питательная среда для выращивания бактерий рода haemophilus

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus, содержащая источники азотного питания, витаминов, НАД, гемин, хлорид натрия, карбонат натрия, глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит в качестве стимулятора роста экстракт семян льна при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминопептид	0,75-0,85
гидролизат казеина	0,75-0,85
дрожжевой экстракт	0,35-0,45
экстракт семян льна	0,21-0,27
НАД	0,001
гемин	0,001
глюкозу	0,2
хлорид натрия	0,3
карбонат натрия	0,06
агар	1,3
дистиллированная вода	остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается увеличения ростовых свойств питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus - в частности Н.influenzae типа b - одного из трех основных возбудителей гнойного бактериального менингита, а также в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae №8143 и штамма другого вида - Н.parainfluenzae.

Изобретение может быть использовано в медицине, в микробиологии, в микробиологической промышленности в процессе приготовления питательных сред.

Изобретение заключается в том, что в известной питательной среде, содержащей источник азотного питания (ферментативный гидролизат крови животных - аминопептид), гидролизат казеина средней степени расщепления, экстракт кормовых дрожжей (источник витаминов), НАД, гемин, соль, в качестве источника факторов роста используют экстракт семян льна.

Прототипом служит питательная среда для получения рестриктирующих эндонуклеаз из бактерий рода Haemophilus. При выращивании на агаровых вариантах этих питательных сред Н.influenzae и Н.parainfluenzae образуют мелкие колонии (около 0,5 мм в диаметре) и в мазках из этих колоний, окрашенных по Граму, отмечены типичные мелкие грамотрицательные палочки, очень полиморфные, часто встречаются нитевидные формы и кроме того остатки разрушенных клеток.

Цель изобретения: разработка рецептуры питательной среды, обеспечивающей увеличение жизнеспособности клеток Н.influenzae b, бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae, определяемой по KOE, и диаметра выросших колоний, а также уменьшения полиморфизма клеток в мазках, что облегчает (способствует использованию) использование питательной среды в лабораторной практике.

Цель достигается тем, что в качестве препарата, дополнительно стимулирующего рост гемофильных бактерий, используется растительный экстракт, приготавливаемый из семян льна и добавляемый к ранее запатентованной среде в количестве 0,21-0,27 мас.%. Предлагаемая среда лишена этих недостатков, т.е. Н.influenzae b образуют колонии диаметром около 1 мм (почти в 2 раза крупнее - на 180% при р=0,05) и KOE - 200% по сравнению с прототипом (при р=0,05); в мазках - более однородные грамотрицательные палочки. Такие же результаты получены в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae.

Питательную среду готовят следующим образом.

К ингредиентам предложенной ранее питательной среды, в заданном соотношении, включая глюкозу и агар, добавляют водный экстракт семян льна, который получают после добавления к семенам льна кипящей дистиллированной воды (1:20), 3 часов экстракции в процессе остывания, осветления через марлевый фильтр. Для хранения экстракт семян льна стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. В питательную среду после стерилизации также при 121°С в течение 15 мин и остывания до 45-50°С добавляют необходимые для гемофилов факторы роста - НАД и гемин (10 мкг/мл) и готовую питательную среду разливают в чашки Петри.

Выращивание Н.influenzae и Н.parainfluenzae, проводят при 37°С в течение 18-24 часов.

Процент жизнеспособных клеток определяют по КОЕ (высев из разведения 10 ^-6 исходной взвеси густотой 10 ед.), диаметр колоний - путем их измерения с использованием специальной сетки с ценой деления 0,01 мм, морфологию клеток - в мазках из колоний, окрашенных по Граму.

Пример 1 (оптимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид	0,8
Гидролизат казеина	0,8
Дрожжевой экстракт	0,4
Экстракт семян льна	0,24
НАД	0,001
Гемин	0,001
Глюкоза	0,2
Хлорид натрия (NaCl)	0,3
Карбонат натрия (Na2 CO3)	0,06
Агар	1,3
Дистиллированная вода	остальное

Пример 2 (минимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид	0,75
Гидролизат казеина	0,75
Дрожжевой экстракт	0,35
Экстракт семян льна	0,21
НАД	0,001
Гемин	0,001
Глюкоза	0,2
Хлорид натрия (NaCl)	0,3
Карбонат натрия (Na2 CO3)	0,06
Агар	1,3
Дистиллированная вода	остальное.

Пример 3 (максимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид	0,8
Гидролизат казеина	0,8
Дрожжевой экстракт	0,4
Экстракт семян льна	0,24
НАД	0,001
Гемин	0,001
Глюкоза	0,2
Хлорид натрия (NaCl)	0,3
Карбонат натрия (Na2 CO3)	0,06
Агар	1,3
Дистиллированная вода	остальное.

Данные по КОЕ, диаметру колоний и морфологии клеток изученных штаммов на предлагаемой и известной среде приведены в табл.1.

Таблица 1
Наименование штамма	Питательная среда	Показатели качества сред:
		при высеве из 10 6		морфология клеток в мазке
		КОЕ	диаметр колоний, мм
Н.influenzae b	Предлагаемая (оптимальный вариант)	197	0,93	довольно однородные тонкие палочки
		р=0,05*	p=0,05 *
	Среда сравнения (прототип)	98	0,51	полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток
Н.influenzae, бескапсульный штамм	Предлагаемая (оптимальный вариант)	172	0,89	довольно однородные тонкие палочки
		p=0,05 *	p=0,05*
	Среда сравнения (прототип)	90	0,48	полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток
H.parainfluenzae	Предлагаемая (оптимальный вариант)	212	0,97	довольно однородные тонкие палочки
		p=0,05 *	p=0,05*
	Среда сравнения (прототип)	110	0,54	полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток
* по непараметрическому критерию "u" (Вилкоксона-Манна-Уитни).

Качественные характеристики используемых экстрактов и гидролизата

- Кислотный гидролизат казеина средней степени расщепления

Аминный азот - (0,34-0,40)%

Общий азот - (0,55-0,65)%

Степень расщепления белка - 0,57-0,67

Содержание хлоридов - (1,6-1,8)%

рН 4,5-4,7

- Дрожжевой экстракт

Возможно использование экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) или импортного дрожжевого экстракта (ДЭ)

ЭКД - аминный азот - (1,9-2,3)%; рН 5,2-6,2

ДЭ - аминный азот - (2,0-3,0)%; рН 6,5-7,0

- Экстракт семян льна

20 г лекарственной формы «льна семена» заливают 400 мл кипящей дистиллированной воды (1:20), настаивают 2 ч, фильтруют;

сухой остаток - (0,5-0,7)%; рН 5,7-6,1.

Кроме приведенной области применения предложенная питательная среда может служить основой в следующих случаях:

- при дифференциации бактерий рода Haemophilus в случае исключения из состава среды фактора роста - гемина выросшие колонии не будут относиться к виду Н.influenzae; при исключении и НАД, и гемина выросшие колонии не относятся к бактериям рода Haemophilus, нуждающимся в одном из перечисленных факторов роста;

- при добавлении соответствующих ингибирующих добавок среда может служить основой для селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus - путем добавления бацитрацина (100 мкг/мл).