты в таблице 2 свидетельствуют о том, что разность между минимальным значением оценочного показателя эндогенной интоксикации для больных некротическим панкреатитом и максимальным значением оценочного показателя эндогенной интоксикации для здорового человека в 14 раз больше погрешности измерения по заявляемому способу.

Сопоставление минимального значения для больных и максимального значения для доноров к погрешности измерения свидетельствует о высокой диагностической достоверности и чувствительности заявляемого способа определения эндогенной интоксикации по содержанию веществ низкой и средней молекулярной массы в сыворотке крови.

Заявляемый способ имеет большое социально-экономическое значение, поскольку существенно улучшает диагностику эндогенной интоксикации при острых хирургических заболеваниях и повышает достоверность полученных результатов, что очень важно в лечении этой категории больных.

Таблица 1 Сопоставление критериев Стьюдента для разработанного и известного способов
Заявляемый способ			Известный способ
№	здоровые	больные	здоровые	больные	здоровые	больные
	здоровые, %	больные, %	D здоров (254 нм)	Dбольн (254 нм)	Dздоров (280 нм)	Dбольн (280 нм)
1	12,0	93,9	0,20	0,42	0,39	0,61
2	6,1	79,6	0,15	0,32	0,33	0,51
3	11,2	113,6	0,24	0,39	0,31	0,61
4	-11,6	68,6	0,17	0,32	0,30	0,46
5	2,6	75,2	0,15	0,39	0,33	0,50
6	-13,9	94,4	0,13	0,38	0,25	0,54
7	-5,1	64,8	0,13	0,20	0,27	0,37
8	-0,9	61.2	0,22	0,28	0,38	0,36
9	-6,4	53,8	0,27	0,27	0,28	0,44
10	9,4	80,1	0,24	0,24	0,33	0,42
11	-6,7	57,8	0,18	0,40	0,29	0,47
12	13,2	48,6	0,35	0,24	0,39	0,38
13	-16,3	91,8	0,11	0,48	0,28	0,56
14	7,6	63,9	0,22	0,38	0,40	0,46
15	-1,1	34,2	0,19	0,18	0,34	0,32
0,01±9,8%		72,1±20,7%	0,2±0,06 ед.оп.пл.	0,33±0,09 ед.оп.пл.	0,32±0,05 ед.оп.пл.	0,48±0,09 ед.оп.пл.
p 0,0001			p=0,24		p=0,17

Таблица 2 Сопоставление минимального значения для больных и максимального значения для доноров к погрешности измерения
№ пробы	Здоровые доноры	№ пробы	Больные НП
	здор.± здор., %		больн.± больн., %
1	-11±3,0	1	109±2,1
2	-12±3,0	2	152±2,0
3	-14±3,0	3	90±2,1
4	-11±3,0	4	110±2,1
5	-7±2,9	5	247±1,8
6	-1±2,8	6	63±2,3
7	-7±2,9	7	75±2,2
8	9±2,7	8	135±2,0
9	0±2,8	9	206±1,9
10	1±2,8	10	142±2,0
11	6±2,7	11	134±2,0
12	-7±2,9	12	101±2,1
13	-7±2,9	13	75±2,2
14	25±2,5	14	132±2,0
15	6±2,7	15	148±2,0
16	7±2,7	16	113±2,1
17	-3±2,8	17	74±2,2
18	21±2,6	18	132±2,0
19	22±2,6	19	97±2,1
20	22±2,6	20	114±2,1
21	4±2,8	21	199±1,9
22	1±2,8	22	134±2,0
23	-5±2,9	23	97±2,1
24	-4±2,9	24	110±2,1
25	2±2,8	25	60±2,5
26	-11±3,0	26	195±1,9
27	-5±2,9	27	184±1,9
28	-5±2,9	28	141±2,0
29	2±2,8	29	129±2,0
30	-11±3,0	30	103±2,1