способ определения стволовых клеток молочной железы животных in vitro

Формула изобретения

Способ определения стволовых клеток молочной железы животных in vitro, включающий выделение клеток молочной железы и последующую их обработку красителем Hoechst 33342, отличающийся тем, что после выделения клеток молочной железы проводят их культивирование на субстрате в течение 2-3 суток, затем обрабатывают клетки красителем непосредственно на субстрате и микроскопируют в ультрафиолетовом свете с длиной волны 350 мм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к клеточной инженерии, в частности к способам определения стволовых клеток молочной железы животных.

Известен способ определения стволовых клеток в органах животных по таким морфологическим признакам, как наличие диффузного хроматина в ядре, имеющем одно или несколько ядрышек, наличие большого числа свободных рибосом в цитоплазме и незначительное количество других органелл, а также присутствие у многих стволовых клеток цитоплазматических отростков (Гурвич А.Е., Егоров И.К., Кяйвяряйнен А.И. Иммуногенез и клеточная дифференцировка. - М.: Наука, 1978. - 232 с. Райцина С.С. Идентификация стволовых клеток в некоторых системах клеточных дифференцировок у млекопитающих / Успехи современной биологии, 1980, Т.90, вып. 1(4). - с.123-137.). Выявление таких клеточных особенностей в ряде случаев носит затруднительный характер, так как связано с использованием дорогостоящего оборудования, кроме того, клетки с подобным фенотипом не всегда являются стволовыми.

Известен способ определения стволовых клеток животных с использованием флуоресцентного красителя Hoechst 33342, основанный на способности стволовых клеток после обработки Hoechst 33342 флуоресцировать при прохождении света с определенной длиной волны (Goodell М. et al. Hoechst 33342 HSC Staining and Stem cell Purification Protocol. J. Exp. Med. 183, 1996. - P. 1797-1806. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation // Nature. 401, 1999. - S.390-394. Jackson K.A., Mi Т., Goodell M.A. Haematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1999. - S.14482-14486.).

Известен способ определения стволовых клеток молочной железы животных посредством трансплантации ее небольшого кусочка в жировую подушку этого органа мыши с последующим развитием полнофункциональной железы (DeOme K.B., Faulkin L.J., Bern H.A. et al. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice // Cancer Res. 19, 1959. - P.515-520. Daniel C.W., Young L.J.T., Medina D. et al. The influence of mammogenic hormones on serially transplanted mouse mammary gland // Exp. Geront. 6, 1971. - P.95-101.). Этот метод позволяет лишь доказать присутствие стволовых клеток в молочной железе, но не позволяет выделить их и детально охарактеризовать морфологические свойства.

Известен способ определения стволовых клеток молочной железы животных путем предварительного мечения клеток и их трансплантации в молочную железу с последующим анализом их локализации (Cordon B.C., Smith G.H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell // Development. 125, 1998. - P.1921-1930. Welm B.E., Tepera S.B., Venezia Т. et al. Sea-^1pos Cells in the Mouse Mammary Gland Represent an Enriched Progenitor Cell Population // Developmental Biology. 245, 2002. - P.42-56. Williams J.M., Daniel C.W.Mammary ductal elongation: Differentiation of myoepithelium and basal lamina during branching morphogenesis // Dev. Biol. 97, 1983. - P.274-290. Smith G.H., Medina D.A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland // Journal of Cell Science. 89, 1988. - P.173-183.). С помощью этого метода можно определить, в какой тип клеток происходит дифференциация стволовых клеток.

Известен способ определения стволовых клеток животных in vitro no повышенной активности щелочной фосфатазы (Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. - Дубровицы, 1999. - 95 с.). Это свойство характерно для всех стволовых клеток и часто используется для доказательства принадлежности клеток к этой группе. К недостаткам этого метода относится невозможность дальнейшей работы с клетками, так как в процессе анализа они погибают.

Известен способ определения стволовых клеток в молочной железе животных, взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что суспензию свежевыделенных клеток обрабатывали Hoechst 33342, а затем на проточном цитометре отбирали клетки с характерным свечением в ультрафиолете (УФ) (Kenney N.J., Smith G.H., Lawrence E. et al. Identification of stem cell units in the terminal end bud and duct of the mouse mammary gland // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1:3, 2001. - S.133-143.). Данный метод позволяет не только идентифицировать стволовые клетки, но и сортировать их для дальнейшей работы. Однако в этом случае судить о морфологии клеток in vitro не представляется возможным, так как способ не позволяет осуществлять последующую селекцию стволовых клеток по морфологическим характеристикам.

При создании настоящего изобретения задача заключалась в том, чтобы разработать способ, позволяющий определять стволовые клетки in vitro с последующим учетом их морфологических признаков.

Технический результат изобретения заключается в том, что предложен способ определения стволовых клеток молочной железы животных in vitro, включающий выделение клеток молочной железы и последующую их обработку Hoechst 33342, особенностью которого является то, что после выделения клеток молочной железы проводят их культивирование, а затем, не снимая с субстрата, обрабатывают красителем Hoechst 33342.

Для прижизненной идентификации и селекции стволовых клеток в молочной железе предложено использование флуоресцентного красителя Hoechst 33342 для определения стволовых клеток молочной железы в монослое.

Пример. Стволовые клетки в монослое выявляли путем применения следующих процедур:

1) отбирали ткань молочной железы крольчих сразу после забоя животных или прижизненно методом биопсии;

2) проводили истощение тканей посредством измельчения материала и последующей обработки 0,1% раствором коллагеназы в течение 30-40 мин при 37°С, а затем 0,25% раствором трипсина в течение 10-15 мин при 37°С;

3) осаждали клетки центрифугированием при 1 тыс. об/мин в течение 5 минут;

4) полученную первично трипсинизированную культуру клеток молочной железы выращивали в среде DMEM/F-12 1:1 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS), 2mM -глутамина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 5 мг/мл инсулина и гентамицина с конечной концентрацией 50 мкг/мл при 37°С в атмосфере с 5% СО₂;

5) после кратковременного культивирования в течение 2-3 суток клетки, не снимая с субстрата, обрабатывали Hoechst 33342 следующим образом. Ростовую среду сливали, промывали подогретой средой DMEM без сыворотки, затем заливали клетки подогретой средой DMEM с 2% FCS и 10 mM HEPES, дополненную Hoechst 33342 с конечной концентрацией 5 мкг/мл. Окрашивание производили в течение 90 мин при 37°С. Затем клетки заливали холодным раствором Хэнкса с 2% FCS и 10 mM HEPES и микроскопировали в УФ с длиной волны 350 нм.

Клетки, окрашенные Hoechst 33342, идентифицировали по характерному красному свечению (фильтр Hoechst Red).

Контрольное использование предложенного способа для идентификации стволовых клеток в монослое показало, что Hoechst-положительные клетки идентифицировались только среди клеток со стволово-подобным фенотипом, при этом не все клетки с характерным фенотипом флуоресцировали.

В культуре клеток молочной железы кроликов было отмечено три типа клеток: крупные и мелкие круглые клетки с большим ядром и узким ободком цитоплазмы, которые интенсивно окрашивались по Гимза, фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму. С использованием предложенного нами способа было установлено, что стволовые элементы молочной железы кролика идентифицируются среди мелких круглых клеток с большим ядром и узким ободком цитоплазмы (чертеж), причем в процессе культивирования их число снижается (табл.).

Таблица. Распределение типов клеток (%) in vitro в зависимости от пассажа.
Пассаж	Фибробластоподобные	Крупные круглые	Мелкие круглые
			всего	из них Hoechst - «+»
I	49,6	19,9	30,5	47,21
II	49,8	35,7	14,5	88,28
III	68,6	23,5	7,8	69,23

Коэффициент корреляции между числом мелких круглых клеток и Hoechst-положительных клеток был довольно высоким и составил 0,832.

Предложенный нами способ может быть использован в биотехнологии животных для витальной идентификации стволовых клеток молочной железы с целью их последующего использования для трансплантации, клонирования и т.п. Предложенный нами способ в сочетании с методом выделения Hoechst-положительных клеток, например с использованием проточной цитометрии или какого-либо другого метода, позволит повысить результативность работ в области клеточной терапии и клонирования с использованием клеток молочной железы.