устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты

Классы МПК:G01N21/63 материал возбуждается оптическими средствами
Автор(ы):, , , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Алексеев Яков Игоревич (RU),
Варламов Дмитрий Александрович (RU),
Коновалов Сергей Владимирович (RU),
Курочкин Владимир Ефимович (RU),
Маракушин Николай Федорович (RU),
Петров Александр Иванович (RU),
Петряков Александр Олегович (RU),
Скоблилов Евгений Юрьевич (RU),
Соколов Валерий Николаевич (RU),
Фесенко Владимир Анатольевич (RU),
Чернышев Андрей Владимирович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2005-06-23
публикация патента:

Изобретение относится к приборам для качественного и количественного анализа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и может быть использовано в медицинской практике при диагностике инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных, в исследовательских целях при молекулярно-биологических, генетических исследованиях, мониторинге экспрессии генов. Устройство содержит термоциклер с теплопроводящим элементом, термокрышкой, устройством автоматического управления температурным режимом, оптической системой. В теплопроводящем элементе имеются углубления для пробирок с реакционными смесями. Оптическая система включает источник излучения, волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок и детектор. Световоды выполнены в виде оптических волокон с коаксиально расположенными центральной частью и периферийной частью для сбора флуоресценции. Центральная часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках. Технический результат - максимальное использование светового потока для возбуждения реакционной смеси, устранение потерь света в пробирке с реакционной смесью, повышение чувствительности и точности анализа. 5 з.п. ф-лы, 3 ил. устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277

устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277

Формула изобретения

1. Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты, содержащее термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку и устройство автоматического управления температурным режимом, и оптическую систему, включающую источник излучения, коаксиальные волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок и детектор для детектирования флуоресценции, отличающееся тем, что центральная передающая свет возбуждения часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках, установленных в углублениях теплопроводящего элемента, при этом апертурное согласование центральной части световода с количеством реакционной смеси в пробирке имеет вид

устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 ,

где устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 - угол светового пучка на выходе из центральной части световода;

d - диаметр поверхности реакционной смеси;

l - расстояние от торца центральной части световода до реакционной смеси, при этом устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 =устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1=устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2, где устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1 и устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2 - апертурные углы на входе осветительной части световода.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что центральная передающая свет возбуждения и периферийная собирающая излучение флуоресценции части световода разделены светонепроницаемой втулкой.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что углубления для пробирок в теплопроводящем элементе покрыты светоотражающим материалом.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что термокрышка снабжена экраном.

5. Устройство по п.4, отличающееся тем, что экран термокрышки термоциклера расположен по периметру крышки или по периметру каждой пробирки.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что торец световода в месте соприкосновения с пробиркой повторяет конфигурацию крышки пробирки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к приборам для качественного и количественного анализа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), широко используемых в медицинской практике и в исследовательских целях, а именно в

- диагностике инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных;

- молекулярно-биологических исследованиях;

- генетических исследованиях;

- мониторинге экспрессии генов с диагностическими и исследовательскими целями и т.д.

Наиболее доступным, достоверным и высокочувствительным из известных методов, позволяющим обнаружить ДНК в пробе и оценить ее количество, является метод термозависимой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией сигнала флуоресценции в реальном масштабе времени, основанным на регистрации изменения количества продукта реакции в экспоненциальной фазе ПЦР, проанализировав которое, можно с высокой точностью определить количество исходной ДНК или РНК в образце.

Для реализации подобного принципа количественных исследований нуклеиновых кислот разработаны и применяются устройства, объединяющие в себе амплификатор, осуществляющий проведение ПЦР, и флуоресцентный детектор, при помощи которого оценивается количество продукта на любой стадии реакции, например приборы ABI Prism 7700, 9700 фирмы "Applied Biosystems" (США), прибор iQ-Cycler фирмы Bio-Rad (США) и др. (проспекты фирм, 2001 г.). Приборы подключены к персональному компьютеру для обработки полученных результатов, при этом общеизвестным является тот факт, что интенсивность флуоресценции в достаточно широких пределах пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения и объему исследуемого вещества, в котором возбуждается флуоресценция.

Известно устройство для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты (заявка РФ №94030458, опубл. 27.06.96, кл. C12Q, 1/62, С12М, 1/36, фирма Хоффман-Ля Рош АГ), содержащее устройство для термоциклирования, включающее в себя теплопроводящий элемент, имеющий множество сформированных в нем углублений для пробирок с реакционными смесями и оптическую систему, включающую источник света, оптически связанный с устройством для термоциклирования, и датчик для одновременного детектирования флуоресценции, излучаемой из каждой реакционной смеси амплификации, одновременно возбужденной световым потоком от источника света.

Оптическая система содержит, помимо источника света, дихроичное зеркало, сменные светофильтры, полевую линзу и затвор, заключенные вместе с детектором в светонепроницаемом кожухе. Реакционные смеси амплификации, каждая из которых содержит специфическую последовательность нуклеиновой кислоты в различных, но известных концентрациях, и флуоресцентное связующее вещество, и реакционные смеси амплификации, содержащие неизвестную концентрацию специфической последовательности нуклеиновой кислоты и флуоресцентное связующее вещество, помещают в пробирки и подвергают термоциклированию параллельно в течение множества циклов по заданной программе. Определяют число циклов, необходимых для каждой реакционной смеси для флуоресценции при некотором показателе интенсивности, и сравнивая число циклов, необходимых для смеси неизвестной концентрации нуклеиновой кислоты, чтобы достичь указанного показателя, с числом циклов, необходимых для ряда смесей известной концентрации нуклеиновой кислоты, чтобы достичь указанного показателя, получают значение начального количества указанной специфической последовательности нуклеиновой кислоты в указанной смеси неизвестной концентрации.

Недостатками известного устройства являются:

- сложность оптической схемы и связанное с этим увеличение ошибки определения;

- неравномерность освещения теплопроводящего элемента, связанная с краевыми эффектами;

- возможность фотодеактивации (обесцвечивания) пробы, не устраняемую даже путем минимизации ее экспонирования с помощью затвора.

Как следствие, все эти недостатки ведут к увеличению ошибки определения или получению недостоверной информации, т.е. значительному снижению точности определения.

Известны способ и устройство, в соответствии с которыми для ввода излучения возбуждения от источника непосредственно в пробирку с реакционной смесью, расположенную в блоке нагревания/охлаждения, используется волоконно-оптический кабель (пат. США №5994056, кл. С12Р, 001/48; C12N, 015/10, 1999 г.).

То же самое волокно используется для возврата флуоресценции назад в детектор (спектрофлуориметр), где считывали величину соответствующей измеряемой флуоресценции, при этом детектор настроен на волну возбуждения 500 нм с шириной полосы 3,4 нм, а эмиссионное излучение детектировалось на длине волны 570 нм с шириной полосы 13,6 нм, а для удаления излучения возбуждения использовался фильтр. Реакция проводилась в полипропиленовых пробирках, кончик которых срезался для прикрепления волоконно-оптического кабеля. Данное устройство позволяет осуществлять регистрацию ПЦР-продукта в режиме реального времени, однако обладает рядом существенных недостатков, а именно:

- поскольку в описанном приборе было использовано только одно оптическое волокно, одновременно могла быть проведена только одна ПЦР-реакция, т.е. низка производительность определения;

- ненадежность соединения волоконно-оптического кабеля для светового входа и флуоресцентного выхода с реакционными пробирками, что приводит к потерям излучения и, как следствие, - уменьшению точности определения.

Ближайшим из известных по технической сущности и назначениию является прибор ABI Prism 7700 компании "Applied Biosystems", США (проспект фирмы 2001 г.), в котором реализован принцип количественных исследований нуклеиновых кислот, основанный на регистрации продукта реакции непосредственно в ходе ПЦР. Данный прибор объединяет в себе амплификатор, осуществляющий проведение ПЦР, и флуоресцентный детектор, при помощи которого оценивается количество продукта на любой стадии реакции. Прибор подключен к персональному компьютеру для конечной обработки полученных результатов. Амплификатор включает в себя термоциклер, представляющий теплопроводящий элемент с расположенными в нем 96 углублениями для пробирок с реакционными смесями, поверх которого расположена термокрышка, и систему для нагрева и охлаждения теплопроводящего элемента, температурный режим которого управляется автоматически компьютером по заданной программе.

Свет возбуждения от источника излучения, в качестве которого используется лазер, передается в каждую из 96 пробирок одновременно с помощью многоканальной матрицы из волоконно-оптических световодов. Свет излучения флуоресценции, излучаемый из каждой пробирки, возвращается обратно по световодам и направляется на детектор-спектрограф с цифровой матрицей ССД-камеры в качестве регистрирующего устройства для сбора и автоматического анализа данных, т.е. оптическая система с множеством волоконно-оптических световодов и с детектором-ССД-камерой, который считывает все подвергаемые термоциклированию пробирки ПЦР.

Описанное выше известное устройство обладает следующими недостатками:

- имеют место потери света в месте соединения волоконных световодов с реакционными пробирками, в углублениях для пробирок, самих пробирках и термокрышке;

- несовершенство конструкции световодов, в результате чего освещается не весь объем реакционной смеси, что ведет к дополнительным потерям и ухудшению условий сбора флуоресценции;

- значительный разброс начальных показателей флуоресценции из различных амплификаций вследствие неоднородности или неравномерности освещения или переменного ослабления флуоресценции вследствие наличия крышек пробирок;

Предлагаемое изобретение решает задачу оптимизации конструкции и тем самым увеличения точности и достоверности определений при одновременном решении вопроса импортозамещения.

Указанная задача решается за счет того, что в известном устройстве для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты, содержащем термоциклер с теплопроводящим элементом с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышкой и устройством автоматического управления температурным режимом, и оптическую систему, включающую источник излучения, волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучений флуоресценции из пробирок, и детектор для детектирования флуоресценции, световоды выполнены в виде оптических волокон, разделенных светонепроницаемой втулкой, причем центральная часть световода апертурно согласована с размером поверхности реакционной смеси в пробирках, установленных в углубления теплопроводящего элемента, покрытых светоотражающим материалом, а периферийная часть световодов жестко закреплена в отверстиях термокрышки термоциклера, снабженной экраном, расположенным по периметру термокрышки либо имеющим форму ячеек, изолирующих каждую реакционную пробирку.

При этом диаметр центральной части световода d1 и периферийной части d 2 связаны соотношением устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 , полный диаметр световода равен или превышает внутренний диаметр пробирки с реакционной смесью, а торец световода в месте соединения с пробиркой повторяет конфигурацию крышки пробирки.

Кроме того, апертурное согласование центральной части световода на входе в пробирки с размером поверхности реакционной смеси в пробирках имеет вид:

устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 ,

где устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 - угол светового пучка на выходе из центральной части световода;

d - диаметр поверхности реакционной смеси в пробирке;

l - расстояние от торца центральной части световода до реакционной смеси в пробирке, при этом устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 =устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1=устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2, где устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1 и устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2 - апертурные углы на входе осветительной части световода.

В качестве детектора в заявляемом устройстве применен флуориметр с многоканальным фотоприемником, считывающим результат флуоресценции, излучаемой каждой реакционной смесью из каждой пробирки множества амплификаций, одновременно возбужденных световым потоком, передаваемым от источника световодом.

Коаксиальное выполнение световодов, форма их в виде части полусферы, повторяющая конфигурацию крышки пробирки, апертурное согласование центральной части световода с источником излучения и уровнем реакционной смеси в пробирках термоблока направлены на концентрацию светового потока и устранение его потерь, что в конечном итоге ведет к повышению чувствительности измерений и их воспроизводимости.

Покрытие углублений для пробирок светоотражающим материалом преследует ту же цель.

Наличие экрана, расположенного по периметру термокрышки либо имеющего ячеистую форму в виде ячейки для каждой пробирки, кроме указанной выше цели дает возможность выровнять тепловой режим для всех реакционных пробирок, защитив зазор от случайных воздушных потоков, что также приводит к повышению чувствительности и достоверности измерений.

Изобретение поясняется чертежами, на которых представлены

на фиг.1 - принципиальная схема заявляемого устройства для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты;

на фиг.2 - в увеличенном виде одна из множества пробирок из секции проб с реакционной смесью;

на фиг.3 - оптическая схема заявляемого устройства и увеличенный узел сопряжения световода с реакционной пробиркой.

Заявленное устройство для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты (фиг.1) состоит из амплификатора, включающего в себя устройство для термоциклирования 1 с секцией проб 2, флуориметрического детектора 3 с источником излучения 4 и приемником излучения 5 в виде многоканального фотоприемника, микропроцессорного устройства управления 6 и персонального компьютера с программным обеспечением 7.

Одна из множества пробирок из секции проб 2 с реакционной смесью в увеличенном виде (фиг.2) состоит из пробирки 8 с реакционной смесью 9, установленной в углублении с отражающим покрытием 10. Углубление выполнено в теплопроводящем элементе 11 (термостатируемое основание).

Пробирка 8 прижимается сверху термокрышкой 12, по периметру термокрышки или каждой из пробирок установлен тепловой экран 13. В термокрышке 12 имеются отверстия, в которые вставляются концы световодов 14, выполненных коаксиальными с центральной и периферийной частями, разделенными светонепроницаемой втулкой 15. Торцы световодов повторяют форму крышки 16 пробирки 8 и плотно прилегают к ней.

Оптическая схема заявляемого устройства (фиг.3) состоит из источника излучения 4, в качестве которого используется галогенная лампа, двух двухлинзовых конденсоров 17 и 18, между линзами которых установлены интерференционные светофильтры возбуждения 19 и эмиссии 20, световодного жгута 21 и приемника излучения 5, в качестве которого использован многоканальный фотоприемник. Увеличенный узел оптической схемы I на фиг.3 показывает сопряжение окончания (торца) каждого световода, входящего в жгут, с крышкой 16 пробирки 8 с реакционной смесью 9. Каждый световод выполнен коаксиальным с центральной частью диаметром d 1, по которой к реакционной смеси доставляется излучение возбуждения от источника излучения, и периферийной частью диаметром d2, по которой излучение флуоресценции доставляется к приемнику излучения. Здесь же показаны апертурные углы на входе осветительной части световода устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1 и устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2 и угол светового пучка на выходе из центральной части световода в реакционную пробирку устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 , равные между собой, а также расстояние от торца центральной части световода до реакционной смеси l и диаметр поверхности реакционной смеси d, согласованные между собой в соответствии с формулой:

устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277

Заявляемое устройство работает следующим образом.

Множество стандартных ПЦР-ных реакционных пробирок 8 (фиг.2), каждая из которых содержит реакционную смесь 9, например нуклеиновую кислоту для амплификации, и соответствующий набор химических реагентов, размещают в углубления для пробирок теплопроводящего элемента 11 термоциклера. Углубления для пробирок теплопроводящего элемента покрыты светоотражающим материалом 10 с высоким коэффициентом отражения в области 400-700 нм, что обеспечивает значительное увеличение сбора флуоресценции. Реакционные ПЦР-ные пробирки с исследуемыми пробами уплотняют крышками 16, секцию с пробирками закрывают термокрышкой 12, снабженной тепловым экраном 13, расположенным на термокрышке по периметру или в виде ячеек для каждой исследуемой пробирки.

Термокрышка служит для выравнивания температур по всей длине пробирки в теплопроводящем элементе и предотвращения парообразования и оседания пара на крышке пробирки 16, ведущим к потерям излучения флуоресценции.

Установка теплового экрана по периметру термокрышки или в виде ячеек для каждой пробирки дает возможность выровнять температуры внутри теплопроводящего элемента и устранить влияние наружных засветок на результаты измерений.

Волоконный световод 14 (фиг.3), выполненный коаксиально с центральной частью диаметром d1 и периферийной частью диаметром d2, разделенными светонепроницаемой втулкой 15, вводят в отверстие в термокрышке 12 и плотно прижимают к крышке пробирки 16. Торцевая часть световода, выполненная в виде части полусферы, плотно прилегает к крышке пробирки, повторяя ее конфигурацию, что значительно снижает потери флуоресцентного излучения в месте контакта.

Далее запускают устройство для термоциклирования по заранее установленной программе циклов нагревание/охлаждение и включают источник излучения.

Свет от источника излучения - галогенной лампы 4 (фиг.3), пройдя через расположенные на одной оптической оси двухлинзовый конденсор 17 и расположенный между его линзами интерференционный светофильтр возбуждения 19, фокусируется на торец световодного жгута 21, при этом углы устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1 - апертурный угол на выходе от источника и устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2 - апертурный угол на входе осветительной части световода равны (устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1=устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2).

Сфокусированный свет по центральным частям коаксиальных волоконных световодов с диаметром d1 направляется в пробирку с реакционной смесью, а по периферийным частям с диаметром d 2 излучение флуоресценции собирается и направляется на приемник излучения, при этом соотношение центральной и периферийной частей световода, установленное экспериментально устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 , обеспечивает оптимальные условия для возбуждения флуоресценции и ее сбора, т.е. центральная часть коаксиального световода используется для подвода возбуждающего излучения, а периферийная часть, отделенная от центральной d1 втулкой, для сбора излучения флуоресценции из реакционной пробирки. Центральная часть световода на входе в пробирку апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирке следующим соотношением, соответствующим законам геометрической оптики и подтвержденным результатами многочисленных экспериментов:

устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 ,

где устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 - угол светового пучка на выходе из центральной части световода в пробирку;

d - диаметр поверхности реакционной смеси;

l - расстояние от торца центральной части световода до реакционной смеси в пробирке, при этом устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 =устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1=устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2, где устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1 и устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2 - апертурные углы на входе осветительной части световода.

При данном соотношении обеспечивается максимальное использование светового потока для возбуждения реакционной смеси, устраняются любые потери света в пробирке, т.е. обеспечивается оптимальное возбуждение флуоресценции и т.о. достигается высокая чувствительность анализа. При этом обеспечивается полная засветка всего объема светом высокой интенсивности, а в результате многократного отражения от стенок пробирки и светоотражающего покрытия углублений для пробирок возрастает интенсивность возбуждения реакционной смеси.

Увеличение или уменьшение расстояния до поверхности реакционной смеси, выходящее за пределы оптимального соотношения в соответствии с формулой, приводит к уменьшению сигнала флуоресценции, что подтверждается экспериментальными данными. Не приводит к увеличению сигнала и увеличение входной апертуры устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 2, которая для световодов равна апертуре выходного пучка устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 1, что также подтверждается экспериментальными данными и расчетным путем, исходя из объема пробирки и реального количества реакционной смеси в ней, которое составляет 10-100 мкл, что при заявленном соотношении соответствует углу устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 в пределах 8°<устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени   множества амплификаций нуклеиновой кислоты, патент № 2304277 <25°.

Собранное излучение флуоресценции из пробирки проходит через двухлинзовый конденсор 18, между линзами которого расположен интерференциальный светофильтр эмиссии 20, и поступает на приемник излучения 5, в качестве которого использован многоканальный фотоприемник, на который попадает свет флуоресценции от всех пробирок.

Сигнал с многоканального фотоприемника поступает на микропроцессорное устройство управления 6, где осуществляется первичная обработка полученных сигналов, формирование пакета данных, буферизация пакетов данных и передача пакетов данных в управляющий компьютер 7.

Входной усилитель микропроцессорного устройства (МПУ) преобразует фототок в напряжение и усиливает его. Аналого-цифровой преобразователь (АЦП) преобразует полученное напряжение в код. Обработав сигналы от всех исследуемых пробирок МПУ, формирует пакет данных для передачи в компьютер для последующей обработки. Таким образом, пакет данных содержит информацию о величине сигнала флуоресценции каждой из исследуемых пробирок, значение температуры амплификатора, при которой были получены данные. Заявляемый прибор позволяет произвести смену возбуждающих и регистрирующих светофильтров. Турели со светофильтрами приводятся в движение с помощью шаговых двигателей.

Алгоритм работы прибора можно описать следующим образом: с помощью управляющей программы на компьютере задаем режим работы прибора - циклограмму изменения температуры, возбуждающие и регистрирующие светофильтры для системы регистрации. По команде "Старт" амплификатор отрабатывает заданную температуру, устанавливается первый возбуждающий и регистрирующий светофильтры. Производится регистрация флуоресценции из исследуемых пробирок, одновременно формируется пакет данных для передачи в компьютер. Производится смена возбуждающего и регистрирующего светофильтров, производится регистрация флуоресценции из исследуемых пробирок для новых условий регистрации. После перебора всех заданных комбинаций светофильтров производится, если определено, изменение температуры амплификатора. Цикл работы прибора повторяется.

Сканирование исследуемых реакционных пробирок может быть осуществлено с помощью оптического коммутатора, состоящего из двухлинзового объектива и плоского зеркала, расположенного под углом 45° к оптической оси. При вращении объектива, жестко связанного с зеркалом, вокруг оптической оси осуществляется процесс сканирования. Регистрация сигнала в этом варианте устройства осуществляется одноканальным фотоэлектронным умножителем, на который последовательно попадают сигналы флуоресценции от всех реакционных пробирок. Время накопления сигнала от одной пробирки составляет ориентировочно 0,1 секунды.

Использование в основном варианте многоканального фотоприемника исключает необходимость использования оптической коммутации каналов.

Предлагаемое устройство, позволяющее проводить не только качественное, но и количественное определение специфической ДНК (РНК) в исследуемом объекте непосредственно в ходе ПЦР, благодаря своим конструктивным отличиям позволяет свести до минимума потери света от источника излучения до пробирок с реакционными смесями, исключить случайные факторы, такие как изменение условий передачи света в результате пульсаций напряжения, конвективные случайные воздушные потоки - на результаты амплификации исследуемых веществ и конечные результаты измерений, и соответственно повысить точность измерений и их информативность.

Источники информации

1. Заявка РФ №94030458, кл. С12М, 1/36, приоритет 25.08.1994 г., опубл. 27.06.1996 г. Устройство для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты и способ количественного анализа специфической последовательности нуклеиновой кислоты в пробе, заявитель - Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ (Швейцария).

2. Патент США №5994056, кл. С12Р, 001/48, C12N, 015/10, 1999 г.

3. Прибор ABI Prism 7700 фирмы "Applied Biosystems", США (проспект прибора, 2001 г.)

Класс G01N21/63 материал возбуждается оптическими средствами

способ измерения концентрации кислорода в газовых смесях -  патент 2523756 (20.07.2014)
способ оптического мониторинга поверхности в области воздействия лазерного излучения и устройство для его осуществления -  патент 2520944 (27.06.2014)
люминесцентный способ определения самария -  патент 2514190 (27.04.2014)
люминесцентный способ определения тербия -  патент 2506569 (10.02.2014)
способ измерения в режиме реального времени толщины пленки не содержащего хром покрытия на поверхности полосовой стали -  патент 2498215 (10.11.2013)
способ контроля степени сшивки полиэтилена -  патент 2492451 (10.09.2013)
измерительное устройство для определения по меньшей мере одного параметра пробы крови -  патент 2468355 (27.11.2012)
способ определения профиля распределения концентрации носителей заряда в полупроводниковой квантово-размерной структуре -  патент 2464548 (20.10.2012)
устройство для контроля примесей в сточных водах -  патент 2460993 (10.09.2012)
способ измерения яркостной и цветовой температуры поверхности в области воздействия лазерного излучения и устройство для его осуществления -  патент 2460992 (10.09.2012)
Наверх