способ профилактики и/или лечения астмы с использованием рврв

Формула изобретения

1. Способ профилактики и/или лечения астмы у субъекта, который нуждается в этом, включающий стадию введения фармакологически эффективного количества пара-бромфенацилбромида (РВРВ) субъекту.

2. Способ по п.1, в котором субъект может быть животным, включая человека.

3. Способ по п.1, в котором концентрация РВРВ варьирует между 0,1 и 10 мг/кг веса тела.

4. Способ по п.1, в котором концентрация РВРВ составляет 1 мг/кг веса тела.

5. Способ по п.1, в котором РВРВ вводят в течение примерно 1 недели.

6. Способ по п.1, в котором РВРВ не обладает побочными эффектами.

7. Способ по п.1, в котором РВРВ вводится путем, выбранным из группы, включающей интраперитонеальный и пероральный путь.

8. Способ модуляции уровней биомолекул, таких как IL-4, IL-5, IL-13, IFN- и IgE, для того чтобы помочь предотвратить и/или лечить астму, включающей стадии введения фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ) субъекту и определения вариаций в уровне биомолекул.

9. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает поддержать уровень IFN- .

10. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает снизить уровень IL-4, IL-5 HIL-13.

11. Способ по п.8, в котором РВРВ предотвращает увеличение уровня IL-4, IL-5 и IL-13.

12. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает снизить уровень эозинофилов.

13. Способ по п.8, в котором РВРВ предотвращает увеличение уровня эозинофилов.

14. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает понизить уровень IgE на примерно 50%.

15. Способ по п.8, в котором РВРВ предотвращает увеличение уровня IgE.

16. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает предотвратить сужение дыхательных путей (СДП).

17. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает восстановить до приблизительно 96% базального уровня сужения дыхательных путей (СДП).

18. Способ по п.8, в котором РВРВ помогает предотвратить развитие реактивности дыхательных путей.

19. Применение парабромфенацилбромида (РВРВ) для профилактики и/или лечения астмы у субъекта, включающее стадию введения фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ) субъекту.

20. Применение по п.19, в котором субъектом может быть животное, включая человека.

21. Применение по п.19, в котором концентрация РВРВ варьирует между 0,1 и 10 мг/кг веса тела.

22. Применение по п.19, в котором концентрация РВРВ составляет примерно 1 мг/кг веса тела.

23. Применение по п.19, в котором РВРВ вводят в течение примерно 1 недели.

24. Применение по п.19, в котором РВРВ не обладает побочными эффектами.

25. Применение по п.19, в котором РВРВ вводят способами, выбранными из группы, включающей интраперитонеальный и пероральный путь.

26. Применение парабромфенацилбромида (РВРВ) для модулирования уровней биомолекул, таких как IL-4, IL-5, IL-13, IFN- и IgE, для того чтобы помочь предотвратить и/или лечить астму, включающее стадии введения фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ) субъекту и определения вариаций в уровне биомолекул.

27. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает поддержать уровень INF- .

28. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает снизить уровни IL-4, IL-5 и IL-13.

29. Применение по п.26, в котором РВРВ предотвращает увеличение уровней IL-4, IL-5 и IL-13.

30. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает снизить уровень эозинофилов.

31. Применение по п.26, в котором РВРВ предотвращает увеличение уровня эозинофилов.

32. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает снизить уровни IgE на приблизительно 50%.

33. Применение по п.26, в котором РВРВ предотвращает увеличение уровня IgE.

34. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает предотвратить сужение дыхательных путей.

35. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает восстановить до приблизительно 96% базального уровня сужения дыхательных путей (СДП).

36. Применение по п.26, в котором РВРВ помогает предотвратить реактивность дыхательных путей.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения астмы у субъектов, включающему стадию введения субъекту фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ), способу модуляции уровня биомолекул для достижения того же.

Уровень техники

Астма представляет собой воспалительное нарушение дыхательных путей, которое характеризуется обратимой обструкцией дыхательных путей, гиперреактивностью дыхательных путей, высоким уровнем иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови и эозинофилов в дыхательных путях. Эта болезнь поражает миллионы людей по всему миру и достигает масштабов эпидемии (Cookson, 1999).

С увеличением понимания молекулярных механизмов астмы сообщалось о многих терапевтических альтернативах ее лечения, таких как глюкокортикоиды, антагонисты медиаторов, модуляторы цитокинов, ингибиторы фосфодиэстеразы 4, соединения ряда хромонов и иммунотерапия (Barnes, 1999). Однако стероиды все еще являются главным средством в борьбе с астмой. Стероидная терапия имеет много побочных эффектов, таких как остеопороз, ожирение, нарушение заживления ран, увеличенный риск инфекции, подавление гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси, миопатия, гипертония и так далее (States et al., 1997), и нельзя избежать этих нежелательных побочных эффектов. Таким образом, существует необходимость поиска нестероидных антиастматических агентов с очень небольшими или пренебрежимо малыми побочными эффектами.

Фосфолипаза А2 (PL А₂) является ключевым ферментом в генерации различных метаболитов арахидоновой кислоты, таких как лейкотриены и простагландины, которые участвуют в патогенезе различных воспалительных заболеваний, включая астму (Bowdon et al, 1997, Chilton et al., 1996, Brazen et al., 1999). Было обнаружено, что РВРВ блокирует отек легких и миотоксичность (Melo and Ownby, 1999; Evans and Ownby, 1993).

Недавно было показано, что он ингибирует несколько других стадий, вовлеченных в проявление воспаления. Tithof и сотрудники продемонстрировали, что РВРВ ингибирует индуцированное поливинилхлоридом высвобождение супероксида (O2) нейтрофилами (Tithof et al., 1996). Далее сообщалось, что это соединение ингибирует способность NF-кВ (Von Puijenbrock et al, 1996), важного транскрипционного фактора, вовлеченного в экспрессию воспалительных цитокинов, связываться с ДНК. Было также показано, что РВРВ уменьшает сократимость полосок паренхимы легких, индуцированную активирующим фактором тромбоцитов (PAF) или овальбумином. Многие из этих параметров, то есть увеличение активности PL A₂ (Bowton et al., Mehta et al, 1990), связывание NF-кВ с ДНК (Barnes, 1996), освобождение супероксида (Barnes, 1990) и адгезия клеток (Gundel et al., 1991), вовлечены в патогенез астмы. Однако до сих пор нет сообщений о прямых экспериментах in vivo, которые могли продемонстрировать эффект РВРВ на астматические симптомы либо на человеческой модели, либо на животных. Новизна изобретения заключается в первой демонстрации in vivo действия РВРВ, облегчающего характерные симптомы астмы, наблюдаемые на мышах, такие как аллергениндуцированный ранний ответ дыхательных путей (РОДП) и поздний ответ дыхательных путей (ПОДЛ).

Цели настоящего изобретения

Основная цель настоящего изобретения заключается в разработке способа профилактики и/или лечения астмы.

Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке способа для профилактики и/или лечения астмы у животных, включая человека, с использованием РВРВ.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение схемы дозирования РВРВ для профилактики и/или лечения астмы.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение путей введения РВРВ для профилактики и/или лечения астмы.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа модуляции уровня биомолекул для помощи в профилактике и/или лечении астмы.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение эффекта РВРВ на уровень IFN-гамма.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение эффекта РВРВ на уровни IL-4, IL-5, IL-13.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение эффекта РВРВ на уровень эозинофилов.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение эффекта РВРВ на уровень IgE.

Еще одной целью настоящего изобретения является определение эффекта РВРВ на сужение дыхательных путей (СДП).

Еще одной целью настоящего изобретения является определение эффекта РВРВ на реактивность дыхательных путей.

Другой главной целью настоящего изобретения является обеспечение образцовой молекулы для предотвращения развития симптомов астмы.

Еще другой целью настоящего изобретения является обеспечение образцовой молекулы для разработки терапевтического средства, которое может облегчить характерные симптомы астмы.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретения относится к способу профилактики и/или лечения астмы у субъектов, включающему стадию введения фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ) субъекту, а также способу модулирования уровня биомолекул для достижения того же.

Осуществление изобретения

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения астмы у субъекта, включающему стадию введения субъекту фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ), а также способу модуляции уровня биомолекул для достижения того же.

В воплощении настоящего изобретения, относящегося к способу профилактики и/или лечения астмы у субъекта, способ включает стадию введения субъекту фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ).

В другом воплощении настоящего изобретения субъектом может быть животное, включая человека.

В другом воплощении настоящего изобретения концентрация РВРВ изменяется между 0,1 и 10 мг/кг веса тела.

В другом воплощении настоящего изобретения концентрация РВРВ составляет около 1 мг/кг веса тела.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ вводится в течение примерно одной недели.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ не дает побочных эффектов.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ вводится путями, выбранными из группы, включающей внутриперитонеальный и оральный путь.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения, относящемся к способу модуляции уровня биомолекул, который помогает предотвратить и/или лечить астму, способ включает стадию введения субъекту фармакологически эффективного количества парабромфенацилбромида (РВРВ) и определения вариаций в уровнях биомолекул.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает поддерживать уровень INF-гамма.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает снизить уровни IL-4, IL-5, IL-13.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ предотвращает повышение уровня IL-4, IL-5, IL-13.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает снизить уровень эозинофилов.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ предотвращает повышение уровня эозинофилов.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает снизить уровень IgE на примерно 50%.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ предотвращает повышение уровня IgE.

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает предотвратить сужение дыхательных путей (СДП).

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает восстановить до 96% базального уровня сужения дыхательных путей (СДП).

И еще в другом воплощении настоящего изобретения РВРВ помогает предотвратить развитие реактивности дыхательный путей.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 показывает протокол исследования профилактического и лечебного действия РВРВ.

Фигура 2 показывает определение диаметра дыхательных путей с использованием мыши в качестве модельной системы.

Фигура 3 показывает вариации в уровне специфической проводимости дыхательных путей до и после аэрозольного ударного воздействия овальбумина на контрольных и обработанных РВРВ мышах.

Фигура 4 показывает обращение СДП, отражающее лечебный эффект РВРВ на мышах, подвергнутых аэрозольному воздействию овальбумина.

Фигура 5 показывает вариации в уровнях специфической проводимости дыхательных путей до и после воздействия метахолина (MX) на контрольных и обработанных РВРВ мышах.

Фигура 6 показывает обращение СДП, отражающее лечебный эффект РВРВ на мышах, подвергнутых ударному воздействию MX.

Фигура 7 показывает понижающий эффект РВРВ на уровень сывороточного IgE.

Фигура 8 показывает ингибирующий эффект РВРВ на уровень эозинофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ).

В другом воплощении настоящего изобретения, где существующие антиастматические агенты, в частности стероиды, имеют множество побочных эффектов, имеется настоятельная потребность в разработке нестероидных антиастматических препаратов. В этом контексте парабромфенацилбромид (РВРВ), нестероидное противовоспалительное соединение, было тестировано на антиастматическую активность с использованием мышиной модели астмы. Введение фармакологически эффективной дозы РВРВ мышам во время сенситизации предотвращало развитие обоих астматических компонентов (РОДП и ПОДП). Это открытие показывает также, что РВРВ, будучи введенным орально животным с симптомами нарушения дыхательных путей, облегчает существующие симптомы нарушения. Было обнаружено, что РВРВ снижает уровни IFN- и понижает уровни IL-4, IL-5 и эозинофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Уровень аллергеноспецифичного IgE в сыворотке крови также значительно снижается.

В другом воплощении настоящего изобретения, в котором, соответственно, настоящее изобретение имеет отношение к новому применению пара-бромфенацилбромида как антиастматического агента, способ применения включает:

а) сенситизацию животных IgE-генным белком, чтобы индуцировать характерные симптомы астмы,

б) оценку астматических симптомов до, во время и после сенситизации животных,

в) введение фармакологически активных концентраций раствора РВРВ здоровым животным во время и после сенситизации,

г) определение иммунологических характеристик у умерщвленных животных после стадии (б) и (в).

В другом воплощении настоящего изобретения используемая модель может быть выбрана из balb/c мышей, кроликов и морских свинок.

В другом воплощении настоящего изобретения белок для сенситизации животных может быть введен путем внутриперитонеальной инъекции или аэрозольной ингаляции.

В еще другом воплощении настоящего изобретения раствор белка в нормальном солевом растворе, использованный для сенситизации, может быть выбран из овальбумина, бычьего сывороточного альбумина и любого другого IgE-генного белка в концентрации, варьирующей между 10-100 нг на инъекцию или 1-5% для ингаляции в виде аэрозоля в нормальном солевом растворе.

В еще другом воплощении настоящего изобретения РВРВ может быть введен орально животным в концентрации, варьирующей от 0,1 до 10 мг/кг веса тела.

В еще другом воплощении настоящего изобретения астматические симптомы могут быть оценены известным способом определения специфической проводимости дыхательных путей или специфического сопротивления дыхательных путей.

В еще другом воплощении настоящего изобретения иммунологические характеристики могут быть определены путем оценки уровней IgE, INF-гамма, IL-4, IL-5 и эозинофилов известными методами.

В еще другом воплощении настоящего изобретения астма является воспалительным заболеванием дыхательных путей, которое затрагивает миллионы людей по всему миру. Болезнь достигает размеров эпидемии (Cookson, 1999) и непродуктивно оплачивается юными жизнями. Астма характеризуется обструкцией дыхательных путей, гиперреактивностью дыхательных путей, высоким уровнем IgE в сыворотке крови и наличием эозинофилов в дыхательных путях. Развитие этого заболевания опосредовано провоспалительными цитокинами IL-4, IL-3, IL-5, секретируемыми Th2 клетками. С другой стороны, цитокин интерферон-гамма (IFN- ), секретируемый Th1 клетками, ингибирует Тh2-цитокины. Астматический ответ может быть разделен на раннюю и позднюю фазу реакции. Ранняя фаза начинается немедленно после вторичного экспонирования аллергену и обусловлена гистамином и другими липидными медиаторами, которые приводят к воспалению и сужению дыхательных путей. Поздняя фаза реакции имеет место через 8-24 часа после экспозиции и приводит к инфильтрации воспалительных клеток, например эозинофилов, нейтрофилов и так далее, в альвеолы. Эти клетки освобождают токсические гранулярные белки, которые повреждают эпителий, а также вырабатывают разнообразные медиаторы, включая липидные медиаторы (Barnes et al, 1998).

В другом воплощении настоящего изобретения при растущем понимании молекулярных механизмов астмы сообщалось о многих терапевтических возможностях (Bames, 1999). Однако после более чем 40 лет применения стероидов до сих пор отсутствует замена и стероиды по-прежнему остаются лекарственным средством наряду с агонистами бета 2-адренорецепторов для лечения астмы. Отсутствует возможность избежать их побочных вредных эффектов. Таким образом, существует потребность в поиске нестероидных антиастматических средств с очень малыми или пренебрежимыми побочными эффектами.

В другом воплощении настоящего изобретения РВРВ в этом контексте был тестирован с использованием мышиной модели астмы. Мыши были сенситизированы внутриперитонеально и путем аэрозольной ингаляции овальбумина, для того чтобы развились характерные симптомы астмы, такие как индуцированный аллергеном ранний ответ дыхательных путей (РОДП) и поздний ответ дыхательных путей (ПОДП). Эти астматические симптомы были охарактеризованы путем определения калибра дыхательных путей в терминах специфической проводимости дыхательных путей (СПДП) с использованием неинвазивной техники, двухкамерной плетизмографии всего тела. После развития характерных астматических симптомов (РОДП и ПОДП) орально давали РВРВ во время всего периода сенситизации для тестирования профилактического эффекта на развитие астматических симптомов. Для проверки терапевтического эффекта РВРВ на астматические симптомы РВРВ скармливали мышам в течение одной недели после сенситизации и подтверждения астматических симптомов.

В другом воплощении настоящего изобретения после тестирования соединения на профилактическую и терапевтическую ценность в интактных здоровых мышах, мышей забивали и собирали кровь и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для определения уровня IgE, цитокинов IL-4, IL-5, IFN- и гомофилии. Уровень специфического по отношению к IgE овальбумина в сыворотке крови и уровни цитокинов IL-4, IL-5, IFN- в БАЛ были измерены с использованием наборов для ELISA. Преобладание эозинофилов в БАЛ было определено с использованием проточной цитофлуориметрии.

В другом воплощении настоящее изобретение обеспечивает эффективное соединение для профилактики развития характерных симптомов астмы у животных, например предотвращается развитие сужения дыхательных путей и реактивности дыхательных путей у мышей, получавших РВРВ орально во время десенситизации.

В другом воплощении настоящее изобретение также демонстрирует, что РВРВ является эффективным, даже если он дан мышам после сенситизации, то есть после развития гиперреактивности дыхательный путей. РВРВ, вводимый орально в течение одной недели животным с гиперреактивностью дыхательных путей, ингибировал индуцированное аллергеном сужение дыхательных путей и их гиперреактивность по отношению к метахолину. Это показывало терапевтический потенциал этого соединения.

В другом воплощении настоящее изобретение также показывает, что РВРВ редуцирует сенситизацию, как свидетельствует пониженный уровень IgE в сыворотке, и сохраняет уровень IFN- в жидкости БАЛ.

В другом воплощении настоящего изобретения введение РВРВ мышам как во время, так и после сенситизации значительно уменьшает преобладание эозинофилов в жидкости БАЛ. Эти данные позволяют предполагать, что РВРВ ингибирует воспаление при введении его фармакологически активной дозы. Было обнаружено, что эффективной дозой является 1 мг/кг веса тела.

Настоящее изобретение обеспечивает эффективное средство, пара-бромфенацилбромид (РВРВ), который предотвращает развитие характерных симптомов астмы, таких как индуцированный аллергеном РОДП, так и ПОДП на животной модели, путем введения фармакологически эффективной дозы указанному животному. Изобретение также обеспечивает, что РВРВ может ослаблять уже развившийся РОДП и ПОДП у указанного животного при введении его фармакологически эффективной дозы после сенситизации. Это демонстрирует терапевтический эффект этого соединения. Настоящее изобретение также демонстрирует, что РВРВ ослабляет изменение определенных иммунологических параметров, т.е. эозинофолов, IgE, IL-4, IL-5 и IFN- , ассоциированных с астмой. Таким образом, РВРВ, будучи нестероидным соединением, может использоваться как образцовая молекула в разработке антиастматических лекарственных средств. Настоящее изобретение относится к новому применению пара-бромфенацилбромида как средства против астмы. Здесь показано, что пара-бромфенацилбромид (РВРВ) имеет потенциал как образцовая молекула для разработки антиастматических лекарственных средств для лечения клинической астмы. С целью иллюстрации различных воплощений изобретений даны следующие примеры, и они никаким образом не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Пример 1 - сенситизация животных

Самцы мышей линии balb/c в возрасте восемь-десять недель и весом 18-22 г были акклиматизированы в течение одной недели в лабораторных условиях. Мыши были сенситизированы путем интралеритонеальной инъекции 0,2 мл солевого раствора 10 мкг овальбумина (ova) (Сигма, США,) адсобированного на геле гидроксида алюминия в 0, 7 и 14 дни после аэрозольной ингаляции в течение 5 следующих дней с дня 19 по 23 с 2% овальбумина (в солевом растворе, вес/объем) в течение 30 минут ежедневно. Аэрозольная обработка была выполнена путем помещения мышей в камеру из плексигласа (20×20×10 см²), и овальбумин или один солевой раствор были распылены с использованием распылителя (Devilbiss, модель 645, США) со скоростью потока воздуха 7 л/минуту. Ложносенситизированные мыши получали 0,7 мл солевого раствора, содержащего только 2 мг Al(ОН)₃, в 0, 7, 14 дни после ингаляции солевого аэрозоля без овальбумина в течение 5 следующих дней.

Пример 2 - обработка мышей РВРВ

Соединение РВРВ (Сигма, США) было растворено в абсолютном спирте (10 мг/мл), РВРВ (объем 20 мкл) вводили каждой мыши перорально. Для оценки эффекта РВРВ на сенситизацию и развитие нарушений чувствительности дыхательных путей (профилактический эффект, фигура 1а) было использованы мыши, пять групп (по шесть мышей в каждой). Одна группа была ложносенситизированным контролем, а другую держали как сенситизированный контроль. Оставшимся трем группам мышей давали перорально три различных концентрации РВРВ (0, 1 и 10 мг/кг веса тела) ежедневно, начиная с первого и по последний день сенситизации. Ложносенситизированным и сенситизированным контрольным мышам был дан только носитель (20 мкл спирта) подобным же образом. Были проведены начальные определения специфической проводимости дыхательных путей и реактивности дыхательных путей у всех животных до начала экспериментов. Овальбумин индуцировал сужение дыхательных путей, и реактивность дыхательных путей была определена после окончания протокола сенситизации. Измерения были выполнены, как описано ниже (пример 3, 4 и 5).

Для проверки терапевтического эффекта РВРВ на сенситизированных мышах (терапевтический эффект, фигура 16) мыши были сенситизированы до обработки РВРВ, и сужение дыхательных путей в ответ на овальбумин и их реактивность в ответ на метахолин были определены, как описано ниже. Для этого исследования были отобраны животные, показавшие по крайней мере 40% падение проводимости дыхательных путей в ответ на обработку аэрозолем овальбумина. Сенситизированные мыши были в случайном порядке разделены на 4 группы по 6 мышей в каждой группе. Трем группам мышей давали ежедневно три различные концентрации РВРВ в 20 мкл спирта, доведенного до содержания РВРВ в дозе 0,1, 1 и 10 мг/кг веса тела соответственно в течение недели. Четвертой группе скармливали только 20 мкл спирта в течение одной недели, чтобы использовать как сенситизированный контроль. После этого было определены сужение и реактивность воздушных путей.

Пример 3 - определение калибра дыхательных путей

Калибр (диаметр) дыхательных путей был определен в терминах специфической проводимости (СПД). СПД является мерой калибра дыхательных путей и был определен с использованием двухкамерной плетизмографии всего тела (Agrawal, 1981.) Двухкамерный плетизмограф всего тела был создан в нашей лаборатории, для того чтобы подходить к размеру мыши (фиг.2). Изменение давления в камере в ответ на дыхание помещенной туда мыши было определено при помощи датчика (Validyne mp 45 + 2cmh20) и усилителем несущей частоты (модель Validyne CD 15 carrier demodulator), который был связан с х-каналом осциллографа Tektronix, модель 6116, США. Пневмотахограф, прикрепленный к передней камере плетизмографа, был использован для того, чтобы детектировать поток воздуха от ноздрей мыши. Этот сигнал был усилен другим набором того же типа датчика и усилителя, которые в свою очередь были связаны с у-каналом осциллоскопа. Эти два канала (х-у) давления в камере против потока воздуха были соединены и отображались как петля на экране осциллографа. Наклон (тангенс ) раннего вдыхательного плеча х-у петли обеспечивал данные для расчета СПД. СПД является отношением изменения потока воздуха к связанному с потоком изменению давления в камере во время перехода от выдоха к вдоху дышащей мыши, которое после решения становится:

Животные были акклиматизированы в камере в начале исследования и во время регистрации петли каждая индивидуальная мышь находилась в камере около 10 минут, для того чтобы получить базальную петлю корректно. Значения наклонов были зарегистрированы путем получения по крайней мере трех сходных петель. Несколько петель было проверено до выбора похожих трех петель для регистрации значения. Написанная выше формула была использована для расчета значений СПД (Agrawal, 1981).

Пример 4 - РВРОВ ингибирует острое индуцированное овальбумином сужение дыхательных путей

Сокращение дыхательных путей мышей было определено в терминах падения СПД, обусловленного аэрозольным введением овальбумина, как описано в примере 3. Для изучения профилактического эффекта РВРВ на сужение дыхательных путей, вызванное сенситизацией, мышам давали РВРВ в дозе 0,1, 1, 10 мг/кг веса тела) во время периода сенситизации. Уровни СПД были определены до и после вдыхания аэрозоля у всей группы (фигура 3). Ложносенситизированные мыши не демонстрировали никакого значительного уменьшения базального уровня СПД после вдыхания овальбумина. Сенситизированные мыши показывали 48% падение от базального уровня СПД в ответ на введение овальбумина. Оральное введение мышам различных доз РВРВ во время периода сенситизации предотвращало падение уровней СПД в ответ на введение альбумина в сравнении с сенситизированными мышами зависимым от дозы образом. Мыши, получавшие 0,1 мг РВРВ /кг веса тела, показали падение уровня СПД только на 17%, в то время как животные, получавшие 1 мг РВРВ /кг веса тела, имели только 4% падение СПД от их базального уровня. Дальнейшее увеличение дозы РВРВ до 10 мг/кг веса тела не показывало никакого дополнительного эффекта.

Для того чтобы изучить терапевтический эффект РВРВ (0, 1, 10 мг/кг веса тела) вводили в течение одной недели уже сенситизированным животным. На фигуре 4 показано обращение (лечебный эффект) под действием СПД дозозависимым образом. Доза 1 мг/кг веса тела восстанавливает уровень СПД до 86% от нормального базального уровня, а доза 10 мг РВРВ/кг веса тела почти полностью (96%) восстанавливает уровень СПД до базальному уровня (фигура 4).

Пример 5 - РВРВ снижает реактивность дыхательных путей по отношению к MX

Реактивность дыхательных путей в ответ на ацетил-бета-метахолин (Сигма, США) была определена через 24 часа после последней ингаляции аэрозоля овальбумина. Аэрозоль с различными концентрациями метахолина (3,1, 6,25, 12,5, 50 и 100 мг/мл) давали в течение 60 с. Значения PD ₃₅ были определены у ложносенситизированных, сенситизированных и получавших РВРВ мышей во время сенситизации и после, как показано на фигуре 5. Не было обнаружено изменений в значениях PD ₃₅ для MX у ложносенситизированных до и после введения овальбумина, в то время как было существенное падение в значении PD₃₅ для MX (86%) у сенситизированных мышей через 24 ч после введения овальбумина по сравнению с его начальным значением (р<0,005). Снижение PD₃₅ дыхательных путей в отношении MX у сенситизированных мышей ясно показывало их увеличенную гиперреактивность по отношению к MX, как также наблюдалось в терминах падения уровней СПД. Введение мышам РВРВ во время сенситизации значительно снижало значения PD ₃₅ для MX по отношению к базальному уровню. Степень снижения PD₃₅ для MX зависела от дозы, и восстановление до 93% от начального уровня наблюдалось при введении дозы 1 мг/кг веса тела. Доза РВРВ 10 мг/кг веса тела давала еще лучший ответ, увеличивая СПД (115%) от начальных значений PD ₃₅ для MX (фигура 5). Кроме того, когда сенситизированные животные, уже имевшие гиперреактивность дыхательных путей (PD ₃₅ для MX 5,5±0,06 до 8,7±2,2), получали перорально различные концентрации РВРВ, значения PD₃₅ для MX также восстанавливались зависимым от дозы образом (фигура 6). Значения восстанавливались до более чем 81% от базального уровня при дозе 1 мг/кг веса тела (фигура 6) и при дозе 10 мг/кг веса тела восстановление достигало 94% от базального значение PD₃₅ для MX. У ложносенситизированных мышей аэрозольное воздействие различных доз MX не демонстрировало никаких изменений в значениях PD₃₅ для MX по сравнению с их начальными значениями после введения овальбумина.

Пример 6 - введение РВРВ во время и после сенситизации снижает уровень IgE

Были определены уровни сывороточного IgE во всех группах мышей с помощью ELISA (фигура 7). Специфические уровни IgE были определены методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Уровень IgE существенно увеличивался (384±22,8 нг/мл) у сенситизированных мышей по сравнению с ложносенситизированной группой (30 ± нг/мл) (фигура 7). Интересно, что оральное введение РВРВ мышам, претерпевающим сенситизацию, предотвращало повышение уровня сывороточного IgE дозозависимым образом. Средний уровень сывороточного IgE у мышей, получавших РВРВ (1 мг/кг веса тела), был значительно ниже (40%) по сравнению с таковым у сенситизированных животных. Однако обработка 10 мг РВРВ/кг веса тела не оказывала добавочного эффекта на уровень IgE. Итак, когда РВРВ (1 мг/кг веса тела) давали в течение 1 недели уже сенситизированным животным, наблюдалось значительное падение (р<0,05) в уровне IgE в сыворотке (47%) по сравнению с таковым у сенситизированных мышей, которым вводили растворитель (фигура 7).

Пример 7 - РВРВ снижает уровень эозинофилов в жидкости БАЛ

Уровень эозинофилов в жидкости БАЛ детектировали с помощью проточного цитометра (facs Vantage, Becton, США) с использованием метода, описанного Bedner et al. (1999). Клетки отбирались на основе размера и флуоресценции (FSC против FL1) и процент отобранных клеток был определен с помощью программы клеточного поиска. Данные представлены как средние значения для шести мышей. Как показано на фигуре 8, уровни эозинофилов в БАЛ были значительно повышены у сенситизированных овальбумином мышей по сравнению с ложно-сенситизированными мышами. Пероральное введение РВРВ (1 мг/кг веса тела) во время сенситизации предотвращало повышение уровня эозинофилов. У уже сенситизированных мышей введение РВРВ (1 мг/кг веса тела) также значительно снижало уровень эозинофилов (р<0,01) по сравнению с таковым у сенситизированных мышей, получавших только спирт.

Пример 8 - РВРВ увеличивает IFN-гамма и уменьшает IL-4 и IL-5 в жидкости БАЛ

Цитокины INF-гамма, IL-4, IL-5 были определены в БАЛ с использованием наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (BD Pharmingen, США) в соответствии с протоколом производителя.

Мыши были обработаны РВРВ (1 мг/кг веса тела) во время сенситизации и после сенситизации. Уровни цитокинов в жидкости БАЛ были измерены после сенситизации и обработки РВРВ. Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка (n=4 в каждой группе).

Таблица
Обработка	Цитокины
	INF- (пг/мл)	IL-4 (пг/мл)	INF- :IL-4 (пг/мл)	IL-5 (пг/мл)
Ложносенситизированные	495,0±152,5	77,0±14,9	6,4	104,8±15,2
Сенситизированные	162,0±45,2	143,0±3,0	1,1	158,7±22,5
РВРВ во время сенситизации	402±14,4*	91,0±13,2*	4,4	75,1±7,4*
РВРВ после сенситизации	425,1±54,0*	42,4±4,9*	10,0	53,4±2,2*
* Достоверное отличие от группы сенситизированных мышей (р<0,05)

Результаты представлены в пг/мл каждого образца. Результаты (таблица) показали, что РВРВ влияет на уровень цитокинов. Уровни IL-4 (143±3,0 пг/мл) и IL-5(158,7±22,5) у сенситизированных мышей увеличивались по сравнению с таковым у ложносенситизированных (77,0±14,9 пг/мл и 104,8±15,2 пг/мл соответственно). Введение РВРВ во время процедуры сенситизации или после сенситизации достоверно снижало (р<0,05) по сравнению с сенситизированными мышами. С другой стороны, РВРВ удерживало уровень IFN- на уровне ложносенситизированных мышей. В обеих группах мышей, получавших РВРВ во время сенситизации и после сенситизации, наблюдалось увеличение соотношения INF- :IL-4 (4,4 и 10 соответственно) по сравнению с таковым у контрольных сенситизированных мышей (1,1).

Основные преимущества настоящего изобретения:

1. Это первая демонстрация того, что РВРВ ингибирует характерные симптомы астмы, полученные на животной модели, и она может быть использована для разработки эффективного препарата для терапии астмы.

2. РВРВ, будучи нестероидным соединением, может иметь меньше побочных эффектов, чем существующие терапевтические стероиды.

3. Это соединение недорого и легко доступно.

4. Использование РВРВ может не быть ограниченным только созданием антиастматических препаратов, но использоваться в других условиях воспаления, где повышение уровня IgE, снижение уровня IL-4, IL-5 и эозинофилов может играть значительную роль.