способ лечения полнослойных дефектов суставной поверхности

Формула изобретения

1. Способ лечения полнослойных дефектов суставной поверхности путем введения в область дефекта имплантата, содержащего аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (МСК), отличающийся тем, что в качестве носителя клеток используют плазматический сгусток, имплантат получают суспендированием 10-15 млн МСК в аутоплазме, предварительно консервированной в растворе Олсвера, и последующей ее коагуляцией с помощью хлорида кальция.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что плазматический сгусток имплантируют в область дефекта через артроскопический доступ без дополнительной фиксации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, травматологии, конкретно к способам восстановления дефектов суставной поверхности крупных суставов.

Известен способ восстановления полнослойных дефектов суставной поверхности, в котором предлагается имплантировать в область дефекта культивированные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга в коллагеновом геле под лоскут надкостницы [9]. Костный мозг получают из пунктата подвздошной кости. Мезенхимальные стволовые клетки выделяют из костного мозга, культивируют с получением 10-15 млн клеток, засевают в коллагеновый гель, имплантируют в область полнослойного дефекта суставной поверхности. После этого с поверхности большеберцовой кости берут лоскут надкостницы и подшивают к краям дефекта, прикрывая имплантат.

Данный способ имеет ряд недостатков.

Взаимодействия имплантированных МСК и коллагенового геля способствуют дифференцировке стволовых клеток в направлении соединительной ткани, что приводит к образованию фиброзного регенерата [4, 5]. Прикрытие имплантата лоскутом надкостницы изолирует МСК от синовиальной среды сустава, которая имеет важное значение для их хондрогенной дифференцировки [3, 6]. Технология изготовления имплантата не позволяет создать клеточную массу высокой плотности, что также имеет важное значение для хондрогенной дифференцировки МСК с образованием гиалинового хряща [1, 8]. Все это приводит к образованию регенерата по типу фиброхряща или фиброзной ткани, неполноценного в функциональном отношении, и в итоге, к развитию деформирующего артроза [7, 8]. Имплантация коллагеновой губки под лоскут надкостницы не позволяет применить артроскопические методики и осуществляется посредством артротомического доступа. Это, а также дополнительная операция по забору лоскута надкостницы увеличивает вероятность осложнений и длительность реабилитационного периода.

Задачей настоящего изобретения является оптимизация репаративных процессов в области полнослойных дефектов суставной поверхности за счет формирования органотипического регенерата, снижение травматичности за счет применения малоинвазивных артроскопических технологий, сокращение сроков лечения и периода реабилитации.

Поставленная задача решается за счет того, что в область дефекта имплантируют плазматический сгусток с высокой плотностью мезенхимальных стволовых клеток. Имплантат получают суспендированием 10-15 млн МСК в аутоплазме, предварительно консервированной в растворе Олсвера, и последующей ее коагуляцией с помощью хлорида кальция. Имплантацию осуществляют через артроскопический доступ без дополнительной фиксации.

Техническим результатом является создание нового способа восстановления дефектов суставной поверхности с использованием имплантата с высокой плотностью МСК, что при непосредственном контакте с синовиальной средой сустава способствует дифференцировке имплантированных клеток в хондрогенном направлении и образованию гиалинового суставного хряща [1, 3, 6]. Формирование регенерата по типу гиалинового хряща предотвращает или тормозит развитие дегенеративно-дистрофических изменений в суставе [7, 8]. Высокие вязкоэластичные свойства плазматического сгустка позволяют фиксировать имплантат без дополнительного лоскута надкостницы и использовать артроскопическую технику для имплантации [2], что уменьшает вероятность осложнений и сокращает сроки лечения.

Краткое описание чертежей.

Фигура 1А: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 6 недель после имплантации плазматического сгустка с МСК (здесь и далее: увеличение 40Х, стрелками показаны границы дефекта);

Фигура 1Б: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 12 недель после имплантации плазматического сгустка с МСК;

Фигура 1В: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 24 недели после имплантации плазматического сгустка с МСК;

Фигура 2А: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 6 недель после имплантации плазматического сгустка без клеток;

Фигура 2Б: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 12 недель после имплантации плазматического сгустка без клеток;

Фигура 2В: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 24 недели после имплантации плазматического сгустка без клеток;

Фигура 3А: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 12 недель при спонтанной регенерации (без имплантата);

Фигура 3Б: Микропрепарат регенерационной ткани в области полнослойного дефекта суставной поверхности через 24 недели при спонтанной регенерации (без имплантата).

Способ осуществляют следующим образом. На первом этапе из крыла подвздошной кости получают 20-40 мл костного мозга. Выделение МСК осуществляется посредством адгезии к культуральному пластику. Далее клетки культивируют в течение 14-21 дня с получением 10-15 млн МСК, снимают со дна культуральной посуды, осаждают центрифугированием в течение 12 мин при 1500 об/мин и ресуспендируют в аутоплазме, консервированной в растворе Олсвера. Добавление хлорида кальция приводит к коагуляции плазмы с формированием плазматического сгустка с высокой плотностью МСК. Во время операции после шейвинга краев дефекта имплантат погружают в область дефекта.

Формирование регенерата по типу гиалинового хряща в области дефекта подтверждено в серии экспериментов на 18 кроликах породы Шиншилла. На первом этапе у животных из большеберцовой кости осуществлялся забор костного мозга (КМ). Клетки костного мозга отмывались в среде RPMI-1640 и высаживались в культуральную чашку в среде RPMI-1640 с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки. Смена среды осуществлялась через 2-3 дня в течение 10-15 дней. В итоге получалось 10-15 млн клеток. Клетки снимались с культурального пластика с использованием 0,25% трипсина с 0,5% ЭДТА, отмывались от трипсина и ресуспендировались в 0,1 мл аутоплазмы, консервированной в растворе Олсвера. Добавление хлорида кальция приводило к образованию плазматического сгустка с высокой плотностью клеток.

На втором этапе через медиальный парапателлярный доступ последовательно в обоих коленных суставах формировался дефект 3,5 мм в диаметре и 3-4 мм глубиной (всего в экспериментальной группе 14 суставов). В дефект имплантировался плазматический сгусток с МСК. Операционная рана послойно зашивалась, внешняя иммобилизация не использовалась.

В качестве контроля использовалась имплантация плазматического сгустка без клеток (1-й контроль) - 14 суставов, или дефект оставался без имплантата (2-й контроль) - 8 суставов.

Животные выводились из эксперимента через 6, 12 и 24 недели. Область дефекта осматривалась макроскопически, затем вырезалась и подвергалась гистологическому исследованию с использование окрасок гематоксилинэозином, толлуидиновым синим и по Ван Гизон.

У животных экспериментальной группы на всех сроках наблюдения макроскопически регенерат представлял собой блестящую ткань, плохо различимую на фоне окружающего хряща. Микроскопически регенерация шла с гиалинового суставного хряща (округлая форма клеток, расположение клеток в изогенных группах, накопление сульфатированных протеогликанов, неразличимая при световой микроскопия коллагеновая сеть). Формировалась также субхондральная кость (фиг.А, Б, В).

У животных 1-й контрольной группы макроскопически регенерат на всех сроках наблюдения был хорошо заметен в виде белесоватой мягкой неэластичной ткани. Микроскопически на месте дефекта формировалась соединительная ткань с грубой коллагеновой сетью, небольшим количеством фибробластоподобных клеток. Субхондральная кость формировалась только к 24 неделе наблюдения (фиг.2 А, Б, В).

У животных 2-й контрольной группы (животные выводились только на 12 и 24 неделе) регенерат также был хорошо заметен при макроскопичеком обследовании. Микроскопически определялась преимущественно фиброзная ткань с небольшими включениями гиалиноподобного хряща (фиг.3 А, Б).

Способ позволяет значительно улучшить свойства регенерационной ткани в области дефекта, позволяет использовать малоинвазивные артроскопические технологии.

Список использованной литературы

1. Зирне Р.А., Аршавская Т.В. Динамика ультраструктуры хондррогенной ткани в процессе ее развития: Атлас. - Рига: Зинатне, 1990. - 112 с.

2. Bensaid W., Triffit J.T., Blancht C., Oudina K., Sedel L., Petit H. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation // Biomaterials, 2003. - Vol.24. - P.2497-2502.

3. Chen J., Wang C., Lu S., Wu J., Guo X., Duan C., Dong L., Song Y., Zhang J., Jing D., Wu L., Ding J., Li D. In vitro chondrogenesis of adult bone-marrow-derived autologous mesenchymal stem cells // Cell Tissue Res. - 2005. - Vol.319. - P.429-438.

4. Gigante A., Bevilacqua C., Cappella M., Manzotti S., Greco F. Engineering articular cartilage: influence of the scaffold on cell phenotype and proliferation // Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2003. - Vol.14. - P.713-716.

5. Lynn A.K., Brooks R.A., Bonfield W., Rushton N. Repair of defects in articular joints: prospects for material-based solutions in tissue engineering // J. Bone Joint Surg. - 2004. - Vol.86-B. - N.8. - P.1093-1099.

6. Matsumoto Т., Gargosky S.E., Iwasaki K., Rosenfeld R.G. Identification and characterization of insulin-like growth factor (IGF), IGF-binding proteins (IGFBPs), and IGFBP proteases in human synovial fluid // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1996. - Vol.81. - P.150-155.

7. О Driscoll S. The healing and regeneration of articular cartilage // J. Bone Joint Surg. - 1998. - Vol.80-A. - N.12. - P.1795-1812.

8. Reinholz G.G., Lu L., Saris D.B.F., Yaszemski M.J., O Driscoll S.W. Animal models for cartilage reconstruction // Biomaterials, 2004. - V.25. - P.1511-1521.

9. Wakitani S., Jmoto K., Yamamoto Т., Saito M., Murata N., Yoneda M. Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of cartilage defect in osteoarthritic knees // Osteoarthritis Cartilage. - 2002. - Vol.10. - N.3. - P.199-206.