штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы

Классы МПК:C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
C12N9/62 из Aspergillus
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2006-07-04
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии, касается штамма Aspergillus oryzae 12, обеспечивающего высокий уровень синтеза кислых протеаз и ксиланазы. Штамм получен путем многоступенчатой селекции штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) с использованием эффективных методов мутагенеза. Штамм депонирован в коллекции ВКПМ под №F-932. Изобретение обеспечивает получение ферментативного комплекса с высокой протеолитической и ксиланолитической активностью в культуральной жидкости, уровень которых превышает аналог в 2,5-2,8 раза. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению нового штамма Aspergillus oryzae 12 - продуцента комплекса кислых протеаз и ксиланаз с высокой общей активностью в культуральной жидкости. Штамм получен из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза комплекса кислых протеаз и ксиланазы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения комплекса ферментов, - кислых и слабокислых протеаз, ксиланазы. Протеолитические и ксиланолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, пивоваренной, винодельческой, кормовой и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое сельскохозяйственное сырье содержит высокомолекулярные белковые полимеры и растительные волокна. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов кислых и слабокислых протеаз и ксиланаз связано с интенсификацией биотехнологических процессов в бродильных отраслях при производстве спирта, пива, с обработкой растительного сырья с высоким содержанием белковых веществ и ксиланов при производстве кормов и в др. областях АПК. В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения кислых протеаз и ксиланаз актуальна.

Известны штаммы - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 824-32 (1, 2), при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы. Недостатком этих продуцентов является их низкая продуктивность по протеазам и отсутствие биосинтетической способности по отношению к ксиланазе.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387, регистрационный номер ВКПМ F-683 (3), один из наиболее активных продуцентов протеаз. В глубинной культуре известного штамма Asp.oryzae 387 на 42 часа роста протеолитическая активность достигает 8,7-11,8 ед. ПС/см3 в зависимости от состава питательной среды; кроме того, синтезируется ксиланаза с активностью 3,4-4,3 ед. КС/см3.

Недостатком этого штамма является низкий уровень протеолитической и ксиланолитической активности культуральной жидкости (к.ж.).

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН, а также к синтезу ксиланазы.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в получении ферментативного комплекса с высокой протеолитической и ксиланолитической активностью в культуральной жидкости, уровень которых превышает аналог в 2,5-2,8 раза.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (4), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах и активному синтезу внеклеточных протеаз и ксиланазы.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae 12 получен путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза, депонирован в ВКПМ под №F-932.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов был получен штамм Aspergillus oryzae 12 - продуцент кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы, а также сопутствующего фермента - штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы, патент № 2315097 -амилазы.

Изучали уровни продукции протеаз и ксиланазы в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известных штаммов в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина при оптимальных условиях действия протеаз, ксиланазную - по Шомоди-Нельсона, амилолитическую - по ГОСТ 20264.4-89. Сравнительные показатели уровней протеолитических активностей культуральной жидкости штамма Asp. oryzae 12 с прототипами представлены в табл.1 и 2.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 12, обладающий высоким уровнем синтеза протеаз и ксиланазы, а также штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы, патент № 2315097 -амилазы, что позволяет повысить технологичность процесса получения комплекса ферментов кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы с высоким уровнем их активности в культуральной жидкости. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косаках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 12 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 60×65 мм, поверхность колонии шероховатая с концентрическими окружностями, профиль колонии плоский, форма колонии неправильная, края волнистые, цвет - зеленый, края светло-желтые, с возрастом цвет колонии темнеет. Цвет с обратной стороны - серый.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 25×25 мм, цвет колонии оливковый, форма колоний округлая, края ровные, светло-желтые.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба септированный, разветвленный, со вздутиями, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 3-5 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-34°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0. Продуцент растет на средах с содержанием сухих веществ от 0,5 до 18%.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 12 использовали для получения кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы, а также сопутствующего фермента - штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы, патент № 2315097 -амилазы.

При глубинном культивировании штамма Aspergillus oryzae 12 в зависимости от состава питательной среды протеолитическая активность составляет 21,0-24,6 ед. ПС/см3 , ксиланолитическая - 7,5-9,8 ед. КС/см3 , амилолитическая - 13,5-14,4 ед. АС/см3 .

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН2PO4 - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 1), рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 50 см 3, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 21,2 ед. ПС/см3, ксиланазы - 9,5 ед. КС/ см3, штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы, патент № 2315097 -амилазы - 13,5 ед. АС/см3.

Пример №2. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; Д-ксилоза - 0,5; КН2PO 4 - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 2), рН - естественный. Культивирование проводят, как указано в примере 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 23,0 ед. ПС/см 3, ксиланазы - 10,8 ед. КС/см3, штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы, патент № 2315097 -амилазы - 13,0 ед. АС/см3.

Пример №3. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; ксилан - 0,1; КН2PO 4 - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 3), рН - естественный. Культивирование проводят, как указано в примере 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 24,6 ед. ПС/см 3, ксиланазы - 11,8 ед. КС/см3, штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы, патент № 2315097 -амилазы - 14,4 ед. АС/см3.

Таблица 1

Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеаз
Штамм Длительность культивирования, чФерментативная активность, ед./см 3
ПС КСAC
251-9072 5,00 8,7
387 4211,8 4,010,8
1238 24,210,2 13,6
Таблица 2

Влияние питательных сред на ферментативную активность гриба Aspergillus oryzae шт.387 и шт.12
Штамм№ питательной средыФерментативная активность
ПС КСAC
ед./см3 % увеличенияед./см 3% увеличения ед./см3% увеличения
387 18,7- 3,4- 12,5-
  29,8 -3,8- 12,3-
 3 9,6- 4,4-13,2 -
12 121,2143 9,5179 13,58
  223,0 14510,8 18413,0 6
  324,6156 11,8168 14,49

Источники литературы

1. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М.: 1971.

2. А.С. СССР №1440922, кл. С12N 1/14, 1988.

3. Патент РФ 2208633, кл. 12 N 1/20, 2001.

4. Патент РФ 2070921, кл. 12 N 1/14, 1993.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм гриба Aspergillus oryzae 12, ВКПМ F-932 - продуцент кислых протеаз и ксиланазы.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2315097

patent-2315097.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/14:
ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai -  патент 2528065 (10.09.2014)
ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля -  патент 2527899 (10.09.2014)
питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала -  патент 2527074 (27.08.2014)
способ восстановления чувствительного слоя биосенсора -  патент 2524438 (27.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной альфа-амилазы -  патент 2514224 (27.04.2014)
штамм fusarium sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы -  патент 2511427 (10.04.2014)
способ получения грибной белковой биомассы -  патент 2511041 (10.04.2014)
мутантный штамм glarea lozoyensis и его применение -  патент 2507252 (20.02.2014)
способ обнаружения микроскопических грибов рода coccidioides poasadasii 36 s и coccidioides immitis c-5 -  патент 2503715 (10.01.2014)

Класс C12N9/62 из Aspergillus

Патенты РФ в классе C12N9/62:
питательная добавка для среды спиртового брожения -  патент 2495926 (20.10.2013)
способ получения протеиназы - активатора протеина с плазмы крови -  патент 2468081 (27.11.2012)
штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека -  патент 2461616 (20.09.2012)
штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека -  патент 2461615 (20.09.2012)
штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека -  патент 2461614 (20.09.2012)
штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека -  патент 2460772 (10.09.2012)
пищевой продукт, содержащий специфичную к пролину протеазу, способ его производства и его применение для расщепления токсичных или аллергенных пептидов глютена -  патент 2446210 (27.03.2012)
полипептиды, обладающие протеазной активностью, и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды -  патент 2318018 (27.02.2008)
штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых и слабокислых протеаз -  патент 2315098 (20.01.2008)
новые гены, кодирующие новые протеолитические ферменты -  патент 2296160 (27.03.2007)


Наверх