Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы

Классы МПК:A61K35/39 поджелудочная железа
C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них
A61P5/50 для увеличения или потенциирования активности инсулина
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2006-04-05
публикация патента:

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы. Способ осуществляют путем диссоциации ткани поджелудочной железы лабораторных животных с помощью гомогенизатора. В раствор при гомогенизации добавляют вещество с антипротеазной активностью, в качестве которого используют контрикал, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов и инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО 2 и 100% влажности воздуха в течение 14-21 сут. Изобретение позволяет клонировать регионарные стволовые клетки поджелудочной железы и получать, помимо роста гетерогенных клеточных элементов, органоспецифический рост - ацинусоподобные многоклеточные образования, представляющие собой структурно-функциональные единицы железистой ткани. 2 ил. способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной   железы, патент № 2308281

(56) (продолжение):

CLASS="b560m"9901163 A1, 14.01.1999. Maltseva O et.al "Fibroblast growth factor reversal of the corneal myofibroblast phenotyhe", Invest Ophthalmol Vis Sci, Oct; 41(11):2490-5.

Рисунки к патенту РФ 2308281

способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной   железы, патент № 2308281 способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной   железы, патент № 2308281

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы.

Известно большое количество способов культивирования in vitro клеточных элементов многих тканей в культуральных средах различного состава, с различными добавками, при этом чаще всего используют инкубацию клеточного материала в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности воздуха [1, 2].

Однако недостатком существующих способов является то, что их использование не дает возможности клонировать in vitro регионарные стволовые клетки поджелудочной железы.

Разработка данного способа является актуальной задачей, решение которой необходимо для научных целей: проведения фундаментальных исследований по изучению пролиферативно-дифференцировочного баланса регионарных стволовых клеток in situ в поджелудочной железе и закономерностей их функционирования и жизнедеятельности, а также для поиска и создания лекарственных средств, способных влиять на функциональную активность данной фракции резидентных клоногенных клеточных элементов железистой ткани с целью повышения эффективности терапии заболеваний поджелудочной железы и, в первую очередь, сахарного диабета различного генеза.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы.

Поставленная задача достигается тем, что диссоциацию ткани поджелудочной железы лабораторных животных проводят с помощью гомогенизатора, а в раствор добавляют вещество с антипротеазной активностью. В качестве вещества с антипротеазной активностью используют контрикал. Полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду и инкубируют в СО 2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 14-21 сут. Культуральная среда имеет следующий, предлагаемый нами состав: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов,.

Новым в предлагаемом способе является использование веществ с антипротеазной активностью в ходе механической диссоциации ткани поджелудочной железы и состав культуральной среды.

Заболевания поджелудочной железы являются весьма распространенными во всем мире и занимают значительное место в структуре заболеваемости и инвалидности населения нашей страны. Особую опасность для здоровья и социальную значимость патологии данного органа представляет сахарный диабет. При этом, несмотря на то, что существует значительное количество медикаментозных средств лечения данного заболевания, на сегодняшний день нет способов радикального излечения от его различных форм. Пациентам приходится постоянно, в течение всей жизни, принимать заместительную терапию либо другие сахароснижающие препараты. Кроме того, весьма сложно и далеко не всегда с успехом проводится лечение недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Вместе с тем, благодаря современному развитию клеточных технологий и связанному с этим обнаружению в различных органах резидентных мультипотентных стволовых клеток (назначением которых является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток либо их гибель, вызванную повреждающим фактором) [3], появилась возможность поиска новых путей разработки патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний поджелудочной железы [4], основанных на стимуляции функций стволовых клеток. Однако, как было описано выше, для разработки таких методов необходим способ клонирования регионарных стволовых клеток поджелудочной железы, позволяющий в условиях in vitro изучать действие на них различных препаратов и веществ.

Факт применения культуральной среды из используемых компонентов и их концентрация, в том числе добавление в среду указанной совокупности полифункциональных цитокинов, представляющих собой раннедействующие факторы роста с разнонаправленными механизмами действия на функциональное состояние клеточных элементов, и использование вещества с антипротеазной активностью в ходе механической диссоциации ткани поджелудочной железы с достижением нового результата: создание способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы, для специалиста является неочевидным.

Используемый в предлагаемом изобретении способ диссоциации ткани поджелудочной железы и состав среды в совокупности являются оптимальными для клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют клонировать in vitro регионарные стволовые клетки поджелудочной железы и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему чертежей

На фиг.1 А - ацинусоподобные образования на фоне гетерогенных клеточных элементов, выросшие на 14-е сут культивирования (нативный препарат), ув. 250 х; на фиг.1 Б - ацинусоподобное образование, выросшее на 21-е сут культивирования (нативный препарат), ув. 600 х.

На фиг.2 - ацинусоподобное образование, выросшее на 21-е сут культивирования, окр. азур II-эозин, ув. 600 х.

Способ осуществляют следующим образом.

Поджелудочную железу лабораторных животных (мышей) помещают в гомогенизатор с питательной средой, содержащей 5 ЕД/мл контрикала, и гомогенизируют до получения однородной клеточной взвеси, которую после фильтрации через капроновую сеточку помещают в культуральную среду следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов и инкубируют в СО 2-инкубаторе при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности воздуха в течение 14-21 сут.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 27 шт. массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1

Способ осуществляют следующим образом. У мыши линии СВА/CaLac массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали поджелудочную железу. Поджелудочную железу отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем ее помещали в гомогенизатор с питательной средой DMEM, содержащей 5 ЕД/мл контрикала, и гомогенизировали до получения однородной клеточной взвеси при комнатной температуре. После этого клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клетки помещали в среду следующего состава: 80% DMEM ("Serva", ФРГ), 20% неинактивированной ЭТС ("Sigma", США), 10 г/ л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Biochemie", Австрия), 50 мг/л свиного многокомпонентного инсулина ("Novo Nordisk", Дания), 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток ("Sigma", США), 30 нг/мл эпидермального фактора роста ("Sigma", США), 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора ("Sigma", США), 10 нг/мл интерлейкина-6 ("Sigma", США), 10 нг/мл фактора роста фибробластов ("Sigma", США). Доводили концентрацию клеточных элементов до 200 тыс/мл и по 3 мл приготовленной взвеси помещали в пластиковые 6-луночные планшеты ("Costar", США). Культуру инкубировали в течение 14-21 сут в СО2 инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% CO2 и 100% влажности воздуха. После инкубации с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9 (ув.56х) подсчитывали число многоклеточных (более 30 клеток) ацинусоподобных образований (фиг.1). Проинкубированный клеточный материал в планшете фиксировали метанолом и окрашивали азур П-эозином в течение 30-40 мин, после чего препараты изучали под иммерсией (фиг.2). При этом инкубация в течение 14-и сут приводит лишь к началу образования в культуре отдельных, преимущественно не до конца сформированных ацинусоподобных структур. Продление инкубации до 21-х сут приводит к образованию не только полностью сформированных ацинусов, но и позволяет зачастую получить их сливной рост.

Предлагаемый способ позволяет in vitro клонировать регионарные стволовые клетки поджелудочной железы и получать, помимо роста гетерогенных клеточных элементов, органоспецифический рост - ацинусоподобные многоклеточные образования, представляющие собой структурно-функциональные единицы железистой ткани.

Литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

2. Gritti A., Bonfanti L., Doetsch F., Caille I., Alvarez-BuyIla A., Daniel A. Lim, Galli R., Jose Manuel Garcia Verdugo, Daniel G. Herrera, Vescovi A.L. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents // J. Neuroscience. - 2002. - V.22. - P.437-445.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.

4. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival // Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - V.98. - P.10344.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы, заключающийся в инкубировании клеток, помещенных в культуральную среду в СО2-инкубатор при 37°С, 5% CO2 и 100%-ной влажности воздуха, отличающийся тем, что при диссоциации ткани поджелудочной железы лабораторных животных с помощью гомогенизатора в раствор добавляют вещество с антипротеазной активностью, в качестве которого используют контрикал, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду и инкубируют в течение 14-21 сут, а в качестве культуральной среды используют смесь следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2308281

patent-2308281.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K35/39 поджелудочная железа

Патенты РФ в классе A61K35/39:
дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток -  патент 2473684 (27.01.2013)
способ получения бета-клеток поджелудочных желез кроликов и композиция для стимуляции выработки собственного инсулина у пациента -  патент 2450052 (10.05.2012)
способ лечения острого деструктивного панкреатита и устройство для лечения острого деструктивного панкреатита -  патент 2441658 (10.02.2012)
макрогранулы агарозы seakem gold, содержащие секреторные клетки, и их применение -  патент 2417090 (27.04.2011)
способ получения средства, обладающего тканеспецифической активностью, и средство, полученное данным способом (варианты) -  патент 2415676 (10.04.2011)
ядра микропеллет панкреатина, пригодные для нанесения энтеросолюбильного покрытия -  патент 2408364 (10.01.2011)
способ лечения сахарного диабета -  патент 2405559 (10.12.2010)
способ консервативного лечения острого панкреатита -  патент 2402353 (27.10.2010)
средство для лечения диареи у поросят "колимак", способ его получения и способ лечения диареи у поросят -  патент 2385158 (27.03.2010)
способ определения пригодности поджелудочной железы как источника панкреатических островков -  патент 2355404 (20.05.2009)

Класс C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N5/02:
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток -  патент 2528764 (20.09.2014)
способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом -  патент 2528250 (10.09.2014)
способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани -  патент 2527182 (27.08.2014)
способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкмнк) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ммск) -  патент 2525143 (10.08.2014)
композиция для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей -  патент 2522816 (20.07.2014)
клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности -  патент 2510833 (10.04.2014)
способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда -  патент 2505602 (27.01.2014)
стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции -  патент 2499043 (20.11.2013)
малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека -  патент 2493250 (20.09.2013)
стимуляция пути wnt при перепрограммировании соматических клеток -  патент 2492232 (10.09.2013)

Класс A61P5/50 для увеличения или потенциирования активности инсулина

Патенты РФ в классе A61P5/50:
аналоги инсулина, устойчивые к протеазам -  патент 2524150 (27.07.2014)
лекарственное средство, включающее совместное применение или комбинацию ингибитора dpp-iv и другого лекарственного средства для лечения диабета -  патент 2523552 (20.07.2014)
хиназолинон, хинолон и родственные аналоги в качестве модуляторов сиртуина -  патент 2519779 (20.06.2014)
аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие аминокислотную замену в положении 59 -  патент 2511577 (10.04.2014)
лекарственные формы инсулина, обладающие быстрым усвоением -  патент 2506945 (20.02.2014)
новое производное 1,2,3,4-тетрагидрохиноксалина, содержащее в качестве заместителя фенильную группу, имеющую структуру эфира сульфокислоты или амида сульфокислоты, и обладающее связывающей активностью в отношении рецептора глюкокортикоидов -  патент 2498980 (20.11.2013)
способ прогнозирования эффективности лечения диабетической полинейропатии у больных сахарным диабетом 2 типа и дислипидемией -  патент 2491925 (10.09.2013)
усовершенствованная система доставки сухого порошкообразного лекарственного средства -  патент 2487731 (20.07.2013)
конъюгированные липидные производные -  патент 2480447 (27.04.2013)
способ предотвращения побочных эффектов glp-1 -  патент 2474415 (10.02.2013)

Наверх