лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины

Классы МПК:A61K39/385 гаптены или антигены, связанные с носителями
C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии
C07K14/55 ИЛ-2
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ (DE)
Приоритеты:
подача заявки:
2003-01-14
публикация патента:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается лиофилизированной фармацевтической композиции иммуноцитокинов, включающей иммуноцитокин, содержащий в качестве цитокинового компонента интерлейкин-2 (IL-2), сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество, причем фармацевтическая композиция содержит от 0,1 до 25 мг/мл иммуноцитокинов, от 1 до 200 мг/мл сахара/аминосахара, 1-200 ммоль/л аминокислоты и 0,001-1 мас.% поверхностно-активного вещества. Композиция имеет увеличенный срок хранения даже при повышенных температурах и после восстановления может вводиться парентерально в качестве лекарственного средства. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил.

(56) (продолжение):

CLASS="b560m"materials and for the preparation of international reference reagents, Biologicals. 1998; 26(4):331-46.

лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348

Формула изобретения

1. Лиофилизированная фармацевтическая композиция иммуноцитокинов, включающая иммуноцитокин, содержащий в качестве цитокинового компонента интерлейкин-2 (IL-2), сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество, причем она может быть восстановлена в виде водной фармацевтической композиции, содержащей от 0,1 до 25 мг/мл иммуноцитокина, от 1 до 200 мг/мл сахара/аминосахара, 1-200 мМоль/л аминокислоты и 0,001-1 мас.% поверхностно-активного вещества.

2. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что, по существу, состоит из иммуноцитокина, сахара или аминосахара, аминокислоты, буфера и поверхностно-активного вещества.

3. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1 и/или 2, отличающаяся тем, что сахар представляет собой моно-, ди- или трисахарид, предпочтительно сахарозу, лактозу, мальтрозу или трегалозу

4. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1 и/или 2, отличающаяся тем, что аминосахар представляет собой глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин или нейраминовую кислоту.

5. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1 и/или 2, отличающаяся тем, что аминокислота представляет собой основную, кислую или нейтральную аминокислоту, предпочтительно аргинин, лизин или орнитин.

6. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1 и/или 2, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой неионогенное поверхностно-активное вещество.

7. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат или полимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена.

8. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбита или монолаурат полиоксиэтилен(20)сорбита.

9. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1 и/или 2, отличающаяся тем, что дополнительно содержит изотоническое средство в количестве, необходимом для установления изотоничности.

10. Водная фармацевтическая композиция иммуноцитокинов, получаемая при восстановлении лиофилизата по одному или более пп.1-9 с помощью водного растворителя.

11. Водная фармацевтическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что раствор имеет значение рН 5-8, предпочтительно 5,6-7,4.

12. Водная фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что раствор имеет значение рН 6-7.

13. Способ получения лиофилизированной фармацевтической композиции по одному или более пп.1-9, отличающийся тем, что готовят водную композицию, содержащую иммуноцитокин, сахар или аминосахар, аминокислоту, поверхностно-активное вещество и, если это является желательным, дополнительные фармацевтические адъюванты, и после этого раствор подвергают лиофилизации.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к стабильному лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему иммуноцитокины, и к приготовлению лиофилизированного фармацевтического препарата.

Иммуноцитокины представляют собой конъюгаты, состоящие из антител и цитокинов, в которых каждый из карбоксильных концов двух тяжелых цепей иммуноглобулинов антител связан с N-концевыми участками цитокина.

Антитела представляют собой определенные гликопротеины, обладающие защитным действием, которые встречаются в крови, лимфе и выделениях организма в результате иммунизации антигенами и немедленно подвергаются реакции антиген-антитело. Антитела относятся к иммуноглобулинам (Ig) и могут подразделяться на 5 классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из них, в свою очередь, могут подразделяться на дополнительные подклассы (изотипы), например на IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Иммуноцитокины включают все IgG антитела. Они охватывают моноклональные антитела, поликлональные антитела и полиспецифические антитела, такие как, например, биспецифические антитела.

Цитокины представляют собой полипептиды, которые выделяются эндокринно или паракринно, то есть секретируются клетками в кровь или в окружающие ткани и после связывания со специфическими рецепторами оказывают функциональные действия (в большинстве случаев на деление и рост, а также, например, на движение) других клеток. В некоторых случаях цитокин-продуцирующие клетки сами подвергаются такому воздействию (то есть являются аутокринными). Цитокины, в частности, регулируют сложное взаимодействие клеток иммунной системы.

Примерами цитокинов являются лимфокины, монокины и обыкновенные полипетидные гормоны. Цитокины включают гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота, паратгормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропин (TSH) и лютропин (LH), фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов, пролактин, лактоген плаценты, мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид, ингибин, активин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), интегрин, тромопоэтин (ТРО), факторы роста нервных клеток, такие как NGFлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 , фактор роста тромбоцитов, трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGFлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 и TGFлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 , эритропоэтин (ЕРО), интерфероны, такие как IFNлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 , IFNлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 и IFNлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 , гематопоэтические факторы роста, такие как M-CSF, GM-CSF и G-CSF, интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, и факторы некроза опухоли (TNF), такие как TNFлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 , или TNFлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 .

Подобно вышеупомянутым антителам и цитокинам иммуноцитокины являются пептидными активными компонентами и, следовательно, не могут абсорбироваться энтерально. Поэтому для терапевтического применения, как правило, они должны вводиться парентерально в виде раствора.

Одной из проблем технологии приготовления лекарственных средств на основе растворов, содержащих пептидные активные компоненты, является их склонность к агрегации и к образованию белковых мультимеров. Однако эта проблема главным образом зависит от физико-химических свойств конкретных применяемых активных компонентов. Тогда как белки, имеющие гидрофильные свойства, обладают относительно низкой склонностью к образованию агрегатов в водных растворах, белки, имеющие гидрофобные свойства, обладают повышенной склонностью к агрегации.

Антитела состоят из 2-х антипараллельных складчатых структур, которые расположены наподобие "сэндвича" по отношению друг к другу (консервативные домены). Гидрофобные и гидрофильные аминокислоты расположены в складчатых структурах с гидрофобными боковыми цепями двух складчатых структур, которые в каждом случае ориентированы друг к другу и, таким образом, направлены внутрь "сэндвич"-структуры, и гидрофильные аминокислоты в каждом случае направлены наружу (J.Klein, Immunologie [Иммунология], Verlag Chemie, Weinheim, 1991). Гидрофильные аминокислоты, направленные наружно, принимают участие в солюбилизации антител в водном растворе и, таким образом, предотвращают взаимодействие между разными антителами. Следовательно, антитела обладают низким уровнем гидрофобности и склонности к агрегации.

Благодаря вышеописанным свойствам сравнительно просто получать стабильные растворы антител. Одним из примеров коммерчески доступного продукта является Rituxan®, водный препарат, содержащий моноклональное антитело ритуксимаб, неорганический буфер и полисорбат. Удаление воды сушкой вымораживанием дает возможность получить стабильные водные растворы антител, которые уже относительно стабильны per se, и эта стабильность в дальнейшем усиливается. Перед введением полученные лиофилизаты восстанавливают в водные растворы путем прибавления воды. Примером продукта этого типа является Remicade®, который кроме моноклонального антитела инфликсимаба, неорганического буфера и полисорбата дополнительно содержит сахар в качестве средства, защищающего от замерзания, или структрообразователя.

В заявке WO 98/22136 А2 описан лиофилизированный препарат, содержащий антитело, сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество. Несмотря на то что препарат заявлен для антител вообще, только препараты, которые включают моноклональные антитела, направленные против вируса гепатита В (АК HBV), и в каждом случае препарат, содержащий антитело к L-селектину (анти-L-селектин) и антитело к рецептору фактора роста L нервных клеток (анти-L-NGFR), раскрыты в качестве рабочих примеров.

Цитокины не содержат консервативных доменов, которые могут вызывать хорошую растворимость в воде, как это имеет место для антител. Поэтому они обладают повышенной склонностью к агрегации в водном растворе. В особенности это характерно для цитокинов, которые содержат пучок из четырех лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -спиралей в качестве общей структурной особенности (так называемые 4 лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -спиральные пучковые цитокины) и обладают резко выраженной гидрофобностью в связи с такой структурной особенностью. Гидрофобные взаимодействия, которые сопровождают гидрофобность, часто являются, в свою очередь, причиной/механизмом агрегации (Hora-MS и Chen-B, (1999), Bio-pharm. Ind. Perspect., 217-248). Цитокинами, которые содержат пучок из четырех лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -спиралей в качестве общей структурной особенности, являются многие интерлейкины, в частности IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11 и IL-12, интерфероны, в частности IFNлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 и IFNлиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 , гематопоэтические факторы роста, такие как M-CSF, GM-CSF, G-CSF, эритропоэтин (ЕРО) и фактор стволовых клеток (SCF). Цитокинами, которые подробно в литературе описаны как гидрофобные, являются, например, IL-2 (Robb-RJ и др. (1983) PNAS 80:5990-4; US 5580856), IL-4 (Sharma-S и др. (1987) 235:1489-92), IL-5 (Takatsu-K и др. (1985) Л 134:382-9), G-CSF (US 510465).

Такая сильная склонность цитокинов, в особенности цитокинов с пучком из 4-х лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -спиралей, требует особых условий для их стабилизации. Например, продукт Proleukin®, лиофилизат, содержащий активный компонент интерлейкин-2, содержит в качестве адъювантов сахар, неорганический буфер и анионоактивный детергент (лаурилсульфат натрия). Однако анионоактивные детергенты, в особенности если лекарственное средство предназначено для парентерального введения, являются чрезвычайно сомнительными с токсикологической точки зрения.

Дальнейшим примером, который свидетельствует об особых трудностях при стабилизации препаратов, содержащих цитокины, являются продукты, представленные на рынке, которые содержат интерферон лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 (Avonex®, Betaferon®, Rebif®). Все эти продукты стабилизированы альбумином, который также можно отнести к чрезвычайно критическому с токсикологической точки зрения, в частности, в связи с нежелательными иммунными реакциями.

Вследствие вышеописанных отличий между цитокинами и антителами иммуноцитокины, каждый из которых состоит из одного антитела и двух цитокинов, также существенно отличаются физико-химическими свойствами от антител. В частности, иммуноцитокины, содержащие цитокин, который имеет четыре лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -спиральных пучка, обладают сильной склонностью к образованию агломератов в водных растворах, что связано с их резко выраженной гидрофобностью, и трудно поддаются стабилизации.

Объектом настоящего изобретения является получение стабилизированного препарата иммуноцитокинов. Препарат не должен содержать каких-либо токсикологически неприемлемых адъювантов, он должен быть стабильным в течение длительного периода времени в условиях повышенного напряжения, таких как повышенная температура и атмосферная влажность, и должен восстанавливаться с помощью водного растворителя для получения раствора, готового к введению, имеющего высокое содержание активного компонента.

Неожиданно представляется возможным получить препарат, который соответствует этим требованиям, путем сушки вымораживанием водного буферного раствора, который кроме иммуноцитокина содержит сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество. Настоящее изобретение, таким образом, относится к стабильному лиофилизированному препарату, который содержит иммуноцитокин, сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество.

Предпочтительно препарат содержит иммуноцитокин, который в качестве цитокинового компонента содержит цитокины, выбранные из группы, включающей цитокины, которые имеют в качестве общей структурной особенности пучок из 4-х лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -спиралей, в особенности интерлейкин, предпочтительно IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11 и/или IL-12, интерферон, предпочтительно IFNJ3 и/или IFNy, и/или гематопоэтический фактор роста, предпочтительно M-CSF, GM-CSF, G-CSF, ЕРО или SCF. Более предпочтительно композиция содержит иммуноцитокин, содержащий интерлейкин-2 (IL-2).

Препарат в соответствии с изобретением является физиологически хорошо переносимым, может быть легко приготовлен, точно дозирован и является стабильным при исследовании в отношении продуктов распада и агрегатов при длительном хранении и даже после повторяемых процессов замораживания и оттаивания. Он является стабильным при хранении в течение периода от, по крайней мере, трех месяцев до двух лет при хранении при температуре холодильника (2-8°С) и при комнатной температуре (23-27°С, 60%-ной относительной атмосферной влажности (о.в.)). Неожиданно было обнаружено, что препарат в соответствии с изобретением также является стабильным при хранении в течение указанного периода при повышенных температурах и более высокой атмосферной влажности, например при температуре 40°С и 75%-ной относительной влажности.

Лиофилизированный препарат может быть восстановлен простым способом для получения готового к введению раствора, который не содержит частиц, путем прибавления водного растворителя, например воды, для целей инъекции или изотонического водного раствора. Восстановленный раствор является стабильным в течение периода приблизительно 5 дней, но, в частности, его более предпочтительно вводить в течение 24 часов.

Восстановление препарата в соответствии с изобретением с помощью водных растворителей преимущественно позволяет получать препарат содержащих иммуноцитокины растворов, которые имеют значение рН в пределах от 5 до 8, предпочтительно таких, которые имеют значение рН от 5,6 до 7,4, особенно предпочтительно значение рН 6-7, и осмолярность от 250 до 350 мОсмоль/кг. Восстановленный препарат может, таким образом, вводится непосредственно внутривенно, внутриартериально, а также подкожно без существенной боли. Кроме того, препарат может также добавляться к растворам для инфузии, таким как, например, раствор глюкозы, изотонический физиологический раствор или раствор Рингера, которые также могут включать дополнительные активные компоненты, так что позволяет вводить относительно большие количества активного компонента.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения лиофилизированный фармацевтический препарат по существу состоит из иммуноцитокина, сахара или аминосахара, аминокислоты, буфера и поверхностно-активного вещества.

Препарат в соответствии с изобретением позволяет получить препарат растворов иммуноцитокина, который соответствует по своей концентрации клиническим потребностям. Предпочтительными являются растворы иммуноцитокина, которые имеют концентрацию иммуноцитокина от приблизительно 0,1 до 25 мг/мл, более предпочтительно от 1 до 10 мг/мл, наиболее предпочтительно от 1 до 5 мг/мл.

Сахар, который используется в препарате в соответствии с изобретением, может представлять собой моно-, ди-, или трисахариды. Эти сахара могут применяться отдельно или в смеси с сахароспиртами (например, маннитом). Примерами моносахаридов, которые могут быть упомянуты, являются глюкоза, манноза, галактоза, фруктоза и сорбоза, примерами дисахаридов, которые могут быть упомянуты, являются сахароза, лактоза, мальтоза или трегалоза, а примером трисахарида, который может быть упомянут, является рафиноза. Предпочтительными являются сахароза, лактоза, мальтоза или трегалоза, особенно предпочтительными являются сахароза и мальтоза.

Также возможно присутствие аминосахаров, то есть моносахаридов, которые содержат первичную, вторичную или третичную аминогруппу или ацилированную аминогруппу (-NH-CO-R) вместо гидроксильной группы. Для целей настоящего изобретения более предпочтительными являются глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин и нейраминовая кислота.

Сахар/аминосахар присутствует в препарате в соответствии с изобретением в таком количестве, чтобы он присутствовал в растворе, полученном после восстановления с помощью предложенного объема растворителя, в концентрации от приблизительно 1 до 200 мг/мл. Сахар предпочтительно присутствует в восстановленном растворе в концентрации от 15 до 30 мг/мл.

Подходящие аминокислоты, которые используются в соответствии с изобретением, представляют собой основные, кислые или нейтральные аминокислоты, например аргинин, гистидин, орнитин, лизин, глицин, среди прочих. Предпочтительно использовать аминокислоты в виде их неорганических солей (преимущественно в виде солей хлористоводородной кислоты, то есть в виде гидрохлоридов аминокислот). В случае когда используются свободные аминокислоты, желаемое значение рН устанавливают путем добавления приемлемых физиологически переносимых буферных веществ, таких как, например, органическая или неорганическая кислота, такая как лимонная кислота и фосфорная кислота, серная кислота, уксусная кислота, муравьиная кислота, или их соли. Предпочтительными являются цитраты и фосфаты, с которыми получают особенно стабильные лиофилизаты.

Предпочтительными аминокислотами являются аргинин, лизин и орнитин. Кроме того, также является возможным использовать кислые аминокислоты, такие как, например, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота, или нейтральные аминокислоты, такие как, например, изолейцин, лейцин и аланин, или ароматические аминокислоты, такие как, например, фенилаланин, тирозин или триптофан. Содержание аминокислот в препарате в соответствии с изобретением составляет от 1 до 200 ммоль/л, предпочтительно от 40 до 100 ммоль/л, особенно предпочтительно 40-80 ммоль/л (основываясь в каждом случае на восстановленном растворе).

Поверхностно-активными веществами, которые могут использоваться, являются все поверхностно-активные вещества, которые обычно применяются в фармацевтических препаратах, предпочтительно неионогенные поверхностно-активные вещества, в частности полисорбаты и полимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена. Более предпочтительными являются сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот, в частности монолаурат полиоксиэтилен(20)сорбита и моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбита. В соответствии с изобретением препарат включает от 0,001 до 1 мас.%, предпочтительно от 0,005 до 0,5 мас.% и особенно предпочтительно от 0,01 до 0,15 мас.% (основываясь в каждом случае на восстановленном растворе).

Если препарат в соответствии с изобретением включает буферы, то они могут, в принципе, представлять собой любые физиологически переносимые вещества, которые приемлемы для установления желательного значения рН. Количество буферного вещества выбирают таким образом, чтобы после восстановления лиофилизированного препарата, например, с помощью воды для инъекций, полученный водный раствор имел концентрацию буфера от 5 до 50 ммоль/л, предпочтительно от 10 до 20 ммоль/л. Предпочтительными буферами являются цитратные буферы или фосфатные буферы. Приемлемые фосфатные буферы представляют собой растворы солей фосфорной кислоты моно- и/или динатрия и калия, такие как гидрофосфат динатрия или дигидрофосфат калия, а также смеси солей натрия и калия, такие как, например, смеси гидрофосфата динатрия и дигидрофосфата калия.

Если восстановленный раствор уже не является изотоническим вследствие осмотических свойств иммуноцитокина и вследствие применяемых адъювантов для стабилизации, то изотоническое средство, предпочтительно физиологически переносимая соль, такая, как, например, хлорид натрия или хлорид калия, или физиологически переносимый полиол или сахар, такой, как, например, глюкоза, глицерин или маннит, могут также присутствовать в количестве, необходимом для установления изотоничности.

Кроме того, лиофилизаты в соответствии с изобретением могут включать дополнительные физиологически переносимые адъюванты, такие как, например, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, консерванты, такие как фенол, м-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или хлорид бензалкония, или дополнительные стабилизаторы, структурообразователи и растворители, такие как полиэтиленгликоли (PEG), например, PEG 3000, 3350, 4000 или 6000, или циклодекстрины, такие как гидроксипропил-лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -циклодекстрин, сульфобутилэтил-лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -циклодекстрин или лиофилизированный препарат, содержащий иммуноцитокины, патент № 2316348 -циклодекстрин, или декстраны.

Препарат в соответствии с изобретением может быть приготовлен путем получения водного препарата, содержащего иммуноцитокин в качестве активного компонента, и сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество, и, если это является желательным, дополнительные фармацевтические адъюванты, с последующей лиофилизацией раствора.

Водный препарат может быть приготовлен путем прибавления указанных адъювантов к раствору, содержащему иммуноцитокин. С этой целью определенные объемы маточных растворов, содержащих указанные дополнительные адъюванты в определенных концентрациях, преимущественно прибавляют к раствору, имеющему определенную концентрацию иммуноцитокина, как получено из его препарата, и смесь, если это является желательным, разводят до предварительно рассчитанной концентрации водой. Альтернативно адъюванты также могут прибавляться как твердые вещества к исходному раствору, содержащему иммуноцитокин. Если иммуноцитокин находится в виде твердого вещества, например в виде лиофилизата, то препарат в соответствии с изобретением может быть приготовлен сначала растворением соответствующего иммуноцитокина в воде или в водном растворе, содержащем один или более дополнительных адъювантов, с последующим прибавлением необходимых в каждом случае количеств маточных растворов, содержащих дополнительные адъюванты, дополнительных адъювантов в твердой форме и/или воды. Иммуноцитокин также может преимущественно быть растворен непосредственно в растворе, содержащем все дополнительные адъюванты. Один или более адъювантов, которые присутствуют в препарате в соответствии с изобретением, могут преимущественно быть уже прибавленными во время или в конце процесса приготовления препарата частного иммуноцитокина. Это предпочтительно осуществляют на заключительной стадии очистки, которую осуществляют после его получения путем растворения иммуноцитокина непосредственно в водном растворе, содержащем один, несколько или все дополнительные адъюванты, или повторного забуферивания путем подходящих методов, таких как фильтрация в тангенциальном потоке. Для того чтобы получить препарат, соответствующий(ие) дополнительный(ые) компонент(ы), который(ые) необходим(ы), прибавляют в меньшем количестве в каждом случае и/или не прибавляют вообще. Особенно предпочтительно для соответствующего компонента растворять его непосредственно в водном растворе, который содержит все дополнительные адъюванты, на конечном этапе очистки, которую выполняют после его приготовления, непосредственно получая раствор, который подвергают лиофилизации.

Значение рН раствора, содержащего соответствующий иммуноцитокин и адъюванты, устанавливают на уровне от 5 до 8, стерилизуют фильтрацией и сушат вымораживанием.

Полученный лиофилизированный препарат может быть восстановлен путем прибавления водного растворителя, получая водный препарат, который непосредственно может вводиться, в частности, парентерально. Настоящее изобретение, кроме того, также относится к водному фармацевтическому препарату иммуноцитокинов, который получен путем восстановления лиофилизата в соответствии с изобретением водным растворителем.

Восстановленный водный фармацевтический препарат предпочтительно имеет рН в интервале 5-8, более предпочтительно рН 5,6-7,4 и наиболее предпочтительно рН 6,0-7,0.

Примеры объясняют изобретение, не ограничивая его.

Пример 1 (партия 8020)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

0,7 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

1,5 мас.% сахарозы

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80).

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

5 мг/мл EMD 273066

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

NaOH q.s. до рН 7,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

1,744 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

NaOH q.s. до рН 7,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 100 мл раствора А и 614 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл каждый наполняли 4 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 2 (партия 8021)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

0,7 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

1,5 мас.% мальтозы

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80).

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

5 мг/мл EMD 273066

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

NaOH q.s. до рН 7,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

1,744 мас.% мальтозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

NaOH q.s. до рН 7,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 100 мл раствора А и 614 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл каждый наполняли 4 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 3 (партия 8431)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

1 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

1,5 мас.% сахарозы

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80).

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

1,45 мг/мл EMD 273066

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

NaOH q.s. до рН 7,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

287 ммоль/л аргинина HCl

0,0283 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Tween 80)

NaOH q.s. до рН 7,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 46,9 мл раствора А и 25,1 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл каждый наполняли 2 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 4 (партия 8591)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

4 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

12,5 ммоль/л лимонной кислоты

80 ммоль/л аргинина HCl

1,8 мас.% сахарозы

0,008 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80).

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

5 мг/мл EMD 273066

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

NaOH q.s. до рН 6,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

8,7 мас.% сахарозы

41 ммоль/л лимонной кислоты

NaOH q.s. до рН 6,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 4 мл раствора А и 15,5 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 2 мл каждый наполняли 1 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 5 (сравнительный препарат 1 с маннитом вместо сахарозы, партия 8008)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

0,7 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

4 мас.% маннита

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

до рН 7,0 при помощи NaOH.

Препарат получали непосредственно сушкой вымораживанием раствора активного компонента, имеющего вышеприведенный состав.

Полученный раствор фильтровали, используя стерильный фильтр, перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл наполняли 4 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 6 (сравнительный пример 2, партия 8434, соответствует составу с партии 8431 без добавления аргинина)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

1 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

1,5 мас.% сахарозы

0,01 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80).

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

1,45 мг/мл EMD 273066

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

NaOH q.s. до рН 7,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

0,0283 мас.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита (Твин 80)

NaOH q.s. до рН 7,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением, 46,9 мл раствора А и 25,1 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл каждый наполняли 2 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 7 (сравнительный препарат 3, партия 8430, соответствует составу с партии 8431 без добавления Твин 80)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

1 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

100 ммоль/л аргинина HCl

1,5 мас.% сахарозы.

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

1,45 мг/мл EMD 273066

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

NaOH q.s. до рН 7,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

287 ммоль/л аргинина HCl

NaOH q.s. до рН 7,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 46,9 мл раствора А и 25,1 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл каждый наполняли 2 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Пример 8 (сравнительный препарат 4, партия 8429, соответствует составу с партии 8431 без добавления Твин 80 и без добавления аргинина)

Лиофилизат из водного раствора, содержащего:

1 мг/мл EMD 273066 (huKS-IL2)

5 ммоль/л лимонной кислоты

1,5 мас.% сахарозы.

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие адъюванты в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного компонента), содержащий:

1,45 мг/мл EMD 273066

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

NaOH q.s. до рН 7,0.

Раствор В (раствор адъюванта):

1,5 мас.% сахарозы

5 ммоль/л лимонной кислоты

NaOH q.s. до рН 7,0.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 46,9 мл раствора А и 25,1 мл раствора В объединяли друг с другом.

Приготовленный раствор стерилизовали фильтрацией перед упаковкой. Флаконы вместимостью 6 мл каждый наполняли 2 мл раствора. Затем флаконы предварительно герметизировали при помощи пробок и лиофилизировали. После сушки вымораживанием флаконы герметически запечатывали.

Исследования стабильности препаратов

Стабильность препаратов в соответствии с изобретением исследовали в испытаниях на стабильность. Для этого приготовленные лиофилизаты определенное время хранили при разных температурах и исследовали, используя подходящие аналитические методы. Климатические условия - температура 40°С и относительная атмосферная влажность (о.в.) 75% были выбраны в качестве условий напряжения для быстрого достижения отличий в стабильности для разных препаратов. Возможная нестабильность препаратов иммуноцитокинов проявлялась, главным образом, в образовании агрегатов и в образовании продуктов распада. Продукты распада и растворимые агрегаты предпочтительно определяли путем вытеснительной хроматографии на основе размеров (HPLC-SEC), тогда как визуальное наблюдение и измерение мутности использовали для определения видимых агрегатов. Подобно этому тест ELISA, используемый для оценки препаратов, служил для проверки целостности и способности связываться с рецептором. Вместе с УФ-фотометрией при длине волны 280 нм он дополнительно применялся для определения содержания веществ.

Аналитические методы исследования:

Внешний вид

Приготовленные препараты визуально исследовали для определения наличия люминесцирующих частичек и проявления возможной мутности.

Концентрация белка: A 280 нм

Абсорбцию полученных белковых растворов при длине волны 280 нм применяли для определения концентрации приготовленных препаратов. Коэффициент экстинкции 1,41 для активного компонента huKS-IL2 (EMD 273066) определяли путем количественного аминокислотного анализа. Для его определения белковые растворы разводили в трех повторах до тех пор, пока абсорбция исследуемых растворов не находилась в диапазоне между 0,1 и 1,0 (что соответствует концентрации белка 0,5 мг/мл) единиц абсорбции. Абсорбцию исследуемых растворов, содержащих активный компонент, измеряли относительно соответствующего сравнительного раствора, который не содержит активного компонента.

Чистота: вытеснительная хроматография на основе размеров, SEC-HPLC

Вытеснительная хроматография на основе размеров (SEC) является аналитическим методом, при помощи которого можно определить чистоту и соотношение мономер/агрегат приготовленных препаратов. Компоненты исследуемых растворов разделяли на основании размеров их молекул при помощи колонки HPLC со специальными размерами пор. Относительно большие молекулы элюировались вместе с вытеснительным объемом, тогда как относительно небольшие молекулы проходили сквозь поры неподвижной фазы по-разному в зависимости от размеров и поэтому удерживались более или менее прочно. Относительно небольшие молекулы, такие как продукты распада huKS-IL2, следовательно, имели большее время удержания, чем huKS-IL2 мономеры, и в особенности, чем агрегаты huKS-IL2, которые первыми элюировались с колонки.

Концентрация и целостность молекул активного компонента: KSA-ELISA

В этом аналитическом методе (ELISA, твердофазный иммуноферментный анализ), микротитровальные планшеты покрывали специфическим антигеном для huKS-IL2 (ЕРСАМ или KSA антиген). Молекулы huKS-IL2 в исследуемом растворе определяли посредством связывания с антигеном их составной части-антитела и, таким образом, связывания с микротитровальным планшетом. После добавления биотинилированной анти-IL2 антисыворотки, анти-IL2 антитела взаимодействовали с IL2 частями связанных молекул huKS-IL2. Избыток анти-IL2 молекул удаляли путем промывания микротитровального планшета. Добавленный конъюгат стрептавидин-пероксидазы связывался при помощи биотина и окислял лейко-форму тетраметилбензидинового красителя (ТМВ), добавленного на последующей стадии, вызывая окрашивание в синий цвет. Окислительную реакцию останавливали через определенный промежуток времени путем прибавления фосфорной кислоты. Наблюдается окрашивание раствора в желтый цвет, которое количественно можно измерить при длине волны 450 нм. Концентрация белка в исследуемых растворах при этом пропорциональна абсорбции, определенной при этой длине волны.

Результаты:

Результаты, представленные в таблицах 1 и 2 (партии 8020 и 8021) ясно подтверждают качество и стабильность приготовленных препаратов. Климатические условия - температура 40°С и относительная атмосферная влажность (о.в.) 75% были выбраны в качестве условий напряжения для быстрого достижения отличий в стабильности для разных препаратов. Неожиданно вышеописанные препараты являлись стабильными даже при повышенных температурах хранения и повышенной относительной атмосферной влажности (40°С/75% о.в.) в течение периода больше 6 месяцев.

Соответствующий сравнительный препарат 1 (Таблица 3, партия 8008, пример 5), в котором сахароспирт маннит применялся в качестве структурообразователя вместо дисахаридов (сахарозы или мальтозы), уже через 4 недели хранения в соответствующих условиях напряжения образовывал агрегаты. После хранения в течение 26 недель при комнатной температуре (25°С, 60% о.в.) также возникали видимые агрегаты в соответствующих климатических условиях. Таким образом, сравнительный препарат 1 может храниться только при охлаждении в отличие от препарата в соответствии с изобретением.

Препарат из примера 4 (партия 8591) является дополнительным примером отличной стабильности препарата в соответствии с изобретением и также свидетельствует о том, что препарат также может применяться при повышенных концентрациях белка (см. таблицу 4). Этот препарат хранили при температуре 40°С (75% о.в.) в течение 14 недель.

В дальнейших экспериментах исследовали, все ли адъюванты в препаратах в соответствии с изобретением действительно необходимы для стабилизации. Экспериментальная партия 8431 содержала все компоненты препарата в соответствии с изобретением, тогда как в сравнительных препаратах отсутствовали отдельные компоненты:

- препарат в соответствии с примером 3 (партия 8431): содержит все компоненты;

- сравнительный препарат 2 (пример 6, партия 8434): не содержит аргинина;

- сравнительный препарат 3 (пример 7, партия 8430): не содержит Твин 80;

- сравнительный препарат 4 (пример 8, партия 8429): не содержит Твин 80 и аргинина.

Результаты, приведенные на фигуре 1, несомненно подтверждают, что добавление аминокислоты существенно необходимо для стабильности препарата в соответствии с изобретением. В соответствии с этой фигурой хотя добавление Твин 80 не выглядит необходимым, это не совсем соответствует действительности. Твин 80 добавляется как изначально, так и при очистке белка при приготовления растворов активных компонентов, для предотвращения образования, в частности, видимых агрегатов. Применяемая при этом концентрация Твин 80 является выше критической мицеллярной концентрации (КМК для Твин 80 составляет 0,001%). Экспериментально предпринимались попытки удалить как аргинин, так и Твин путем так называемого способа фильтрации в тангенциальном потоке. При этом буферный обмен осуществляли путем диафильтрации через мембрану 50 кДа. Однако мицеллы Твин 80 в некоторых случаях превосходят предел вытеснения мембраны и, таким образом, не могут быть полностью удалены.

Добавление Твин 80 к препарату в соответствии с изобретением существенно необходимо для повторного растворения лиофилизатов и для стабильности раствора, полученного после восстановления, что подтверждается дальнейшими исследованиями. Исходя из раствора активного компонента EMD 273066 (huKS-IL2), содержащего Твин 80, адъювант Твин 80 отделяли путем аффинной хроматографии при помощи белковой колонки А. Твин 80 добавляли в повышенных количествах к полученному раствору, не содержащему Твин 80. Полученные препараты подвергали напряжению в течение периода 21 день при температуре 25°С во флаконах вместимостью 2 мл при помощи лабораторного шейкера. Препараты, подвергнутые напряжению, ежедневно анализировали визуально и фотометрически для определения в них концентрации белка. Результаты этого исследования приведены на фигуре 2. Для препаратов без добавления Твин 80 наблюдается небольшая мутность уже через один день, которая со временем заметно усиливается при визуальном наблюдении. Через 21 день в нем также наблюдается значительное понижение содержания белка, как показано на фигуре.

Таблица 1

Стабильность препарата 8020 в соответствии с примером 1
Пример 1 
Время хранения (недели)Определение белка HPLC-SECKSA-ELISA Внешний вид лиофилизата после растворения в 4,0 мл бидист. водыМутность, определенная путем фотометрии А550
[недели] [мг/мл][%] [мг/мл]растворенный  
Исходный раствор 0,79896,830,870 -0,0036
Лиофилизат после получ.0,849 96,680,857прозрачный р-р, слегка опалесцирующий0,0033
ЗАМОРАЖИВАНИЕ

Хранение при -20°С
4 -96,72- Прозрачный бесцветный раствор0,0019
8- 96,89-- -
13- 97,02- Прозрачный бесцветный раствор-
260,808 97,380,685Прозрачный бесцветный раствор0,0021
ХОЛОДИЛЬНИК

Хранение при 2-8°С
4-96,70 -Прозрачный бесцветный раствор 0,0015
8- 97,01- --
13 -97,01 -Прозрачный бесцветный раствор -
260,806 97,250,735 Прозрачный бесцветный раствор0,0011
Хранение при 25°С/60% о.в.
4- 96,66- Прозрачный бесцветный раствор0,0011
8- 97,060,757- -
13- 96,93- Прозрачный бесцветный раствор-
260,809 97,230,720Прозрачный бесцветный раствор0,0017
Хранение при 40°С/75% о.в.
4-96,62 -прозрачный бесцветный раствор 0,0013
8- 97,000,827 --
13 -96,99 -прозрачный бесцветный раствор -
260,816 97,190,775 Прозрачный бесцветный раствор0,0007

Таблица 2

Стабильность препарата 8021 в соответствии с примером 2
Пример 2 
Время хранения (недели)Определение белка HPLC-SECKSA-ELISA Внешний вид лиофилизата после растворения в 4,0 мл бидист. ВодыМутность, определенная путем фотометрии А550
[недели] [мг/мл][%] [мг/мл]Растворенный  
Исходный раствор 0,81096,870,865 -0,0042
Лиофилизат после получ.0,868 96,700,817Прозрачный раствор0,0034
ЗАМОРАЖИВАНИЕ

Хранение при -20°С
4-97,12 -Прозрачный бесцветный раствор 0,0013
8- 97,19- --
13 -97,11 -Прозрачный бесцветный раствор -
26- -- --
ХОЛОДИЛЬНИК

Хранение при 2-8°С
4-97,27 -Прозрачный бесцветный раствор 0,0018
8- 97,07- --
13 -97,07 -Прозрачный бесцветный раствор -
26- -- --
Хранение при 25°С/60% о.в.
4-97,27 -Прозрачный бесцветный раствор 0,0015
8- 97,140,753 --
13 -96,96 -прозрачный бесцветный раствор -
26- -- --
Хранение при 40°С/75% о.в.
4-97,17 -прозрачный бесцветный раствор 0,0013
8- 97,210,820 --
13 -96,91 -прозрачный бесцветный раствор -
26      -

Таблица 3

Стабильность сравнительного препарата 1 (партия 8008 в соответствии с примером 5)
Партия: 008008  
Время хранения (недели)Определение белка HPLC-SECKSA-ELISA Внешний вид лиофилизата после растворения в 4,0 мл бидист. ВодыМутность, определенная путем фотометрии А550
[недели] [мг/мл][%] [мг/мл]Растворенный  
Лиофилизат после получ. 0,76394,79 0,667прозрачный раствор 0,0033
ЗАМОРАЖИВАНИЕ

Хранение при -20°С
4 -- ---
8- --- -
21- 96,63- прозрачный бесцветный раствор0,0035
260,766 96,16-прозрачный бесцветный раствор0,0040
Холодильник

Хранение при 2-8°С
4-- -прозрачный бесцветный раствор -
8- -- --
21 -96,42 -прозрачный бесцветный раствор 0,0037
26 0,80695,74- прозрачный бесцветный раствор0,0043
Хранение при 25°С/60% о.в.
4- -- прозрачный бесцветный раствор-
8  --прозрачный бесцветный раствор-
21-91,34 -Слегка опалесц. прозрачный р-р 0,0064
26 -81,33- Слегка мутный белесоватый раствор0,0209
Хранение при 40°С/75% о.в.
4- -- Мутный раствор-
8-- -Мутный раствор-
13- --Мутный раствор -
26 --- Мутный раствор-

Таблица 4

Стабильность препарата в соответствии с примером 4 (партия 8591)
Пример 4 
Время хранения (недели)Определение белка HPLC-SECKSA-ELISA Внешний вид лиофилизата после растворения в 4,0 мл бидист. водыМутность, определенная путем фотометрии А550
[недели] [мг/мл][%] [мг/мл]растворенный  
Лиофилизат после получ. 0,84996,14 -прозрачный бесцветный раствор -
Хранение при 40°С/75% о.в.
14- 94,424.13 прозрачный бесцветный раствор-

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2316348

patent-2316348.pdf

Класс A61K39/385 гаптены или антигены, связанные с носителями

синтетический иммуноген для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ -  патент 2526807 (27.08.2014)
инъекционный препарат для повышения спермопродукции человека и способ его применения -  патент 2526571 (27.08.2014)
антигенные tau-пептиды и их применения -  патент 2518291 (10.06.2014)
композиции, включающие антигены neisseria meningitidis из серогрупп в и с, и дополнительный антиген -  патент 2508122 (27.02.2014)
инъекционный препарат для повышения спермопродукции у производителей сельскохозяйственных животных и петухов и способ его применения -  патент 2493873 (27.09.2013)
никотиновые иммунонанотерапевтические лекарственные средства -  патент 2487712 (20.07.2013)
мультивалентная композиция на основе конъюгата пневмокковый полисахарид-белок -  патент 2484846 (20.06.2013)
препарат вакцины на основе конъюгата никотин-носитель -  патент 2465007 (27.10.2012)
сахарид-конъюгатные вакцины -  патент 2454244 (27.06.2012)
композиции вакцин, содержащие наборы антигенов в виде амилоида бета 1-6 -  патент 2450827 (20.05.2012)

Класс C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии

дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона -  патент 2528858 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
искусственный ген mel-tci-a0201, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген mel-tci-a0201, рекомбинантная плазмидная днк pmel-tci-a0201, обеспечивающая экспрессию искусственного гена mel-tci-a0201 и искусственный белок-иммуноген mel-tci-a0201, содержащий множественные ctl- и th-эпитопы антигенов меланомы -  патент 2522830 (20.07.2014)
рекомбинантная днк, кодирующая гибридный белок эпидермального фактора роста человека слитого последовательностью глутатион-s-трансферазы (gst-hegf) и рекомбинантная плазмида pas007, обеспечивающая синтез gst-hegf в клетках escherichia coli -  патент 2521515 (27.06.2014)
рекомбинантная плазмидная днк pg1-rm7, обеспечивающая синтез гибридного белка g1-rm7, и гибридный белок, связывающий фактор некроза опухолей и обладающий биолюминесцентной активностью -  патент 2513686 (20.04.2014)
мутеины кислотной зоны внеклеточного домена рецептора фактора роста фибробластов -  патент 2509774 (20.03.2014)
способы скрининга с применением g-белок сопряженных рецепторов и родственных композиций -  патент 2506274 (10.02.2014)
способ синтеза белка с модифицированным профилем n-гликозилирования в растениях -  патент 2499053 (20.11.2013)
полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный белок пертактин, вектор, включающий такую последовательность, и вакцинные композиции, содержащие белок пертактина или вектор -  патент 2499046 (20.11.2013)

Класс C07K14/55 ИЛ-2

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)
Наверх