способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца

Классы МПК:A61K35/34 мышцы; сердце
C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них
A61P9/00 Лекарственные средства для лечения сердечно-сосудистой системы
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2006-03-21
публикация патента:

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине и касается способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца. Способ осуществляется с помощью механической и ферментативной обработки сердечной мышцы лабораторных животных, полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280 и инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 7-14 сут. Изобретение позволяет клонировать in vitro регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма. 2 ил.

способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280 способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280

Формула изобретения

Способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца, заключающийся в инкубировании клеток, помещенных в культуральную среду в СО2-инкубатор при 37°С, 5% СО3 и 100%-ной влажности воздуха, отличающийся тем, что сердечную мышцу лабораторных животных предварительно подвергают механической и ферментативной диссоциации, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду, а в качестве культуральной среды используют смесь следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280 , и инкубируют в течение 7-14 сут.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине и касается способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца.

Известно большое количество способов культивирования in vitro клеточных элементов многих тканей в культуральных средах различного состава, с различными добавками, при этом чаще всего используют инкубацию клеточного материала в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха [1, 2].

Однако недостатком существующих способов является то, что их использование не дает возможности клонировать in vitro региональные клетки-предшественники, находящиеся в сердечной мышце взрослого организма.

Разработка данного способа является актуальной задачей, решение которой необходимо для проведения фундаментальных исследований по изучению пролиферативно-дифференцировочного баланса регионарных сердечных стволовых клеток in situ и закономерностей их функционирования и жизнедеятельности, а также для изучения влияния на данные элементы имеющихся в лечебной практике препаратов и создания новых средств, стимулирующих данную фракцию резидентных клоногенных клеточных элементов сердца с целью повышения эффективности терапии сердечных заболеваний.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма.

Поставленная задача достигается тем, что клеточные элементы диссоциированной с помощью механической и ферментативной обработки сердечной мышцы лабораторных животных (мышей) помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280 и инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 7-14 сут.

Новым в предлагаемом способе является использование последовательной механической и ферментативной диссоциации сердечной мышцы и состав культуральной среды.

Заболевания сердца и сердечно-сосудистой системы являются наиболее распространенными во всем мире и занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данных заболеваний определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов их фармакологической терапии и профилактики. Известно значительное количество медикаментозных и немедикаментозных способов профилактики и лечения заболеваний сердца с разнонаправленными механизмами действия. Вместе с тем благодаря развитию клеточных технологий на сегодняшний день и связанному с этим обнаружением в различных органах резидентных мультипотентных стволовых клеток (назначением которых является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором) [3], появилась возможность создания новых патогенетически обоснованных методов лечения, в том числе болезней сердца [4], основанных на стимуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Однако, как было описано выше, для разработки таких методов необходим способ клонирования регионарных клеток-предшественников сердца, позволяющий изучать действие на них различных препаратов и веществ в условиях in vitro.

Факт применения культуральной среды из используемых компонентов и их концентрация, в том числе добавление в среду указанной совокупности полифункциональных цитокинов, представляющих собой раннедействующие ростовые факторы, с разнонаправленными механизмами действия на функциональное состояние клеточных элементов, и использование сочетания механической и ферментативной обработки сердечной мышцы с целью ее диссоциации, с достижением нового результата: создание способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма, для специалиста является не очевидным.

Используемый в предлагаемом изобретении способ диссоциации мышечной ткани и состав среды в совокупности являются оптимальными для клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют клонировать in vitro регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых способов лечения болезней сердца. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему чертежей.

На фиг.1А - гетерогенная колония, выросшая на 7-е сут культивирования (микрофото нативного препарата), ув. 250 х; на фиг.1 Б - сплошной рост гетерогенных клеток на 14-е сут культивирования (микрофото нативного препарата), ув. 250 х.

На фиг.2А - рост множества миоцитоподобных двухядерных клеточных элементов (микрофото гистологического препарата культуры на 14-е сут), окраска гематоксилин-эозин, ув. 250 х; на фиг.2Б - миоцит (микрофото гистологического препарата культуры на 14-е сут), окраска гематоксилин-эозин, ув. 600 х;

Способ осуществляют следующим образом:

Сердечную мышцу лабораторных животных (мышей) диссоциируют на отдельные клеточные элементы с помощью механической и ферментативной обработки, затем полученную взвесь клеток помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280 и инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 7-14 сут.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 20 шт, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1.

Способ осуществляют следующим образом. У мыши линии СВА/ CaLac, массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали сердце. Сердце дважды отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем сердечную мышцу измельчали с помощью ножниц и помещали на 10 мин в раствор ЭДТА, содержащий 1,25 мг/мл трипсина, при комнатной температуре. После этого материал диссоциировали до получения клеточной взвеси, сначала путем пипетирования инкубационной среды при помощи шприца через иглу диаметром 2 мм в течение 5 мин, а затем с помощью гомогенизатора. После чего клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клетки помещали в среду следующего состава: 90% DMEM ("Serva", ФРГ), 10% инактивированной ЭТС ("Sigma", США), 6 г/ л глюкозы, 280 мг/л L-глугамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 8000 МЕ/л гепарина ("Biochemie", Австрия), 25 мг/л свиного многокомпонентного инсулина ("Novo Nordisk", Дания), 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток ("Sigma", США), 10 нг/мл интерлейкина-6 ("Sigma", США), 25 нг/мл основного фактора роста фибробластов ("Sigma", США), 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников   сердца, патент № 2308280 ("Sigma", США). Доводили концентрацию клеточных элементов до 200 тыс/мл и по 3 мл приготовленной взвеси помещали в пластиковые 6-луночные планшеты ("Costar", США). Культуру инкубировали в течение 7-14 сут в СО 2 инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. После инкубации с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9 (ув.56х) подсчитывали число колоний, содержащих миоцитоподобные клетки. Под колонией подразумевали образование, содержащее более 30 клеток (фиг.1). Проинкубированный клеточный материал в планшете фиксировали метанолом и окрашивали гематоксилином-эозином в течение 30-40 мин, после чего препараты изучали под иммерсией (фиг.2).

Предлагаемый способ позволяет in vitro клонировать регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма.

Источники информации

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

2. Gritti A., Bonfanti L., Doetsch F., Caille I., Alvarez-Buylla A., Daniel A. Lim, Galli R., Jose Manuel Garcia Verdugo, Daniel G. Herrera, Vescovi A.L. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents // J. Neuroscience. - 2002. - V.22. - P.437-445.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.

4. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival //Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - V.98. - P.10344.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2308280

patent-2308280.pdf

Класс A61K35/34 мышцы; сердце

способ создания продукта спортивного питания -  патент 2524550 (27.07.2014)
способ получения биологически активного препарата из скелетных мышц -  патент 2476234 (27.02.2013)
композиции фрагментов ткани для лечения недержания -  патент 2459627 (27.08.2012)
способ получения цитохрома с -  патент 2435597 (10.12.2011)
способ получения средства, обладающего тканеспецифической активностью, и средство, полученное данным способом (варианты) -  патент 2415676 (10.04.2011)
способ лечения нарушений липидного обмена и снижения массы тела у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями -  патент 2384340 (20.03.2010)
внутриматочное средство для лечения и профилактики вульвовагинитов у коров и способ его применения -  патент 2375067 (10.12.2009)
способ получения биологически активного продукта из хвостов пантовых оленей -  патент 2327476 (27.06.2008)
способ профилактики осложнений химиотерапии при лечении онкологического заболевания -  патент 2308956 (27.10.2007)
способ получения модифицированного биоматериала для использования в офтальмологии "склероплант м" -  патент 2290900 (10.01.2007)

Класс C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток -  патент 2528764 (20.09.2014)
способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом -  патент 2528250 (10.09.2014)
способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани -  патент 2527182 (27.08.2014)
способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкмнк) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ммск) -  патент 2525143 (10.08.2014)
композиция для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей -  патент 2522816 (20.07.2014)
клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности -  патент 2510833 (10.04.2014)
способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда -  патент 2505602 (27.01.2014)
стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции -  патент 2499043 (20.11.2013)
малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека -  патент 2493250 (20.09.2013)
стимуляция пути wnt при перепрограммировании соматических клеток -  патент 2492232 (10.09.2013)

Класс A61P9/00 Лекарственные средства для лечения сердечно-сосудистой системы

соединение сальвианоловой кислоты л, способ его приготовления и применения -  патент 2529491 (27.09.2014)
ациламино-замещенные производные конденсированных циклопентанкарбоновых кислот и их применение в качестве фармацевтических средств -  патент 2529484 (27.09.2014)
рецептура для перорального трансмукозального применения гиполипидемических лекарственных средств -  патент 2528897 (20.09.2014)
антагонисты pcsk9 -  патент 2528735 (20.09.2014)
хиназолиноны как ингибиторы пролилгидроксилазы -  патент 2528412 (20.09.2014)
новое производное пиразол-3-карбоксамида, обладающее антагонистической активностью в отношении рецептора 5-нт2в -  патент 2528406 (20.09.2014)
6-замещенные изохинолины и изохинолиноны полезные в качестве ингибиторов rho-киназы -  патент 2528229 (10.09.2014)
способы и составы для лечения субарахноидального кровоизлияния коронарной и артериальной аневризмы -  патент 2528097 (10.09.2014)
новый агонист бета рецептора тиреоидного гормона -  патент 2527948 (10.09.2014)
способ коррекции эндотелиальной дисфункции -  патент 2527689 (10.09.2014)
Наверх