способ определения антибиотикочувствительности аэробов

Формула изобретения

Способ определения антибиотикочувствительности аэробов, характеризующийся тем, что определяют уровень светимости пробы с клиническим материалом в объеме 0,5 мл и 2 мл забуференного раствора с растворенным в нем люминолом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к микробиологии - экспресс-метод определения антибиотикочувствительности аэробов позволит в клинике более точно и в более ранние сроки назначать соответствующую антибиотикотерапию.

Известен способ определения антибиотикочувствительности аэробов методом серийных разведений, основанным на прямом определении минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата. Для определения минимальной подавляющей концентрации антибактериальный препарат вносят в питательную среду, которую потом засевают чистой культурой (чистую культуру из клинического материала выделяют на протяжении 5-7 дней) исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста. (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические рекомендации МУК 4.2.1890-04. 2004).

Недостатками данного способа определения антибиотикочувствительности аэробов являются: длительность исследования, обусловленная необходимостью постановки пробы только на чистой культуре (чистую культуру из клинического материала выделяют на протяжении 5-7 дней); необходимость использования субстанций антибиотиков с известным уровнем активности, строгого соблюдения режимов хранения, тщательного выполнения контроля качества питательных сред, трудоемкости приготовления рабочих растворов антибиотиков.

Известен способ определения антибиотикочувствительности аэробов диффузионным методом (диско-диффузионный и Е-тест), основанным на диффузии антибактериального препарата из носителя в питательную среду (период инкубации 18-24 ч) и на подавлении роста исследуемой чистой культуры (чистую культуру из клинического материала выделяют на протяжении 5-7 дней) в той зоне, где концентрация антибактериального препарата превышает минимальную подавляющую концентрацию. В диско-диффузионном методе в качестве носителя антибактериального препарата используют бумажный диск. Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5×6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций антибактериального препарата (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация антибактериального препарата, диффундирующего из носителя, выше минимальной подавляющей концентрации. (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические рекомендации МУК 4.2.1890-04. 2004).

Недостатками данного способа определения антибиотикочувствительности аэробов являются: длительность исследования, обусловленная необходимостью постановки пробы только на чистой культуре (чистую культуру из клинического материала выделяют на протяжении 5-7 дней) и инкубацией самой пробы (18-24 ч); результатом диско-диффузионного метода является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный); используемые концентрации антибактериального препарата на носителях часто не совпадают с терапевтическими концентрациями.

Известен способ исследования уровня хемилюминесценции (ХЛ) крови. Регистрацию ХЛ цельной крови, усиленную люминолом, осуществляют аппаратом «Хемилюминомер-003» с компьютерным обеспечением и выводом хемилюминограмм на принтер по методу Фархутдинова P.P. и соавт. (Фархутдинов P.P. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. / P.P. Фархутдинов, В.А. Лиховских // Уфа, 1998. - 90 с.): к 2 мл забуференного раствора (20 мМ КН₂РО₄, 105 мМ KCl на 1 л дистиллированной воды, рН 7,5 ед.) с растворенным в нем люминолом (0,1×10^-5 М) добавляют 0,1 мл крови. Кювету помещают в камеру прибора, где поддерживают постоянную температуру 37°С и регистрируют запись в течение 10 мин. Режим работы хемилюминомера: термостат - включен, мешалка - выключена, время измерения - 10 мин. Затем пробу инкубируют 60 мин при 37°С в стеклянном стаканчике, к поверхности которого происходит адгезия лейкоцитов и активация внутриклеточного метаболизма. После инкубации запись свечения осуществляют также в течение 10 мин. Таким образом, изучают спонтанную и индуцированную светимость лейкоцитов. Подсчитывают светосумму свечения (СС, у.е.×мин) и максимальную светимость (МС, у.е.), по уровню которых можно судить о фагоцитарной активности лейкоцитов крови.

Задачей изобретения является создание способа определения антибиотикочувствительности аэробов.

Поставленная задача решается тем, что в методе определения антибиотикочувствительности аэробов используют клинический материал, который в объеме 0,5 мл добавляют к 2 мл забуференного раствора (20 мМ КН₂PO₄ , 105 мМ KCl на 1 л дистиллированной воды, рН 7,5 ед.) с растворенным в нем люминолом (0,1×10^-5 М). Кювету помещают в камеру прибора, где поддерживают постоянную температуру 37°С. Антибактериальный препарат вносят в пробу (в концентрации, сопоставимой с пределами терапевтической концентрации данного препарата) непосредственно перед определением хемилюминесценции. Регистрацию хемилюминесценции пробы, усиленной люминолом, осуществляют аппаратом «Хемилюминомер-003» с компьютерным обеспечением. Режим работы хемилюминомера: термостат - включен, мешалка - выключена, время измерения - 5 мин. При этом изменение значения светосуммы хемилюминесценции происходит пропорционально уровню чувствительности исследуемой культуры. Светосумму свечения (СС, у.е.×мин) и максимальную светимость (МС, у.е.) подсчитывают по методу Фархутдинова P.P. и соавт. (Фархутдинов P.P. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. / P.P. Фархутдинов, В.А. Лиховских // Уфа, 1998. - 90 с.). Предлагаемый нами метод определения антибиотикочувствительности аэробов лишен главных недостатков, которые встречаются во всех изученных нами методах: необходимости выделения чистой культуры и отсутствия сопоставления используемой концентрации антибактериального препарата с терапевтической концентрацией.

Методы, приведенные выше, имеют определенные недостатки и ограничения, которые, по нашему мнению, преодолены в предлагаемом нами методе. Последний позволяет определить антибиотикочувствительность микроорганизмов за достаточно короткий промежуток времени (чувствительность микроорганизма к 12 антибактериальным препаратам за 1 ч), оценить, какую концентрацию необходимо достичь в очаге инфекции для эффективного бактерицидного действия антибактериального препарата.

ПРИМЕР. Предлагаемым методом произведено определение антибиотикочувствительности микроорганизмов 20 клинических материалов (10 - Klebsiella pneumoniae и 10 - Mykoplasma hominis). Контроль полученных результатов проводили с помощью общепринятых методов определения антибиотикочуствительности. Определяли чувствительность к следующим антибактериальным препаратам: бензилпенициллин, гентамицин, стрептомицин, доксициклин, тетрациклин и др. Результаты также сравнивали со значениями светосуммы хемилюминесценции, усиленной люминолом, только клинического материала (без антибактериального препарата) и уровнем хемилюминесценции пробы с заведомо нечувствительным антибиотиком. Полученные результаты исследования были сопоставимы с результатами, полученными при определении антибактериальной чувствительности стандартными общепринятыми методами.

Результаты проведенных исследований дают основание заключить, что предложенный метод позволяет определять антибиотикочувствительность аэробов в течение короткого времени (чувствительность микроорганизма к 12 антибактериальным препаратам определяется за 1 ч) и сопоставлять ее с терапевтическими концентрациями конкретного антибактериального препарата, что, в свою очередь, позволит проводить более адекватную антибактериальную терапию в клинике, так как будет известна необходимая концентрация препарата в очаге инфекции.