штамм aerococcus viridans n167k, который проявляет противомикробную активность, и лекарственное средство на его основе

Формула изобретения

1. Штамм Aerococcus viridans B-7069 ИМВ HAH Украины, проявляющий антимикробную активность.

2. Лекарственное средство, проявляющее антимикробную активность, характеризующееся тем, что оно содержит терапевтически эффективное количество лиофилизированных вегетативных клеток штамма Aerococcus viridans B-7069 ИМВ HAH Украины и фармацевтически приемлемый носитель.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к новым штаммам микроорганизмов-пробиотиков и медицинских препаратов на их основе.

Бактериотерапия и бактериопрофилактика инфекций разнообразной этиологии и локализации, а также патологические процессы неинфекционного происхождения приобретают все большую актуальность в связи с возрастанием понимания роли. нормальной микрофлоры для организма человека в процессах неспецифичной резистентности к инфекциям, в формировании иммунных ответов, антагонистической роли микрофлоры, участия в регуляции метаболических процессов, а также в связи с выявлением их антидотии, антиоксидантной, антиканцерогенной роли в макроорганизме.

На сегодня существует большое количество биопрепаратов для внутреннего применения, которые как активный агент содержат известные штаммы микроорганизмов, например такие как бифидум-, лакто- и колибактерин.

Основным фактором эффективности бифидумбактерина является антагонистическая активность, обусловленная сильным кислотообразованием, продуцированием лизоцима.

Механизм действия лактобактерина близкий к бифидумбактерину и также предопределяется сильным кислотообразованием. Этот препарат наиболее действенный при лечении острых и хронических кишечных инфекций, коррекции дисбактериозов.

Поскольку названные препараты содержат штаммы-представители исключительно индигенной микрофлоры кишечника, которые осуществляют свое антагонистическое действие и антагонистическую способность колонизации только для слизистых оболочек кишечника, область их применения узкая и ограничивается лечением и профилактическим влиянием при инфекциях кишечника.

В основу группы изобретений, которая заявляется, поставлена задача расширить ассортимент биологических препаратов, которые содержат лиофилизированные жизнеспособные клетки бактерий и носитель и отличаются более широким спектром действия.

Указанную задачу решает штамм Aerococcus viridans №167К [Депозитарий Института микробиологии и вирусологи НАН Украины, ул. Заболотного, 154, Киев-143, 03143; 20 июня 2002 г.; регистрационный номер-Aerococcus viridans IMB В-7069, сокращенно - р.н. ИМВ В-7069] для изготовления врачебных препаратов, косметических средств и биоактивных добавок.

Наиболее близким штаммом к предложенному является штамм Aerococcus viridans №167 (рег. номер ИМВ В-7041), выделенный из грудного молока. Однако использование этого штамма не всегда эффективно из-за недостаточной технологичности и умеренной биологической активности.

В основу изобретения поставлена задача получить более продуктивный штамм Aerococcus viridans (путем использования методов аналитической селекции) с высокими адгезивными свойствами и широким спектром антагонистического действия.

Поставленная задача решена путем получения нового штамма Aerococcus viridans №167К, выделенного методами аналитической селекции из штамма Aerococcus viridans №167 (р.н. ИМВ В-7041) и депонированного в коллекции Института микробиологии и вирусологи (ИМВ) HAH Украины под номером ИМВ В-7069. Штамм идентифицирован по "Краткому определителю бактерий" Берги.

В результате селекционной работы вышеупомянутый штамм приобретает такие культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства, которые и обеспечивают его высокую производительность при лечении и профилактике заболеваний слизистых оболочек и кожных покровов.

Культурально-морфологические свойства штамма.

Грамположительные кокки, недвижимые, 1-2 мкм в диаметре, которые располагаются парами или нерегулярными сосредоточениями. Клеточная стенка состоит из двух электронно-плотных и одного менее плотного промежуточного пласта. Толщина цитоплазматической мембраны 200-400А. Цитоплазма клеток имеет гетерогенный характер. Она заполнена мелкими гранулами, полирибосомами, сконцентрированными вокруг мезосом или ядерных образований.

Колонии аэрококков на плотном питательном агаре круглые, 0,5-1,0 мм в диаметре, полупрозрачные, белые или серые, иногда бусинкоподобные. На кровяном агаре колонии аэрококков имеют большие размеры, окруженные зоной позеленения, возможно, в результате действия лактат-оксидазы. Рост в питательном бульоне сопровождается гомогенным помутнением, которое имеет тенденцию превращаться в зернистый осадок.

Рост аэрококков зависит от наличия в среде биотина, пантотеновой и никотиновой кислот. Штамм не требует для своего роста витаминов группы "В": тиамина, рибофлавина, пиридоксина, фолиевой и флавоновой кислот. Tween-80 заменяет потребность в биотине.

Для роста аэрококков необходимы экзогенные пурины. Гуанин и ксантин взаимозаменяемые с аденином. Штамм не имеет потребности в экзогенных пиримидинах. Потребность в аминокислотах вариабельна.

Потребность для роста в биотине, никотиновой, пантотеновой кислотах, пуринах и независимость от наличия в среде витаминов группы "В", отличает аэрококки от других грамположительных кокков, например педиококков, которые требуют фолиевую кислоту, или стрептококков - потребность в тиамине.

Биохимическая активность.

При культивировании на молоке с 1,0% метиленовым синим не восстанавливают последний, подкисляют молоко при отсутствии свертывания, желатин не разрежают, аргинин, крахмал, эскулин не гидролизуют. Аэрококки продуцируют кислоту, но не газ, при культивировании на средах с глюкозой, мальтозой, лактозой, манитолом, сахарозой. Ацетоин не образовывают, рафинозу не сбраживают, каталазу не продуцируют, коагулазу не образовывают. При культивировании в глюкозном (1%) бульоне - конечное рН 5,1-5,8 и рост микроаэрофильный. При аэробном росте продуцируют пероксид водорода.

Каталазная активность аэрококков может иметь негеминовый характер. Аэрококки содержат фермент, который защищает их от супероксидных радикалов - супероксидную дисмутазу, кофактором которой является марганец. По кислородостойкости аэрококки занимают второе место после S.faecalis и находятся перед Е.coli.

Максимальная продукция перекиси водорода культурами аэрококков отмечается в ранний период логарифмической фазы культуры. У аэрококков - сильных продуцентов пероксида водорода стационарная фаза развития культуры непродолжительная. Отмечается их высокая чувствительность к антибиотикам.

Химический состав.

Клеточная стенка аэрококков содержит глюкозу, галактозу, галактозамин и не содержит рамнозу, глицерол или рибитол. Определено одинаковое содержание Г+Ц пар в ДНК аэрококков и педиококков, равный 41-43%. Содержание Г+Ц пар в ДНК аэрококков колебалось в границах 39,5-42,0%. У аэрококков, выделенных из грудного молока, содержимое Г+Ц пар - 39,9-42,0%, из коровьего - 39,5-41,6%.

Биологические свойства

Антагонистическую активность штамма Aerococcus viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) проверяют по отношению 9 тест-штаммов -Staphylococcus aureus 209p, Proteus vulgaris 401, Proteus mirabilis H 2091, Klebsiella pneumoniae 320, Pseudomonas aeruginosa 1312, Shigella sonnei, Shigella flexneri 1046, Salmonella typhimurium 5710, Vibrio Nag p 6078 - методом штриха на плотной питательной среде в чашках Петри.

Ампулу с культурой разводят 0,9% раствором натрия хлорида, из расчета содержимого 2·10⁸ аэрококков в 1 мл и засевают штрихом по диаметру чашки с МПА, который содержит 1% глюкозы и 0,4 мг/мл калия йодида. После инкубации посевов в термостате при температуре (36±1)°С на протяжении 48 часов перпендикулярно выросшей культуре аэрококков подсевают петлей Генле культуру тест-штаммов. После 24-х часов инкубации при температуре (36±1)°С зоны задержки роста тест-культуры измеряют от края штриха к началу роста тест-культуры.

Зоны угнетения роста тест-штаммов должны быть не меньше чем 7 мм для Pseudomonas aeruginosa 1312 и не меньше чем 15 мм для всех других культур, в сравнении с 5 мм и 10 мм прототипа.

Оксидазная активность. С антагонистической активностью штама коррелирует показатель оксидазной активности, который определяют по способности аэрококков изменять окраску крахмала в составе питательной среды с йодидом калия. Диаметр посинения крахмала вокруг штриха Aerococcus viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) составляет не меньше 30 мм.

Способность к адгезии in vitro изучали на переживающей культуре эпителиоцитов кишечника кроликов и белых беспородных мышей по общепринятой методике. После часовой инкубации при 37°С культуры эпителиоцитов вместе с аэрококками штаммов Aerococcus viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) и Aerococcus viridans 167 (р.н. ИМВ В-7041) готовили препараты для электронной микроскопии.

Степень адгезии оценивали по мазкам, окрашенным 1% раствором тулоидинового синего. При этом определяли количество клеток, которые находятся в состоянии контакта с аэрококками, и интактных. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Адсорбционная способность штаммов Aerococcus viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) и Aerococcus viridans 167 (р.н. ИМВ В-7041) к энтероцитам кроликов и белых мышей
Штам аэрококков	Энтероциты	Показатель адгезии (%)
A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069)	кролика	80
A.viridans 167 (р.н. ИМВ В-7041)	кролика	64,5
A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069)	белой мыши	82,5
A.viridans 167 (р.н. ИМВ В-7041)	белой мыши	75

В соответствии с приведенными данными оба штамма аэрококков одинаково активно адсорбировались на энтероцитах как кролика, так и мыши, но заявленный штамм демонстрировал более высокую эффективность в сравнении с прототипом.

Влияние на фагоцитарную активность полиморфно-ядерных нейтрофилов периферической крови. Продуктами метаболизма A.viridans 167К (р.н. ИМВ В-7069) являются вещества, необходимые в процессе осуществления фагоцитарной функции - перекись водорода, супероксиддисмутаза, лизоцимоподобные вещества, токсичные формы кислорода, а также гидроксильные радикалы.

Активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали по фагоцитарной активности и индексом завершения фагоцитоза - килингом, что наиболее полно характеризует функциональную способность нейтрофильных фагоцитов за счет образования гранулоцитами токсичных форм кислорода, а также гидроксильного радикала. Супероксиддисмутаза связывает этот кислород с водородом, образовывая перекись водорода. Процессы перекисного окисления ведут к повреждению мембран микроорганизмов, предопределяя их гибель.

Проведены две серии опытов in vitro с целью выяснения влияния ферментного комплекса A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) на фагоцитарную функцию полиморфно-ядерных нейтрофилов. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 Влияние ферментного комплекса A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) в дозе 0,01 мл на фагоцитарную активность полиморфно-ядерных нейтрофилов в эксперименте in vitro (M±m)
Условия исследования (n=3)	Экспозиция 30 минут			Экспозиция 2 часа
	ФА%	ФЧ	ФИ	ФА%	ФЧ	ФИ	ИЗФ
1. контроль исследование	61	5,50	3,36	65	7,55	4,90	0,73
	66	6,15	4,06	60	3,78	2,27	1,63 *
2. контроль исследование	45	4,11	1,85	60	5,58	3,13	0,74
	49	4,00	1,96	57	4,01	2,31	0,98*
3. контроль исследование	70	6,13	4,30	71	5,57	3,96	1,09
	77	6,48	4,99	76	4,84	3,70	1,34*
4. контроль исследование	79	5,70	4,50	83	7,64	6,34	0,75
	70	3,87	2,70	80	4,55	3,64	0,85
5. контроль исследование	59	4,5	3,40	63	6,55	4,80	0,68
	63	5,2	3,67	65	2,78	3,17	1,87*
Примечание: *р<0,05; ФА - фагоцитарная активность; ФЧ - фагоцитарное число; ФИ - фагоцитарный индекс; ИЗФ - отношение ФЧ через 30 мин и ФЧ через 2 часа.

Как свидетельствуют приведенные данные, в 4 из 5-ти проведенных опытов отмеченное статистически достоверное повышение индекса завершения фагоцитоза при добавлении 0,01 мл ферментного комплекса A.viridans ИМВ В-7069.

Таблица 3 Влияние ферментного комплекса A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) в дозе 0,02 мл на фагоцитарную активность полиморфно-ядерных нейтрофилов в эксперименте in vitro (M±m)
Условия исследования (n=3)	Экспозиция 30 минут			Экспозиция 2 часа
	ФА%	ФЧ	ФИ	ФА%	ФЧ	ФИ	ИЗФ
1. контроль исследование	60	4,75	2,85	66	7,48	4,94	0,63
	46	4,15	1,91	52	6,21	3,23	0,67
2. контроль исследование	46	3,69	1,70	50	6,04	3,02	0,62
	46	5,10	2,33	70	4,13	2,89	1,23*
3. контроль исследование	70	4,83	3,40	73	5,50	4,07	0,87
	56	3,50	1,96	70	3,81	2,67	0,92 *
4. контроль исследование	83	6,33	5,25	83	7,07	5,87	0,89
	53	3,38	1,79	58	3,96	2,30	0,85
Примечание: *р<0,05; ФА - фагоцитарная активность; ФЧ - фагоцитарное число; ФИ - фагоцитарный индекс; ИЗФ - отношение ФЧ через 30 мин и ФЧ через 2 часа.

Сравнивая данные, приведенные в таблицах 2 и 3, можно сделать вывод о дозозависимом стимулирующем влиянии ферментного комплекса A. viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) на важнейшую, конечную стадию фагоцитоза - килинг. Доза 0,01 мл стимулирует килинг, не угнетая функции адгезии и поглощения.

Еще одним объектом данного изобретения является лечебное средство Виабак (Viabac), содержащее терапевтически эффективное количество лиофилизованных вегетативных клеток штамма A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) в составе биоконцентрата. Согласно с обычной фармацевтической практикой биоконцентрат преимущественно вводят в состав композиции совместно с одним или несколькими носителями (разнообразные лечебные, вкусовые, пищевые добавки и наполнители). Перечни пригодных для этой цели компонентов хорошо известны осведомленным специалистам, как и способы их смешивания. В частности, ими могут быть молочный сахар, фруктовый пектин, поливинилпирролидон, производные целлюлозы, стеарат магния, витамины, фруктовые порошки и т.п. Для перорального употребления биоконцентрат в соответствии с этим изобретением может быть введен в состав капсул, таблеток или других пероральных врачебных форм. Для внешнего применения он может использоваться в виде мазей, лечебно-профилактических зубных паст и т.п.

Приведенные дальше примеры иллюстрируют изобретение, но никаким образом не ограничивают его.

Пример 1. Получение лиофилизированного биоконцентрата А.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) (в дальнейшем биоконцентрат).

Оптимальный рост аэрококков наблюдается через 24 часа при (36±1)°С на мясопептонном агаре.

Состав среды для культивирования штамма следующий, г:

агар микробиологический ГОСТ 17206-84	22
глюкоза ГОСТ 6038-79	40
пептон сухой ферментативный для
бактериологического назначения ГОСТ
13805-76	10
вода дистиллированная ГОСТ 6709-72, л	1

Для приготавливания среды дистиллированную воду смешивают с пептоном и агаром. Смесь выдерживают 20-30 минут при комнатной температуре для набухания агара и кипятят 15-20 минут до его полного расплавления. Далее 30%-ным раствором уксусной кислоты устанавливают рН 3,8. После часового отстаивания среду декантируют через ватно-марлевый фильтр и добавляют глюкозу, после чего стерилизуют при температуре (110±1)°С на протяжении 30 минут.

На питательной среде вырастают колонии диаметром 0,5-2,0 мм в виде плоских бесцветных дисков. После инкубации микробную массу смывают в асептических условиях путем добавления водного раствора стабилизатора. Проводят бактериоскопический и бактериологический контроль собранной микробной суспензии и лиофилизируют ее.

Высушенную суспензию измельчают и расфасовывают в стерильную тару и герметизируют.

В 1 г биоконцентрата помещается до 5×10¹⁰ жизнеспособных клеток.

Полученный биоконцентрат представляет собой смесь лиофильно высушенных живых вегетативных клеток бактерии; стабилизатора, например желатины и сахарозы; сухих компонентов питательной среды и биологически активных веществ, которые продуцируются штаммом.

В дальнейшем полученный биоконцентрат может использоваться сам по себе или в составе лечебного средства для профилактики и лечения разнообразных болезненных состояний.

Для культивирования A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) также можно использовать жидкую питательную среду, в частности МПБ с азотно-амиачной добавкой (не менее чем 12 мас.%). Хороший урожай культуры получают, если эта среда дополнительно содержит Tween-80 и никотиновую кислоту. Коррекцию рН раствора осуществляют с помощью 10%-ного аммиака и доводят до значения 6,2-6,4.

Для промышленного производства наиболее привлекательным для выращивания A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) является использование грибного отвара, что объясняется его умеренной ценой и промышленно значащим выходом готового продукта. Это в конечном счете отразится на удешевлении лечебного средства на основе A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069).

Пример 2. Использование биоконцентрата A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) для получения лечебного средства в форме таблетки.

Смешивают 20,0 г глюкозы, 20,0 г яблочного пектина и 32,0 г лактозы. Полученную смесь увлажняют раствором ячменно-солодового экстракта (4,5 г экстракта и 1,2 г воды), гранулируют, подсушивают, снова гранулируют, прибавляют 1 г биоконцентрата, полученного в Примере 1, 1,3 г аскорбиновой кислоты и 0,9 г стеарата кальция. Смесь тщательно перемешивают и таблетируют, получая приятные на вкус таблетки, которые содержат 4,2×10⁸ клеток A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069).

В дальнейшем полученные таблетки можно покрыть фармацевтично пригодным пленочным покрытием или использовать для получения порошка или микрогранул, которыми можно заполнить желатиновые капсулы.

Пример 3. Клиническое применение A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069).

3.1. Для оценки лечебных свойств А.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) проведен эксперимент с моделированием дисбактериоза у крыс. Исследование количественного и качественного состава микрофлоры желудка, тонкого и толстого кишечника крыс проводили общепризнанными методами.

В результате применения биоконцентрата A.viridans 167К (р.н. ИМВ В-7069) в составе корма отмечены восстановление нормального ценоза кишечника подопытных крыс, уменьшение количества условно-патогенных бактерий в толстой кишке, кишечная палочка с неизменными ферментативными свойствами высеивалась в 10⁵-10 ⁶, энтерококки в 10⁶, практически отсутствовали гемолитические формы бактерий, спорообразующие формы бактерий высеивались как у контрольных животных, так и у тех, которые получали обычный корм (таблица 4).

Таким образом, биоконцентрат A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) положительно влиял на показатели микрофлоры желудка, тонкого и толстого кишечника подопытных животных.

Показатели микрофлоры у животных, которые получали исследуемый биоконцентрат как биологически активную добавку к корму, существенным образом отличались от таких же в контроле, что позволяет сделать вывод о его благоприятном действии на количественный и качественный состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

3.2. Применение биоконцентрата A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) для лечения стоматологических инфекций.

При лечении зубов с хроническим периодонтитом в стадии ремиссии после медикаментозной и механической обработки корневых каналов и раскрытия верхушечных отверстий в корневых каналах оставляли турунды с раствором биоконцентрата [2 дозы биоконцентрата (4,2×10⁸ клеток), 2 мл дистиллированной воды, 0,5 мл димексида] под герметичной повязкой. Через двое суток при отсутствии клинических симптомов корневые каналы пломбировали пастоподобными материалами.

Лечение острых и хронических периодонтитов в стадии обострения проходило следующим образом. В первую посещаемость раскрывались кариозные пустоты, проводилась механическая и медикаментозная обработка корневых каналов. На последнем этапе корневые каналы промывались раствором биоконцентрата. Зуб оставляли открытым с целью оттока эксудата. Через трое суток при отсутствии симптомов воспаления в каналах оставляли турунды с раствором биоконцентрата под герметичной повязкой. Через 2-3 суток при отсутствии воспаления проводили пломбирование.

Проведенные исследования показали высокую эффективность биоконцентрата при лечении периодонтитов зубов: 138 зубов с хроническим периодонтитом в стадии ремиссии были вылечены за две посещаемости, 150 зубов с острым и хроническим периодонтитом в стадии обострения были вылечены за три посещения и лишь 12 зубов, рентгенограмма которых показала наличие гранулемы величиной с 0,5 на 0,5 см, были вылечены после четырех посещений.

3.3. Применение биоконцентрата A.viridans 167(р.н. ИМВ В-7069) для лечения инфекций кожных покровов.

Биоконцентрат A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) использовался в отделении патологии новорожденных при лечении грудных детей с опрелостями третьей степени с некротическими изменениями. После орошения пораженных участков раствором биоконцентрата отмечалось быстрое заживление с дальнейшей эпителизацией без применения стереотипных методов лечения.

Продолжительность лечения составила семь суток, то есть в два раза быстрее, чем при использовании традиционных методов.

3.4. Лечение дисбактериозов.

Больным на дисбактериоз, вызванный такими возбудителями, как Staph. aureus, Citrobacter, Klebsiella+Proteys vulgaris, Eterobacter назначались препараты A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) для внутреннего применения в количествах, которые зависели от тяжести состояния больного. Во всех случаях положительный эффект от такого лечения наступал уже на вторые сутки.

3.5. Лечение острой дизентерии, эшерихиоза и сальмонеллеза.

Больным на фоне традиционной терапии с целью купирования повреждений слизистой толстой кишки и дисбиоза кишечника назначались препараты A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069). Препараты вводили внутренне и ректально в дозах, которые зависели от тяжести течения болезни. Результаты положительные.

3.6. Использование A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069) в гинекологии также дало хорошие результаты. Больным в возрасте от 4 до 17 лет с внутривагинальными дрожжевыми, хламидиозными и трихомонадными инфекциями назначали спринцевание раствором биоконцентрата дважды в день. После курса лечения в подавляющем большинстве результаты были удовлетворительными - мазки второй и третьей степени чистоты.

Штамм A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069), как и лечебное средство Виабак (Viabac) на основе лиофилизированных вегетативных клеток штамма A.viridans 167K (р.н. ИМВ В-7069), проявляет антимикробную активность и является эффективным для лечения инфекционных поражений разной локализации.