способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных

Формула изобретения

Способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающий предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, отличающийся тем, что костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н HCl в течение 20 ч, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 ч при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, а именно к производству препаратов, действке которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани и ее регенерацию, и предназначено для использования в косметологии, кроме того, возможно его использование в области медицины.

В настоящее время известно, что коллагеновые волокна матрикса соединительной ткани выполняют структурную, опорную и стабилизирующую роль в отношении протеогликанов и воды. Кроме того, коллагеновый каркас обладает большой упругостью при действии сил растяжения и сжатия, играя основную роль в ограничении степени гидратации матрикса соединительной ткани (Miller E.J. Biochemical characteristics and biological significance of the genetically distinct collagens // Molec. Cell. Biochem. - 1976. - Vol.13. - N.2. - P.165-192).

Известен способ получения коллагена из - неминерализованной соединительной ткани - дермы, которую подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации уксусной кислотой, с последующим замораживанием, лиофильной сушкой и измельчением, без последующей стерилизации (Патент РФ №2076718, опубл. 10.04.1997).

Однако известный способ подразумевает выделение коллагена из неминерализованной соединительной ткани, в случае использования минерализованного сырья выделение коллагена и по данной схеме затруднительно.

Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного по расходу времени и реактивов способа получения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающем предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворившийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6000g, осадок диализуют против дистиллированной воды и очищают хроматографиен на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, примером лабораторного выполнения и иллюстрациями, на которых:

Фиг.1 - иллюстрирует схему выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани;

Фиг.2 - иллюстрирует хроматографический профиль коллагена костной ткани на катионообменнике.

Способ осуществляют следующим образом.

После предварительной обработки, заключающейся в удалении мягких тканей, минерализованную соединительную ткань измельчали до кусочков размерами около 5×5 мм. Затем ткань подвергали деминерализации 0,5 н. HCl в течение 20 ч, после этой процедуры деминерализованную ткань освобождали от раствора костного минерала, неколлагеновых белков и проводили пепсиновый протеолиз в присутствии фермента в 0.1 М HCl с рН 2. Пепсин брался из расчета 1 мг на 100 мг ткани. За 18 ч инкубации при температуре 37°С на магнитной мешалке ткань разрушалась полностью с образованием коллоидного раствора, из которого осаждали коллаген добавлением сульфата аммония до 25%-го насыщения. Осадок формировался в течение 1 ч, после чего его отделяли центрифугированием (10 мин, 40.000 gx). Для получения высокоочищенного коллагена используют хроматографическое разделение на СМ-сефадексе. После этого коллаген лиофильно высушивают.

Примеры лабораторного выполнения.

Кости крупного рогатого скота очищают от мягких тканей, обезжиривают спирт-эфирной смесью 1:1, измельчают до кусочков размерами 5×5 мм.

100 г измельченной обезжиренной костной ткани помещают в круглодонную колбу, в которую заливают 200 мл 0,5 н. HCl и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. Полученный после удаления надосадка нерастворившийся костный матрикс заливают 0,1 М HCl и вносят 1 мг пепсина. Реакционную массу помещают на магнитную мешалку и проводят ферментативный гидролиз костной ткани в течение 18 ч до полного растворения костей и образования коллоидного раствора. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием (40.000 g × 30 минут)

После этого к раствору протеолизата приливали насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 25%. Осадок коллагена, образовавшийся за 24 часа, отделяли центрифугированием (6.000 g × 60 минут), суспендировали и диализовали против дистилированной воды в течении 2-х суток, затем лиофильно высушивали. Полученный коллаген растворяли в 0,02 М растворе CH₃ COONa (pH 4,8) в 1,0 М мочевине, центрифугировали и наносили на колонку размерами 2,5×20 см с СМ-сефадексом (ионообменная емкость 4,5+0,5 meg/g, размер гранул 40-120 мкм). Для элюирования использовали линейный градиент NaCl (0,00-1,5 М) в ацетатном буфере (pH 4.8). Хроматографию проводили в денатурирующих условиях. Фракции денситометрировали при длине волны 226 нм, фракцию коллагена в пределах одного хроматографического пика собирали, диализовали против воды и лиофильно высушивали.

Предлагаемый способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов и он позволяет получать высокоочищенный продукт из дешевого доступного сырья.

Кроме этого, получение высокоочищеного коллагена может проводиться в комплексе с выделением других биологически-активных веществ (ГАГ - гликозаминогликаны, НКБ - не коллагеновые белки) костной ткани, снижая тем самым себестоимость целевого продукта.