способ определения и разделения жирных кислот

Формула изобретения

Способ определения и разделения жирных кислот в биологических тканях крови организма, включающий обработку крови хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината (ДЭГС), нанесенного на колонку, отличающийся тем, что гидролиз и метилирование липидов проводят в течение 3 ч, для газохроматографического определения и разделения жирных кислот используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, которую перед нанесением на нее ДЭГС многократно промывают органическими растворителями хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, ДЭГС наносят на внутреннюю стенку капиллярной колонки динамическим методом, при котором жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную колонку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, где толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, затем проводят продувку колонки азотом 5-6 ч на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, а газохроматографическое определение и разделение жирных кислот осуществляют при температуре термостата колонки 140°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот (ЖК) в биологических тканях организма.

Известен способ оценки спектра ЖК (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов во влажной камере в течение 6 часов с разделением ЖК с помощью полярной жидкой фазы 20% диэтиленгликольсукцината (ДЭГС) на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С. Однако этот способ имеет недостаточную чувствительность регистрации жирных кислот при их низком содержании в тканях организма.

Задача изобретения: повышение чувствительности определения и разделения ЖК.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС, после промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС: жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, после этого проводят продувку колонки азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, гидролиз и метилирование проводят в течение 3 часов с разделением жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината, нанесенного на капиллярную колонку, при температуре колонки термостата 140°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Для анализа используют 0,5 мл плазмы крови, эритроцитов, тромбоцитов. Выделение общих липидов плазмы крови осуществляют так же, как и в способе оценки жирных кислот (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, объемом 10 мл по методу Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem, - 1957. - V.226. - P.497-509). После выпаривания нижнего слоя, содержащего экстрагированные липиды в хлороформе, в токе газообразного азота проводят этап метилирования с одновременным гидролизом липидов с целью получения летучих продуктов, анализируемых на газовом хроматографе. Для этого сухой липидный экстракт, разведенный в 0,5 мл хлороформа, переносят в виалы, снабженные герметически закрывающимися крышками, куда добавляют 2 мл метанола и 0,1 мл серной кислоты (особо чистой) и перемешивают. Пробы плотно закрывают крышками, помещают во влажную камеру и переносят в сушильный шкаф на 3 часа при температуре 80°С. Через 3 часа в охлажденную метилированную пробу добавляют 2 мл гексана и 1 мл дистиллированной воды. Пробу отстаивают в течение 30 мин, затем собирают верхний слой, содержащий метилированные эфиры жирных кислот в гексане, переносят в остроконечную колбу и высушивают досуха в токе газообразного азота на водяной бане при температуре 37°С.

Приготовление капиллярной колонки с полярной жидкой фазой диэтиленгликольсукцинат (ДЭГС): используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м. Перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС. После промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС. При этом жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота. Затем растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм. После этого проводят продувку азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С.

Для анализа метиловых эфиров жирных кислот общих липидов плазмы крови используют газовый хроматограф «Кристалл 2000 М». Для этого в образец добавляют 0,05 мл гексана, из полученного объема в инжектор хроматографа вносят 1 мкл пробы. Использовали режимы термостата колонки 140, 180 и 200°С. Идентификацию жирных кислот проводят с использованием стандартной смеси жирных кислот в концентрации 1 мкг/мл гексана по времени удерживания каждой жирной кислоты (производство стандартов метиловых эфиров жирных кислот фирмы «Serva», Германия).

В таблице 1 показана зависимость уровня регистрации ЖК от температуры колонки.

Таблица 1 Зависимость уровня регистрации ЖК плазмы крови человека от температуры термостата колонки в предлагаемом способе.
Название ЖК	Содержание ЖК выражено площадью, мм2
	температура 180°C.	температура 140°C.	температура 200°С.
Лауриновая	0,801±0,215	11,93±5,62*	Не определяется
Миристиновая	2,263±0,492	0,001±0,0004**	Не определяется
Пальмитиновая	53,126±11,159	69,68±14,31**	40,68
Пальмитолеиновая	0,016±0,005	12,97±3,34*	5,56
Стеариновая	6,851±1,353	14,21±0,92***	1,34
Олеиновая	9,177±1,978	34,84±2,26***	36,92
Линолевая	16,61±2,873	26,94±1,56***	Не определяется
Линоленовая	0,627±0,333	1,03±0,88	Не определяется
Эйкозеновая	0,991±0,368	4,99±1,32*	Не определяется
Эйкозотриеновая	1,165±0,246	18,71±4,41**	14,67
Арахидоновая	0,801±0,349	4,62±1,54*	1,62
Эйкозопентаеновая	6,511±2,075	46,14±12,47*	7,14
Докозогексаеновая	1,055±0,413	0,86±0,29	5,9
Общая площадь	99,995	246,92	113,83

Примечание:

Как показывают результаты таблицы 1, температура 140°С термостата колонки наиболее оптимальна по сравнению с 200°С и 180°С для разделения и регистрации ЖК. Общий уровень при температуре 140°С, по сравнению с другими температурными режимами, в 2,2-2,5 раз соответственно выше (Табл.1, общая площадь)

На фиг.1. отображена хроматограмма ЖК на стеклянной колонке с диэтиленгликольсукцинатом на хроматоне N-AW-DMCS. При разделении и регистрации ЖК в количестве, эквивалентном их содержанию в 10 мкл плазмы или при разведении в 100 раз, показана идентификация 5 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой. Совсем не идентифицируются при данном разведении эйкозеновая, эйкозотриеновая, арахидоновая, эйкозопентаеновая и докозогексаеновая ЖК.

На фиг.2. отображена хроматограмма ЖК на капиллярной колонке с диэтиленгликольсукцинатом. При определении той же концентрации ЖК показана идентификация 10 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, пальмитолеиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, арахидоновой, эйкозопентаеновой и докозогексаеновой. То есть по предлагаемому способу при данном разведении идентифицируется в 2 раза больше ЖК.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика определения эквивалентных количеств жирных кислот в прототипе и предлагаемом способах, выраженная в площади каждого пика (мм²). Из таблицы видно, что количественный уровень регистрации ЖК, в сравнении с прототипом, возрос от 5,33 до 615,22 раз. В целом чувствительность предлагаемого нами способа возрастает в среднем в 34,95 раза.

Таблица 2 Сравнительная характеристика определения жирных кислот плазмы в существующем и предлагаемом способах (мм2)
Название ЖК	Прототип	Предлагаемый способ	Соотношение уровня регистрации жирных кислот
Лауриновая	0,012±0,003	0,801±0,215*	66,75
Миристиновая	0,012±0,002	2,263±0,492**	188,58
Пальмитиновая	2,198±0,957	53,126±11,15**	24,17
Пальмитолеиновая	0,003±0,001	0,016±0,005*	5,33
Стеариновая	0,015±0,005	6,851±1,353**	456,66
Олеиновая	0,250±0,106	9,177±1,978**	36,7
Линолевая	0,027±0,017	16,611±2,873*	615,22
Линоленовая	0,003±0,002	0,627±0,333**	209
Эйкозеновая	0,143±0,142	0,991±0,318**	6,93
Эйкозотриеновая	0,064±0,027	1,165±0,246*	18,2
Арахидоновая	0,080±0,035	0,801±0,349*	10,1
Эйкозопентаеновая	0,035±0,010	6,511±2,075*	186,02
Докозогексаеновая	0,019±0,006	1,055±0,413*	55,52
Общая сумма	2,861	99,99	34,95
Примечание: В таблице приведены средние данные по ЖК плазмы, взятой от 5 человек. Достоверность отличий предлагаемого способа от существующего р<0,05 - *; р<0,01 - **.

В таблице 3 показана возможность определения спектра ЖК предлагаемым способом в других тканях организма: эритроцитах, тромбоцитах.

Таблица 3 Возможность определения жирных кислот предлагаемым способом в других тканях организма.
Название ЖК	Регистрируемый уровень ЖК в площади, мм2
	Эритроциты	Тромбоциты
Лауриновая	26,405	16,45
Миристиновая	33,99	27,13
Пальмитиновая	19,08	10,8
Пальмитолеиновая	0,98	0,01
Стеариновая	3,51	2,53
Олеиновая	3,58	3,15
Линолевая	4,24	1,67
Линоленовая	1,70	1,4
Эйкозотриеновая	7,70	1,63
Арахидоновая	0,01	0,01
Эйкозопентаеновая	2,24	1,69
Докозогексаеновая	4,17	1,23
Общая площадь	107,605	67,7
Примечание: Уровень ЖК определяется в пробах, содержащих 9,42·10 7 эритроцитов, 75,2·105 тромбоцитов, при температуре термостата колонки 140°С.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения и разделения ЖК в биологических тканях организма в среднем в 34,95 раз.