способ изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней и способ профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней

Формула изобретения

1. Способ изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, включающий выращивание вируса в культуре клеток, сбор и инактивацию вируса, добавление адъюванта и расфасовку вакцины, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности вакцины используют инактивированный вирулентный штамм «ТВ», размноженный в культуре клеток в течение 15-25 пассажей и накапливающийся в титре 7,0-8,5 lg ТЦЦ_50/мл и антигенностью в ИФА не ниже 1:4.

2. Способ профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней, включающий двукратную внутримышечную иммунизацию супоросных свиноматок и трехкратную иммунизацию ремонтных свинок, отличающийся тем, что используют инактивированную вакцину «ТГИ» по п.1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и касается изготовления и применения вакцины для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС). ТГС является острым высококонтагиозным заболеванием свиней, которое широко распространено во многих странах с развитым свиноводством и причиняет большой экономический ущерб. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов. Однако наиболее восприимчивыми являются новорожденные поросята до 2-недельного возраста, уровень летальности среди которых может достигать 100%. ТГС сопровождается изнуряющей диареей, рвотой и дегидратацией. Этиологическим агентом трансмиссивного гастроэнтерита является представитель семейства Coronaviridae.

Особую опасность заболевание представляет для крупных свиноводческих комплексов с непрерывными опоросами, где благодаря длительной персистенции вирулентных штаммов вируса ТГС зачастую приобретает энзоотическое течение и периодически вызывает массовую гибель поросят. Специфическая профилактика ТГС оказалась трудной задачей, которая несмотря на многочисленные исследования до сих пор не нашла своего окончательного решения. Трудность решения проблемы связана с тем, что поросята заражаются в первые дни после рождения, что исключает создание у них активного иммунитета, а защита полностью зависит от пассивного колострального иммунитета.

С появлением и широким распространением в 90-х годах прошлого века природно-аттенуированного респираторного варианта вируса ТГС это заболевание в Западной Европе стало менее актуальным (5). Однако в США при циркуляции в популяции свиней аналогичного вируса проблема специфической профилактики ТГС не потеряла своего значения (2, 3, 6). Подобная ситуация сохраняется и в России. Новый вариант вируса ТГС, получивший название «респираторный коронавирус свиней» (РКВС), стали использовать для иммунизации свиней против ТГС (4, 6, 7).

Для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней исследователями разных стран используется единая стратегия: активная иммунизация свиноматок с целью пассивной защиты потомства. Однако попытки достичь высокого уровня лактогенного иммунитета против ТГС не увенчались успехом. Для иммунизации было предложено множество различных вакцин и способов их применения, но все они оказались недостаточно эффективными (4). Основной недостаток предложенных ранее вакцин заключался в слабом иммунном ответе у вакцинированных супоросных свиноматок и как следствие недостаточно выраженный колостральный иммунитет у потомства.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения была взята разработанная ранее комбинированная вакцина ТР-1 против ТГС, приготовленная из аттенуированного штамма вируса (1). Вакцина ТР-1 считалась наиболее приемлемым препаратом, который в течение многих лет применялся в промышленном свиноводстве. Данный препарат обеспечивал колостральный иммунитет и сохранность 75-80% 3-5-дневных поросят при контрольном заражении вирулентным штаммом. Проведенные в последующем производственные испытания этого препарата показали, что в случае острого течения ТГС этот препарат обладает недостаточной эпизоотологической эффективностью (заболевание и гибель поросят может составить 40%). Кроме того, ее применение связано с необходимостью интраназального введения супоросным свиноматкам респираторного коронавируса свиней, что является трудно выполнимым техническим приемом.

Технический результат изобретения заключается в повышении специфической активности и эффективности вакцины за счет использования низкопассажного вирулентного штамма вируса ТГС, а также оптимальных условий его выращивания и превращения в инактивированную вакцину. Кроме того, вакцина ТГИ технически отличается от прототипа простотой изготовления и применения.

Предложенная вакцина изготавливается в двух вариантах: эмульгированная (эмульсия типа «вода в масле») и сорбированная (с гидратом окиси алюминия). Вакцина при 2-8°С сохраняет исходную активность не менее 12 месяцев. Вакцину вводят основным и ремонтным свиноматкам внутримышечно, двукратно на 75-80 и 90-100 дне супоросности. Ремонтным свинкам, кроме того, вакцину вводят перед осеменением. Эмульгированную вакцину вводят в дозе 3,0 мл, сорбированную - в дозе 5,0 мл. Свиноматки привитые таким способом становятся иммунными и обеспечивают защиту поросят-сосунов от ТГС. Ниже приведены примеры, подтверждающие эффективность предлагаемого способа.

Пример 1. Для изготовления вакцины штамм «ТВ» вируса ТГС выращивают в культурах клеток свиного происхождения. К вирусу чувствительны перевиваемые линии культуры клеток почки эмбриона свиньи, щитовидной железы и теститкулярной ткани свиньи (ППЭС, СПЭВ, ППК, ПТП и др.). В некоторых культурах указанный штамм накапливается в титре 7,0-8,5 lg ТЦД_50/мл . В качестве производственной линии клеток оказались пригодны: ППК, СПЭВ, ППЭС.

Полученное вирусное сырье инактивируют формалином в концентрации 0,2% в течение 24 часов при температуре 37°С, что обеспечивает полную потерю инфекционной активности вируса. Полноту инактивации проверяют тремя последовательными пассажами в культуре клеток, используемой для выращивания вируса. Предварительно проводят диализ тестируемого сырья (Табл.1).

Таблица 1.
Проверка полноты инактивации вирусного сырья в культуре клеток СПЭВ.
Пассаж	Время культивирования	Наличие ЦПД
1	3-5 суток	-
2	3-5 суток	-
3	3-5 суток	-

Данный способ инактивации является достаточно надежным и в то же время щадящим. Далее инактивированное вирусное сырье смешивают с адъютантом, при необходимости эмульгируют, разливают во флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.

Пример 2. При оптимальных условиях культивирования (происхождение и возраст культуры клеток, способ выращивания клеток и вируса, множественность заражения, продолжительность инкубирования, обработка инфицированной культуры, хранение вирусного сырья) изготовлено 5 серий инактивированной вакцины «ТГИ» (Табл. 2).

Таблица 2.
Накопление и антигенные свойства штамма «ТВ», размноженного в клеточных культурах в производственных условиях.
№ серии	Объем (л)	Титр вируса lg ТЦД50/мл	Сигнал в ИФА в разведении	Титр ВНА у кроликов, привитых вакциной «ТГИ»
1	200	7,0	1:4	1:64-1:128
2	220	7,23-7,6-8,23	1:4	1:64-1:128
3	220	7,0-7,5-8,33	1:8	1:64-1:256
4	220	7,0-7,23-8,33	1:8	1:64-1:128
5	220	7,23-7,5-8,0	1:8	1:64-1:128

Авторский штамм «ТВ» вируса ТГС депонирован в установленном порядке в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (удостоверение №2378 от 23 сентября 2005 г.).

Пример 3. Эпизоотическую эффективность вакцины «ТГИ» испытывали в 4 свинокомплексах, где ТГС установили путем обнаружения специфического антигена в фекальных пробах новорожденных поросят с диарейным синдромом методом ИФА или обнаружением генома вируса ТГС методом ПЦР. Все 4 хозяйства длительное время (более 3-5 лет) неблагополучны по ТГС. Основной мерой борьбы являлась инактивированная вакцина из кишечного вирулентного вируса, полученного от безмолозивных поросят, зараженных в условиях хозяйства. Безопасной и радикальной мерой борьбы с ТГС в хозяйствах является применение инактивированной культуральной вакцины, подтверждением этого служат результаты проведенных испытаний вакцины «ТГИ» (Табл.3). В свинокомплексе №1 привито 213 супоросных свиноматок, от которых получено 1780 деловых поросят (8,8 поросенка на 1 свиноматку). Сохранность поросят при отъеме составила 93%. Разница между применением эмульгированной и сорбированной вакцин «ТГИ» была несущественной. Контролем служили свиноматки, привитые вакциной из кишечного вируса местного производства. От 159 свиноматок контрольной группы получено 1410 поросят (8,8 поросенка на 1 свиноматку). Сохранность поросят составила 82%.

Таблица 3.
Результаты испытания эффективности применения инактивированной вакцины «ТГИ» против ТГС в свинокомплексе №1 (70 тыс.свиней)
№ опыта	Испытуемая вакцина	Привито свиноматок	Родилось поросят	Сохранность поросят (%) в период отъема	Титр ВНА в молозиве свиноматок в день опороса
1	ТГИ - эмульг.	59	466	97,4	1:1280-1:5120
1	ТГИ - сорб.	54	458	98,4	1:1280-1:5120
1	Контроль (Инактивир. из кишечного вируса)	52	467	94,4	1:1280-1:2560
2	ТГИ - эмульг.	100	856	88,7	1:1280-5120
2	Контроль	107	843	84,7	1:1280-1:2560

В свинокомплексе №2 экспериментальной инактивированной культуральной вакциной «ТГИ» привито 160 свиноматок, в том числе эмульгированной вакциной 100 свиноматок, сорбированной - 60 свиноматок. Сохранность поросят в первой и второй группах соответственно составила 87 и 76%. Сохранность поросят в контрольной группе (свиноматки привиты инактивированной вакциной местного производства из вирулентного кишечного вируса) составила 81%, что несколько ниже, чем в группе свиноматок, привитых культуральной эмульгированной инактивированной вакциной «ТГИ» (Табл.4).

Таблица 4.
Эффективность применения инактивированной вакцины «ТГИ» против ТГС в трех хозяйствах
Наименование Хозяйства	Испытуемая вакцина	Привито свиноматок основных	Привито свиноматок ремонтных	Сохранность поросят (%) в период отъема	Титр ВНА в молозиве свиноматок в день опороса
Комплекс №2 (115000 свиней)	ТГИ - эмульг.	80	20	87,3	1:1280-1:2560
Комплекс №2	ТГИ - сорбир.	48	12	76,4	1:1280-1:2560
Комплекс №2	Инактивированная из кишечного вируса (контроль)	80	29	81,7	1:640-1280
Комплекс №3 (50000 свиней)	ТГИ эмульгир.	58	30	91,9	1:1280-1:2560
Комплекс №3	ТГИ сорбир.	60	28	68,3	1:640-1:1280
Комплекс №3	Вакцина ТР-1 (контроль)	63	20	74,6	1:320-1:1280
Комплекс №4 (25000 свиней)	ТГИ эмульгир.	30	30	95,5	Не исслед.

В свинокомплсксе №3 в качестве меры специфической профилактки ТГС систематически использовали вакцину ТР-1. В опыт взято 3 группы свиноматок, которых иммунизировали инактивированными культуральными вакцинами:

1) эмульгированной вакциной «ТГИ»;

2) сорбированной вакциной «ТГИ»;

3) вакциной ТР-1.

Каждой вакциной прививали основных и ремонтных свиноматок согласно наставлению. Эмульгированной вакциной «ТГИ» привито 58 основных и 30 ремонтных свинок. Сохранность поросят к отъему составила 91,9%. Сорбированной вакциной «ТГИ» привито 60 основных и 28 ремонтных свинок. Сохранность поросят к отъему составила 68%. Вакциной ТР-1 привито 63 основных и 20 ремонтных свинок. Сохранность поросят к отъему составила 74% (Табл.4).

В свинокомплексе №4 для профилактики заболевания в последнее время применяли вакцину ТР-1, что позволило значительно снизить отход поросят в подсосный период до 10-15%. Эмульгированной вакциной «ТГИ» привито 60 свиноматок, от которых получен 361 поросенок. К периоду передачи на доращивание отход поросят составил 4-5%. Сохранность поросят в группе основных и ремонтных свиноматок соответственно составила 96 и 95% (Табл.4).

Титр вируснейтрализующих антител в молозиве свиноматок, привитых вакциной «ТГИ», был в пределах 1:640-1:5120 и, как правило, коррелировал с уровнем защиты новорожденных поросят от ТГС (Табл.3 и 4).

Инактивированная вакцина «ТГИ» из вирулентного культурального штамма «ТВ» является безопасным, слабореактогенным препаратом, который по иммуногенности превосходит все известные вакцины против ТГС. Определение уровня антител в молозиве вакцинированных свиноматок в день опороса является надежным лабораторным методом оценки пассивного иммунитета у новорожденных поросят к вирусу ТГС.

Литература

1. Алипер Т.И. Экспериментальная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней (ТР-1), оценка антигенности и оптимизация условий применения, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата вет. наук, Москва, 1987 г.

2. Алипер Т.И. и др. Вопросы вирусологии, 2002 г., 1, 39.

3. Сергеев В.А. и др. Ветеринария, 2003 г., 4, 3.

4. Сох Е. et al. Vaccine, 1993 г., 11, 267.

5. Pensaert M. et al. Vet. Q. 1986 г., 8, 257.

6. Saif L.J., Wesley R.D. Diseases of Swine. 1999 г., 295.

7. Wesley R.D., Woods R.D. Vet. Microbiol, 1993 г., 38, 40.