предшественник инсулина, способ его получения и применение

Формула изобретения

1. Предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина, содержащий последовательность формулы

В (1-27)-Х₂ -Х₃-Х₁-Y-А (1-21),

где X₁ представляет собой пептидную последовательность из 1-3 аминокислотных остатков, содержащую остаток ароматической аминокислоты непосредственно у N-конца Y;

Х₂ представляет собой Pro или Asp;

Х₃ представляет собой Lys в положении 29 В-цепи; и

Y представляет собой Lys или Arg;

В(1-27) обозначает природную В-цепь, в которой отсутствуют аминокислотные остатки В28, В29 и В30;

А(1-21) обозначает А-цепь инсулина человека.

2. Предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина по п.1, где предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина обладает повышенной стабильностью в растворе, измеряемой в виде Cmid, по сравнению с предшественником инсулина или предшественником аналога инсулина, который не содержит остатка ароматической аминокислоты в X₁.

3. Предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина по п.1, где X₁-Y выбран из группы: Met-Trp-Lys; Ala-Trp-Lys; Val-Trp-Lys; Ile-Trp-Lys; Leu-Trp-Lys; Glu-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO: 15); Glu-Phe-Lys; Glu-Trp-Lys; Ser-Trp-Lys; Thr-Trp-Lys; Arg-Trp-Lys; Glu-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO:1); GIn-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO:2) и Asp-Trp-Lys.

4. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, определяющей аминокислотную последовательность предшественника по любому из пп.1-3.

5. Реплицируемый вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность по п.4.

6. Способ получения предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина, где указанный способ включает (i) культивирование клеточной линии, содержащей реплицируемый вектор экспрессии по п.5, в условиях культивирования, подходящих для экспрессии указанного предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина; и (ii) выделение экспрессированного предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина.

7. Способ по п.6, где клеточной линией является дрожжевая клеточная линия.

8. Способ получения инсулина или аналога инсулина, где указанный способ включает (i) культивирование клеточной линии, содержащей реплицируемый вектор экспрессии по п.5, в условиях культивирования, подходящих для экспрессии предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина; (ii) выделение предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина из культуральной среды и (iii) преобразование предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина в инсулин или аналог инсулина посредством химического или ферментативного превращения in vitro.

9. Способ по п.8, где клеточной линией является дрожжевая клеточная линия.

Приоритет по пунктам:

29.12.1999 по пп.1-9;

17.03.2000 по пп.1-9.

Описание изобретения к патенту

Организмы дрожжей продуцируют ряд белков, которые функционируют вне клетки. Такие белки называют секретируемыми белками. Указанные секретируемые белки сначала экспрессируются внутри клетки в виде предшественника или преформы, содержащей последовательность препептида, обеспечивающего эффективное направление (транслокацию) экспрессированного продукта через мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭР). Препептид, обычно называемый сигнальным пептидом, как правило, отщепляется от желаемого продукта в ходе транслокации. После входа в секреторный путь белок транспортируется к аппарату Гольджи. Из аппарата Гольджи белок может следовать разными путями, которые ведут в такие компартменты, как клеточная вакуоль или клеточная мембрана, или он может быть направлен из клетки для секреции во внешнюю среду (Pfeffer et al. (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 829-852).

Инсулин является полипептидным гормоном, секретируемым -клетками поджелудочной железы, и состоит из двух полипептидных цепей А и В, которые связаны двумя межцепочечными дисульфидными мостиками. Кроме того, особенностью А-цепи является наличие одного внутрицепочечного дисульфидного мостика.

Гормон синтезируется в виде одноцепочечного предшественника проинсулина (препроинсулина), состоящего из препептида длиной 24 аминокислоты, за которым следует проинсулин, содержащий 86 аминокислот в следующем порядке: препептид - В-Arg Arg - С - Lys Arg - А, в котором С означает соединительный пептид из 31 аминокислоты. Arg-Arg и Lys-Агд представляют собой расщепляемые сайты для отщепления соединительного пептида от А- и В-цепей.

Для получения инсулина человека в микроорганизмах использовали три основных способа. В двух способах применяли Escherichia coli либо в случае экспрессии крупного слитого белка в цитоплазме (Frank et al. (1981) in Peptides: Proceedings of the 7^th American Peptide Chemistry Symposium (Rich and Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, IL. p.729-739), либо в случае использования сигнального пептида, чтобы обеспечить возможность секреции в периплазматическое пространство (Chan et al. (1981) PNAS 78: 5401-5404). В третьем способе использовали Saccharomyces cerevisiae, чтобы секретировать предшественник инсулина в среду (Thim et al. (1986) PNAS 83: 6766-6770). В предшествующем уровне техники сообщается об ограниченном количестве предшественников инсулина, которые экспрессируются либо в Е. coli, либо в Saccharomyces cerevisiae, смотри патент США 5962267, заявки WO 95/16708, ЕР 0055945, ЕР 0163529, ЕР 0347845 и ЕР 0741188.

Круговой дихроизм (КД) используют для того, чтобы определить стабильность белка и относительные стабильности молекул. КД, наблюдаемый ниже 240 нм, обусловлен амидным хромофором пептида, и его можно использовать для оценки вторичной структуры белка (Johnson (1988) Ann. Rev. Biophys. Chem. 17: 145-166). Спектр инсулина характеризуется минимумами при 220 и 209 нм, отрицательно-положительным переходом вблизи 203 нм и максимумом при 195 нм. При денатурации отрицательная полоса спектра КД в пределах 240-218 нм постепенно уменьшается, что согласуется с потерей упорядоченной вторичной структуры, которая сопутствует разворачиванию белка. Поэтому стабильность укладки предшественника инсулина можно количественно проанализировать, измеряя потерю вторичной структуры как функцию добавленного денатурирующего агента, например гидрохлорида гуанидина (GuHCl) (смотри, например, Расе (1975) CRC Crit. Rev. Biochem. 3: 1-43).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Особенностью данного изобретения являются новые соединительные пептиды (С-пептиды), которые дают повышенный выход продукции и/или повышенную стабильность молекул предшественников инсулина и молекул аналогов предшественников инсулина при экспрессии в трансформированном микроорганизме, в частности, в дрожжах. Такие предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина затем можно превратить в инсулин или аналоги инсулина в ходе одной или нескольких подходящих, хорошо известных стадий превращения.

Соединительные пептиды согласно данному изобретению содержат, по меньшей мере, один остаток ароматической аминокислоты Phe, Trp или Tyr и, как правило, будут короче, чем природный С-пептид человека, который, включая фланкирующие сайты расщепления из двух основных аминокислот, состоят из 35 аминокислот. Таким образом, новые соединительные пептиды, как правило, будут длиной не более 15 аминокислотных остатков, и предпочтительно не более 9 аминокислотных остатков. Обычно новые соединительные пептиды будут длиной до 7 или до 5 аминокислотных остатков и предпочтительно не более 4 аминокислотных остатков в длину.

Как и в природной молекуле инсулина человека соединительный пептид будет содержать сайт расщепления на его С- и N-конце, обеспечивающий отщепление in vitro соединительного пептида от А- и В-цепей. Такими сайтами расщепления могут быть любые подходящие сайты расщепления, известные в данной области, например Met, отщепляемый бромцианом; отдельный остаток основной аминокислоты или пара остатков основных аминокислот (Lys или Arg), отщепляемые трипсином или трипсиноподобными протеазами; протеазой Acromobactor lyticus или протеазой карбоксипептидазой. Сайт расщепления, обеспечивающий отщепление соединительного пептида от А-цепи, предпочтительно представляет собой единственный остаток основной аминокислоты Lys или Arg, предпочтительно Lys.

Альтернативно отщепление соединительного пептида от В-цепи можно обеспечить посредством расщепления у природного аминокислотного остатка Lys в В-цепи, приводящего к образованию предшественника инсулина desВ30 или аналога предшественника инсулина desВ30. Требуемый аминокислотный остаток В30 затем можно добавить хорошо известными ферментативными способами in vitro.

В одном варианте соединительный пептид не будет содержать двух близлежащих остатков основных аминокислот (Lys, Arg). В указанном варианте отщепление от А-цепи можно осуществить у единственного Lys или Arg, локализованного на N-конце А-цепи, и природного Lys в положении В29 в В-цепи.

Соединительный пептид может содержать более одного остатка ароматической аминокислоты, но предпочтительно не более 5. Остатки ароматических аминокислот могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Соединительный пептид предпочтительно не будет содержать более 3 остатков ароматических аминокислот и наиболее предпочтительно он будет содержать только единственный остаток ароматической аминокислоты.

В одном варианте данного изобретения один из остатков ароматических аминокислот в соединительном пептиде находится непосредственно у N-конца сайта расщепления, примыкающего к А-цепи. Кроме того, один из остатков ароматических аминокислот предпочтительно будет расположен на расстоянии менее 5 Å, по меньшей мере, от одного из остатков в положениях B11, B12 или В26 в В-цепи. В одном варианте ароматическая аминокислота, расположенная непосредственно у N-конца сайта расщепления, примыкающего к А-цепи, находится на расстоянии менее 5 Å, по меньшей мере, от одного из остатков в положениях В11, В12 или В26 в В-цепи.

Предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина характеризуются наличием высокой стабильности укладки в растворе. Предшественники согласно данному изобретению будут обладать более высокой стабильностью с более высоким значением Cmid по сравнению с инсулином или аналогами инсулина, которые не содержат остатка ароматической аминокислоты в соединительном пептиде. Стабильность, таким образом, будет выше с Cmid, выше чем примерно 5,5 М GuHCl, обычно выше чем около 6,0 М GuHCl и более типично выше чем около 6,5 М GuHCl.

Соответственно, в одном аспекте данное изобретение относится к предшественникам инсулина или аналогам предшественников инсулина, содержащим соединительный пептид (С-пептид), отщепляемый от А- и В-цепей, при этом указанный соединительный пептид содержит, по меньшей мере, один остаток ароматической аминокислоты и сайт расщепления, обеспечивающий расщепление пептидной связи между А-цепью и соединительным пептидом, где один остаток ароматической аминокислоты расположен непосредственно у N-конца указанного сайта расщепления.

В другом аспекте данное изобретение относится к предшественникам инсулина или аналогам предшественников инсулина, содержащим соединительный пептид (С-пептид), отщепляемый от А- и В-цепей, при этом указанный соединительный пептид содержит до 9 аминокислотных остатков, из которых, по меньшей мере, один является остатком ароматической аминокислоты.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к предшественнику инсулина или аналогу предшественника инсулина, содержащему соединительный пептид (С-пептид), отщепляемый от А- и В-цепей, при этом указанный соединительный пептид содержит один остаток ароматической аминокислоты, который расположен на расстоянии менее 5 Å, по меньшей мере, от одного из остатков в положениях B11, B12 или В26 в В-цепи.

В следующем аспекте данное изобретение относится к предшественникам инсулина или аналогам предшественников инсулина, содержащим соединительный пептид (С-пептид), включающий в себя, по меньшей мере, один остаток ароматической аминокислоты и отщепляемый от А- и В-цепей. Указанные предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина обладают повышенной стабильностью с более высоким Cmid по сравнению с предшественником инсулина или аналогами предшественника инсулина, которые не содержат остатка ароматической аминокислоты в соединительном пептиде.

Повышенную активность определяют разными способами, известными специалисту в данной области и описанными ниже. В одном варианте повышенную стабильность измеряют определением посредством КД концентрации гидрохлорида гуанидина (GuHCl), необходимой для достижения половины от максимального разворачивания молекулы предшественника инсулина (Cmid).

В следующем аспекте данное изобретение относится к предшественникам инсулина или аналогам предшественников инсулина, содержащим последовательность формулы:

В (1-27)-X₂-X₃-X₁-Y-A (1-21),

где

X₁ представляет собой пептидную последовательность из 1-15 аминокислотных остатков, содержащую один остаток ароматической аминокислоты непосредственно у N-конца Y,

Х₂ представляет собой одну из аминокислот Pro, Asp, Lys или Ile в положении 28 В-цепи,

Х₃ представляет собой одну из аминокислот Pro, Lys, Ala, Arg или Pro-Thr в положении 29 В-цепи, и

Y является Lys или Arg.

В одном варианте общее количество аминокислотных остатков в X₁ будет составлять 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5 или 1-4 аминокислотных остатка в длину. В другом конкретном варианте X₁ означает 1-3 аминокислотных остатка и предпочтительно 1-2 аминокислотных остатка. Аминокислотным остатком в X₁ может быть любой кодируемый аминокислотный остаток, и они могут быть одинаковыми или разными, только при условии, что один является остатком ароматической аминокислоты, расположенным непосредственно у N-конца Y.

В следующем аспекте данное изобретение относится к предшественникам инсулина или аналогам предшественников инсулина, содержащим последовательность формулы:

B(1-27)-X₂-X₃-X₁ -Y-A(1-21),

где

X₁ представляет собой пептидную последовательность из 1-15 аминокислотных остатков, один из которых является остатком ароматической аминокислоты, который расположен на расстоянии менее 5 Å, по меньшей мере, от одного из аминокислотных остатков в положении В11, В12 или В26 в В-цепи,

Х₂ представляет собой одну из аминокислот Pro, Asp, Lys или Ile в положении 28 В-цепи,

Х₃ представляет собой одну из аминокислот Pro, Lys, Ala, Arg или Pro-Thr в положении 29 В-цепи, и Y является Lys или Arg.

В одном варианте количество аминокислотных остатков в Xi составляет 1-9, 1-5 или 1-4. В другом варианте количество аминокислотных остатков составляет 1-3 или 1-2.

В другом аспекте данное изобретение относится к предшественникам инсулина или аналогам предшественников инсулина, содержащим последовательность формулы:

B(1-27)-X₂-X₃-X₁ -Y-A(1-21),

где

X₁ представляет собой пептидную последовательность из 1-8 аминокислотных остатков, по меньшей мере, один из которых является остатком ароматической аминокислоты,

Х₂ представляет собой одну из аминокислот Pro, Asp, Lys или Ile в положении 28 В-цепи,

Х₃ представляет собой одну из аминокислот Pro, Lys, Ala, Arg или Pro-Thr в положении 29 В-цепи, и

Y является Lys или Arg.

Общее количество аминокислотных остатков в X₁ будет составлять 1-7, 1-6, 1-5 или 1-4 аминокислотных остатка. В более конкретном варианте X₁ означает 1-3 аминокислотных остатка и предпочтительно 1-2 аминокислотных остатка. Аминокислотным остатком в X₁ может быть любой кодируемый аминокислотный остаток, и они могут быть одинаковыми или разными, только при условии, что, по меньшей мере, один аминокислотный остаток в X₁ является остатком ароматической аминокислоты.

В указанной выше формуле X₁ может содержать до 5 остатков ароматических аминокислот, которые могут быть одинаковыми или разными. В конкретном варианте X₁ содержит до 3 остатков ароматических аминокислот, которые могут быть одинаковыми или разными, X₁ предпочтительно будет содержать только один остаток ароматической аминокислоты. Остатки ароматических аминокислот представляют собой Trp, Phe или Tyr, предпочтительно Phe или Trp.

В одном варианте Х₂ означает Asp, а Х₃ означает Lys. Указанный вариант охватывает аналоги предшественников инсулина, содержащие Asp в положении В28 В-цепи (называемые в дальнейшем «Asp^B28IP»). В другом варианте X₂ означает Lys, а Х₃ означает Pro. В следующем варианте последовательность X₁-Y выбрана из группы: (a) Met-Trp-Lys; (b) Ala-Trp-Lys; (с) Val-Trp-Lys; (d) Ile-Trp-Lys; (e) Leu-Trp-Lys; (f) Glu-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO:15); (g) Glu-Phe-Lys; (h) Glu-Trp-Lys; (i) Ser-Trp-Lys; (j) Thr-Trp-Lys; (k) Arg-Trp-Lys; (1) Glu-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO:1); (m) GIn-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO:2) и (n) Asp-Trp-Lys.

В другом варианте Х₂ означает Pro, а Х₃ означает Lys, и X₁ означает 1-2 аминокислотных остатка, один из которых является Trp или Phe.

В другом варианте X₂ означает Lys, Х₃ означает Pro-Thr, и X₁ имеет в своем составе до 15 аминокислотных остатков, один из которых является Thr, Туг или Phe. В указанном варианте X₁ будет содержать сайт расщепления на С-конце, например, сайт расщепления из одной или двух основных аминокислот (Lys, Arg).

Данное изобретение также относится к полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют заявленные предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина. В следующем аспекте данное изобретение относится к векторам, содержащим такие полинуклеотидные последовательности, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотидные последовательности или векторы.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения предшественников инсулина или аналогов предшественников инсулина в клетке-хозяине, при этом указанный способ включает в себя (i) культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина согласно изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии указанного предшественника или аналога предшественника; и (ii) выделение предшественника или аналога предшественника из культуральной среды.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения инсулина или аналогов инсулина в клетке-хозяине, при этом указанный способ включает в себя (i) культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую предшественник инсулина или аналоги предшественника инсулина согласно изобретению; (ii) выделение предшественника или аналога предшественника из культуральной среды и (iii) превращение предшественника или аналога предшественника в инсулин или аналог инсулина путем ферментативного превращения in vitro.

В одном варианте данного изобретения клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку-хозяина, а в следующем варианте дрожжевая клетка-хозяин выбирается из клеток рода Saccharomyces. В следующем варианте дрожжевая клетка-хозяин выбирается из клеток вида Saccharomyces cerevisiae.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг.1 представлена экспрессирующая плазмида рАК721 S. cerevisiae, которая экспрессирует слитый белок лидер LA19-ЕЕАЕАЕАЕРК (SEQ ID NO:3)-IP(AlaAlaLys).

На фиг.2 представлена последовательность ДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность кодируемого слитого белка (лидер -фактора-ЕЕАЕАЕАРК (SEQ ID NO:4)-Asp^B28IP части плазмиды рАК1150, используемой в качестве матрицы в ПЦР (SEQ ID NO:5 и 6).

На фиг.3 представлена последовательность ДНК, кодирующая слитый белок лидер -фактора-Asp^B28IP(GluTrpLys) с синтетическим мини-С-пептидом GluTrpLys, полученным путем рандомизированной оптимизации (SEQ ID NO:7 и 8). Мини-С-пептид (EWK) указан подчеркиванием.

На фиг.4 показана стабильность укладки аналога инсулина Asp ^B28IP(MetTrpLys) по сравнению с Asp^B28IP.

На фиг.5 показаны структуры Asp^B28IP(MetTrpLys) в растворе в виде линий основных цепей набора из 20 конвергентных структур.

На фиг.6 показано представление Asp^B28 IP(MetTrpLys) в виде ленты. Фигура получена с использованием MOLSCRIPT (Kraulis (1991) J. Appl. Crystallog. 24: 946-950). Аннотация к остаткам аминокислот дана следующим образом: В1-В29 (В-цепь) пронумерованы 1-29, остатки С1-С3 (соединительный пептид) пронумерованы 30-32 и остатки А1-А21 (А-цепь) пронумерованы 33-53.

Фиг.7 представляет собой идентификационный спектр ЯМР протонов для Asp^B28IP(MetTrpLys), записанный при 27°С при концентрации 1,0 мМ в 10%/90% D₂O/H₂ O с 10 мМ фосфатным буфером при рН 8,0.

На фиг.8 представлена ДНК и рассчитанная последовательность аминокислот экспрессирующей кассеты, которая экспрессирует слитый белок YAP3-TA39-EEGEPK (SEQ ID NO:11)-Asp^B28IP с синтетическим мини-С-пептидом GluTrpLys (SEQ ID NO:9 и 10) и

На фиг.9 представлена ДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность экспрессирующей кассеты, которая экспрессирует слитый белок YAP3-TA57-EEGEPK (SEQ ID NO:17)-Asp^B28IP с синтетическим мини-С-пептидом GluTrpLys (SEQ ID NO:11 и 12).

На фиг.10 представлена кривая расщепления предшественника инсулина Aspart - протеазой Achromobacter Cyticus.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Сокращения и номенклатура

Под «соединительным пептидом» или «С-пептидом» подразумевается соединительный фрагмент «С» полипептидной последовательности В-С-А одноцепочечной молекулы, подобной препроинсулину. В частности, в природной цепи инсулина С-пептид связывает положение 30 В-цепи и положение 1 А-цепи. «Мини-С-пептид» или «соединительный пептид», такой как описанные здесь пептиды, связывает В29 или В30 с А1 и отличается по последовательности и длине от природного С-пептида.

Под «IP» подразумевается одноцепочечный предшественник инсулина, в котором dеsВ30-цепь связана с А-цепью инсулина посредством соединительного пептида. Одноцепочечный предшественник инсулина будет содержать правильно расположенные дисульфидные мостики (три), как в инсулине человека.

Термины «dеsВ30» или «В(1-29)» означают В-цепь природного инсулина, в которой отсутствует остаток аминокислоты В30, «А(1-21)» означает А-цепь природного инсулина, «В(1-27)» означает природную В-цепь, в которой отсутствуют аминокислотные остатки В28, В29 и В30; «Asp^B28IP» означает одноцепочечный предшественник инсулина с аспарагиновой кислотой в положении 28 В-цепи и без С-пептида) (В29 связан с A1). Мини-С-пептид и его аминокислотная последовательность указаны трехбуквенным кодом аминокислот в круглых скобках после IP; таким образом, «Asp ^B28IP(MetTrpLys)» означает одноцепочечный предшественник инсулина с аспарагиновой кислотой в положении 28 В-цепи и мини-С-пептидом с последовательностью Met-Trp-Lys, связывающим В29 с A1.

Термин «предшественник инсулина» означает одноцепочечный полипептид, который в результате одного или нескольких последовательных химических и/или ферментативных процессов можно превратить в инсулин человека.

Термин «аналог предшественника инсулина» означает молекулу предшественника инсулина, имеющую одну или несколько мутаций, замен, делеций и/или присоединений в А- и/или В-аминокислотных цепях, по сравнению с молекулой инсулина человека. Предпочтительны такие аналоги инсулина, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного происхождения, предпочтительно один, два или три остатка, были заменены другим кодируемым аминокислотным остатком. В одном варианте данное изобретение включает в себя молекулы аналогов, в которых положение 28 В-цепи изменено по сравнению с природной молекулой инсулина человека. В указанном варианте положение 28 изменено с природного остатка Pro на один из остатков Asp, Lys или Ile. В предпочтительном варианте природный остаток Pro в положении В28 изменен на остаток Asp. В другом варианте Lys в положении В29 заменен на Pro; Asn в положении А21 также может быть изменен на Ala, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val, в частности на Gly, Ala, Ser или Thr и предпочтительно на Gly. Кроме того, Asn в положении В3 может быть изменен на Lys. Следующими примерами аналогов предшественников инсулина являются инсулин человека des(B30), аналоги инсулина, в которых был делегирован Phe^B1; аналоги инсулина, в которых А-цепь и/или В-цепь имеют N-концевое удлинение, и аналоги инсулина, в которых А-цепь и/или В-цепь имеют удлинение С-конца. Таким образом, к положению В1 могут быть добавлены один или два Arg.

Термин «непосредственно у N-конца» предназначен для иллюстрации ситуации, когда аминокислотный остаток или пептидная последовательность непосредственно связана своим С-концом с N-концом другого аминокислотного остатка или аминокислотной последовательности посредством пептидной связи.

В данном контексте термин «функциональный аналог инсулина» и тому подобное, предназначен для обозначения полипептида со сходным биологическим действием, как и у нативного белка инсулина человека.

Выражение расстояние «короче 5 Å» между двумя аминокислотными остатками означает самое короткое межатомное расстояние менее 5 Å между любым атомом в первой аминокислоте и любым атомом во второй аминокислоте. Атомные расстояния измеряют из трехмерной структуры молекулы, определенной либо посредством ЯМР (Wüthrich, К., 1986, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York), либо способом рентгеновской кристаллографии (Drenth, J., 1994, Principles of Protein X-ray crystallography. Springer Verlag Berlin). Расстояние от одной аминокислоты до другой измеряют в виде самого короткого межатомного расстояния между любым атомом в первой аминокислоте и любым атомом во второй аминокислоте, если не оговорено особо.

Особенностью данного изобретения являются новые мини-С-пептиды, связывающие положение 29 В-цепи инсулина и положение 1 А-цепи инсулина, которые существенно увеличивали выход продукции в дрожжевой клетке-хозяине. Под термином «существенно увеличенная продукция», «увеличенный выход ферментации» и тому подобным понимают увеличение секретируемого количества молекулы предшественника инсулина или молекулы аналога предшественника инсулина в надосадке культуры по сравнению с выходом предшественника инсулина или аналога предшественника инсулина, не содержащего остатка ароматической аминокислоты в мини-С-пептиде. «Повышенный» выход ферментации представляет собой абсолютное количество, большее чем в контроле; предпочтительно увеличение представляет собой повышение на 50% или больше, чем уровень (AspB²⁸ IP) в контроле; еще более предпочтительно увеличение представляет собой превышение на 100% или более по сравнению с контрольными уровнями.

Под термином «повышение стабильности» понимают, например, увеличенное значение Cmid в растворе по сравнению со значением, полученным для предшественника аналога инсулина (например. Asp^B28IP), не содержащего остатка ароматической аминокислоты в мини-С-пептиде. Под термином «Cmid» понимают концентрацию GuHCl, необходимую для развертывания половины популяции белков при анализе, в котором измеряется круговой дихроизм молекулы инсулина в дальнем УФ как функция возрастающих концентраций денатурирующего агента.

«РОТ» означает ген триозофосфатизомеразы Schizosaccharomyces pombe, а «TPI1» означает ген триозофосфатизомеразы S. cerevisiae.

Под «лидером» понимают аминокислотную последовательность, состоящую из препептида (сигнального пептида) и пропептида.

Подразумевается, что термин «сигнальный пептид» означает препептид, который присутствует в виде N-концевой последовательности в форме предшественника белка. Функция сигнального пептида состоит в том, чтобы обеспечить возможность для облегчения транслокации гетерологичного белка в эндоплазматический ретикулум. Сигнальный пептид обычно отщепляется в ходе этого процесса. Сигнальный пептид может быть гетерологичным или гомологичным по отношению к организму дрожжей, продуцирующему белок. Ряд сигнальных пептидов, которые можно использовать с конструкцией ДНК согласно изобретению, включает сигнальный пептид аспарагиновой протеазы 3 дрожжей (YАР3) или любой функциональный аналог (Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6: 127-137 и патент США 5726038) и сигнал -фактора гена MF 1 (Thorner (1981) in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern et al., eds., p.143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY и патент США 487000.

Термин «пропептид» означает полипептидную последовательность, функция которой состоит в обеспечении того, чтобы экспрессированный полипептид был направлен из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и далее в секретируемую везикулу для секреции в культуральную среду (т.е. экспорта полипептида через клеточную стенку или, по меньшей мере, через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). Пропептидом может быть пропептид -фактора дрожжей, смотри патенты США 4546082 и 4870008. Альтернативно, пропептидом может быть синтетический пропептид, что говорит о том, что пропептид не встречается в природе. Подходящими синтетическими пропептидами являются пропептиды, заявленные в патентах США 5395922; 5795746; 5162498 и заявке WO 98/32867. Пропептид предпочтительно будет содержать сайт процессинга эндопептидазой на С-конце, такой как последовательность Lys-Arg или любой его функциональный аналог.

Полинуклеотидную последовательность согласно изобретению можно получить синтетически стандартными принятыми способами, например, фосфоамидитным способом, описанным Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, или способом, описанным Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3: 801-805.

Согласно фосфоамидитному способу олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, образуют дуплексы и лигируют, чтобы образовать синтетическую конструкцию ДНК. Предпочтительным в настоящее время способом получения ДНК-конструкции является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полинуклеотидная последовательность согласно изобретению также может происходить из смешанной геномной, кДНК или синтетической ДНК. Например, последовательность геномной или кДНК, кодирующую лидерный пептид, можно соединить с последовательностью геномной ДНК или кДНК, кодирующей А- и В-цепи, после чего последовательность ДНК можно модифицировать в сайте встраиванием синтетических олигонуклеотидов, кодирующих желаемую аминокислотную последовательность для гомологичной рекомбинации, в соответствии с хорошо известными способами, или предпочтительно созданием желаемой последовательности с помощью ПЦР, используя подходящие олигонуклеотиды.

Изобретение включает в себя вектор, который способен к репликации в выбранном микроорганизме или клетке-хозяине и который несет полинуклеотидную последовательность, кодирующую предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина согласно изобретению. Рекомбинантный вектор может быть автономно реплицируюшимся вектором, т.е. вектором, который существует как внехромосомная единица, репликация которой не зависит от репликации хромосом, например, плазмидой, в не хромосомным элементом, минихромосомой или искусственной хромосомой. Вектор может содержать любые средства для обеспечения автономной репликации. В альтернативном случае вектором может быть вектор, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Кроме того, можно использовать отдельный вектор или плазмиду, или два или несколько векторов или плазмид, которые вместе содержат полную ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина, или транспозон. Векторы могут быть линейными или замкнутыми кольцевыми плазмидами, и предпочтительно будут содержать элемент(ты), который делает возможной стабильную интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.

В предпочтительном варианте рекомбинантный экспрессирующий вектор способен реплицироваться в организме дрожжей. Примерами последовательностей, которые дают возможность вектору реплицироваться в дрожжах, являются гены репликации 2 мкм-плазмиды дрожжей REP 1-3 и начало репликации.

Векторы согласно данному изобретению предпочтительно содержат один или несколько селектируемых маркеров, которые обеспечивают простую селекцию трансформированных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает биоцидную или вирусную резистентность, резистентность к тяжелым металлам, прототрофность ауксотрофам и тому подобное. Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены dal Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Селектируемые маркеры для применения в клетке-хозяине нитчатых грибов включают amdS (ацетамидаза), argB (орнитинкарбамоилтрансфераза), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза) и trpC (антранилатсинтаза). Подходящими маркерами для дрожжевых клеток-хозяев являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, МЕТ3, TRP1 и URA3. Предпочтительным селектируемым маркером для дрожжей является ген TPI Schizosaccharomyces pombe (Russell (1985) Gene 40: 125-130).

В векторе полинуклеотидная последовательность оперативно связана с подходящей последовательностью промотора. Промотор может быть любой последовательностью нуклеиновой кислоты, которая проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, выбранной из мутантных, укороченных или гибридных промоторов, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией в бактериальной клетке-хозяине являются промоторы, полученные из lac-оперона Е coli, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) и гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP). Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией в клетке-хозяине нитчатых грибов являются промоторы, полученные из генов амилазы Aspergillus oryzae ТАКА, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и устойчивой к кислотам альфа-амилазы Aspergillus niger. В дрожжевой клетке-хозяине пригодными промоторами являются промоторы Mal, TPI, ADH или PGK Saccharomyces cerevisiae.

Полинуклеотидная конструкция согласно изобретению также, как правило, будет оперативно связана с подходящим терминатором. У дрожжей подходящим терминатором является терминатор TPI (Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434).

Способы, используемые для того, чтобы лигировать соответственно полинуклеотидную последовательность согласно изобретению, промотор и терминатор, и чтобы встроить их в подходящие дрожжевые векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации у дрожжей, хорошо известны специалистам в данной области. Будет понятно, что вектор можно сконструировать либо путем получения сначала конструкции ДНК, содержащей полную последовательность ДНК, кодирующую предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина согласно изобретению, и затем встраиванием этого фрагмента в подходящий экспрессирующий вектор, или посредством последовательного встраивания фрагментов ДНК, содержащих генетическую информацию для отдельных элементов (таких как сигнал, пропептид, мини-С-пептид, А- и В-цепи) с последующим лигированием.

Данное изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина согласно изобретению. Вектор, содержащий такую полинуклеотидную последовательность, вводят в клетку-хозяина, так что вектор сохраняется в виде хромосомного компонента или в виде автономно реплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке вследствие мутаций, которые происходят во время репликации. Выбор клетки-хозяина будет в большой степени зависеть от гена, кодирующего полипептид, и его источника. Клеткой-хозяином может быть одноклеточный микроорганизм, например, прокариот, или не одноклеточный микроорганизм, например, эукариот. Пригодными клетками одноклеточных являются бактериальные клетки, такие как грамположительные бактерии, включая, но не ограничивая указанным, клетку Bacillus, клетку Streptomyces, или грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli и Pseudomonas sp. Эукариотические клетки могут быть клетками млекопитающих, насекомых, растений или грибов. В предпочтительном варианте клеткой-хозяином является дрожжевая клетка. Дрожжевым организмом, используемым в способе согласно изобретению, может быть любой подходящий организм дрожжей, который при культивировании продуцирует большие количества предшественника инсулина и аналогов предшественников инсулина согласно изобретению. Примерами подходящих организмов дрожжей являются штаммы, выбранные из видов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. и Geotrichum fermentans.

Трансформацию дрожжевых клеток можно, например, осуществить путем образования протопластов с последующей трансформацией по существу известным способом. Средой, используемой для культивирования клеток, может быть любая обычная среда, подходящая для роста организмов дрожжей. Секретированный предшественник инсулина или аналоги предшественника инсулина согласно изобретению, значительная часть которых будет присутствовать в среде в правильно процессированной форме, можно извлечь из среды традиционными способами, включая отделение дрожжевых клеток от среды центрифугированием, фильтрацией или улавливанием предшественника инсулина или аналога предшественника инсулина с помощью ионообменного матрикса или адсорбирующего матрикса обращенной фазы, осаждением белковых компонентов надосадка или фильтрата с помощью соли, например сульфата аммония, с последующей очисткой разными хроматографическими способами, например ионообменной хроматографией, аффинной хроматографией и тому подобного.

Предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина согласно изобретению могут быть экспрессированы с удлиненным аминокислотными остатками N-концом, как описано в патенте США 5395922 и Европейском патенте 765395А, оба этих патента специально включены здесь в виде ссылки. Обнаружено, что во время ферментации удлинение стабильно связано с предшественником инсулина или аналогами предшественника инсулина согласно изобретению, защищая N-конец предшественника инсулина или аналога предшественника инсулина от протеолитической активности дрожжевых протеаз, таких как DPAP. Присутствие удлинения N-конца в предшественнике инсулина или аналоге предшественника инсулина также может служить в качестве защиты N-концевой аминогруппы в ходе химической обработки белка, т.е. может служить как заместитель ВОС (трет-бутилоксикарбонила) или сходной защитной группы. N-концевое удлинение можно удалить из выделенного предшественника инсулина или аналога предшественника инсулина с помощью протеолитического фермента, который специфичен в отношении основной аминокислоты (например, Lys), так что концевое удлинение отщепляется у остатка Lys. Примерами таких протеолитических ферментов являются трипсин или протеаза Achromobacter lyticus.

После секреции в культуральную среду и выделения предшественник инсулина или аналоги предшественника инсулина согласно изобретению будут подвергнуты различным процедурам in vitro, чтобы удалить возможную последовательность удлинения N-конца и мини-С-пептид, чтобы получить инсулин или желаемый аналог инсулина. Такие способы включают ферментативное превращение с помощью трипсина или протеазы Achromobacter lyticus в присутствии сложного эфира L-треонина с последующим превращением сложного треонинового эфира инсулина или аналога инсулина в инсулин или аналог инсулина посредством основного или кислотного гидролиза, как описано в спецификации патента США 4343898 или 4916212 или Research Disclosure, September 1994/487, сообщения которых включены здесь в виде ссылки.

Как описано ниже, конструировали предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина с синтетическими С-пептидами, содержащими, по меньшей мере, одну ароматическую аминокислоту (пример 1). Экспрессирующие плазмиды Saccharomyces cerevisiae, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую заявленные предшественники инсулина или аналоги предшественников инсулина конструировали с помощью ПЦР и использовали для трансформации клетки-хозяина S. cerevisiae. Количество экспрессированного продукта, например аналога инсулина, измеряли в виде процента от соответствующего контрольного уровня, например Asp^B28IP, в котором отсутствует мини-С-пептид (таблица 1) и Asp^B28IP(AlaAlaLys) с мини-С-пептидом без остатка ароматической аминокислоты (таблица 2). Новые С-пептиды согласно изобретению давали увеличенные выходы до уровней в 7 раз выше контрольного.

Данное изобретение далее подробно описано на следующих примерах, которые никоим образом не предназначены для того, чтобы ограничить рамки заявленного изобретения. Предполагается, что прилагаемые фигуры должны рассматриваться как неотъемлемые части спецификации и описания изобретения. Все цитированные ссылки специально включены здесь в виде ссылки в отношении всего, что в них описано.

ПРИМЕРЫ Общие процедуры

Все экспрессирующие плазмиды являются плазмидами С-РОТ-типа, сходными с плазмидами, описанными в ЕР 171142, характерной особенностью которых является содержание гена триозофосфатизомеразы (РОТ) Schizosaccharomyces pombe с целью селекции и стабилизации плазмид в S. cerevisiae. Плазмиды также содержат промотор и терминатор триозофосфатизомеразы S. cerevisiae. Указанные последовательности сходны с соответствующими последовательностями в плазмиде pKFN1003 (описанной в WO 90/100075), так же как и все последовательности, за исключением последовательности EcoRI-XbaI фрагмента, кодирующего слитый белок лидера и продукта предшественника инсулина. Чтобы экспрессировать разные слитые белки EcoRI-XbaI фрагмент плазмиды pKFN1003 просто заменяют EcoRI-XbaI фрагментом, кодирующим представляющее интерес слияние лидер-предшественник инсулина. Такие EcoRI-XbaI фрагменты можно синтезировать, используя синтетические олигонуклеотиды и ПЦР, стандартными способами.

Трансформанты дрожжей получали путем трансформации штамма-хозяина S. cerevisiae, штамма МТ663 (MATalMAT рер4-3/рер4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir⁺ ). Штамм дрожжей МТ663 депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и культур клеток (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) в связи с подачей заявки на патент WO 92/11378, и получил номер депозита DSM 6278.

МТ663 выращивали на YPGaL (1% дрожжевой бактоэкстракт, 2% бактопептон, 2% галактоза, 1% лактат) до OD при 600 нм, равной 0,6. 100 мл культуры собирали центрифугированием, промывали 10 мл воды, повторно центрифугировали и ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 1,2 М сорбит, 25 мМ Na₂ EDTA, pH 8,0 и 6,7 мг/мл дитиотреитола. Суспензию инкубировали при 30°С в течение 15 минут, центрифугировали и клетки ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 1,2 М сорбит, 10 мМ Na₂ EDTA, 0,1 М цитрат натрия, pH 5,8, и 2 мг Novozym®234. Суспензию инкубировали при 30°С в течение 30 минут, клетки собирали центрифугированием, промывали в 10 мл 1,2 М сорбита и 10 мл CAS (1,2 М сорбит, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ Трис-HCl (Трис = Трис(гидроксиметил)аминометан) pH 7,5) и ресуспендировали в 2 мл CAS. Для трансформации 1 мл клеток, суспендированных в CAS, смешивали примерно с 0,1 мг плазмидной ДНК и оставляли при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляли 1 мл раствора (20% полиэтиленгликоль 4000, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5) и смесь оставляли еще на 30 минут при комнатной температуре. Смесь центрифугировали, осадок ресуспендировали в 0,1 мл SOS (1,2 М сорбит, 33% об./об. YPD, 6,7 мМ CaCl₂) и инкубировали при 30°С в течение 2 часов. Затем суспензию центрифугировали и осадок ресуспендировали в 0,5 мл 1,2 М сорбита. Затем добавляли 6 мл верхнего агара (среда SC Sherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, содержащая 1,2 М сорбита плюс 2,5% агара) при 52°С и суспензию наливали сверху чашек, содержащих такую же агаризованную среду, содержащую сорбит.

Штамм МТ663 S. cerevisiae, трансформированный экспрессирующими плазмидами, выращивали в YPD в течение 72 час при 30°С. Количественный анализ выхода предшественника инсулина в надосадках культур осуществляли анализом обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя в качестве внешнего стандарта инсулин человека (Snel and Damgaard (1988) Proinsulin heterogenity in pigs. Horm. Metabol. Res. 20: 476-488).

Пример 1

Конструирование синтетических С-пептидов с ароматической аминокислотой(ами)

Синтетические гены, кодирующие слитые белки, состоящие из Asp^8B8IP, связанного с лидерной последовательностью, состоящей из препептида (сигнального пептида) и пропептида, конструировали, используя ПЦР в стандартных условиях (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press) и полимеразу E.H.F. (Boehringer Mannheim GmbH, Sandhoefer Strasse 116, Mannheim, Germany). Полученные в результате фрагменты ДНК выделяли и расщепляли эндонуклеазами, очищали, используя набор для очистки генов (Bio101 Inc., La Jolla, CA, USA). Для лигирования ДНК использовали стандартные способы, трансформацию клеток Е. coli осуществляли CaCl₂-способом (Sambrook et al. (1989), выше). Плазмиды очищали из трансформированных клеток, используя колонки QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Germany). Определяли нуклеотидные последовательности, используя систему секвенирования ДНК ALF Pharmacia Biotech с очищенной двунитевой плазмидной ДНК в качестве матрицы. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР получали из DNA technology (Arhus, Denmark).

Экспрессию секретируемого Asp^B28IP в S. cerevisiae осуществляли, используя штамм МТ663 S. cerevisiae и экспрессирующий дрожжевой вектор СРОТ на основе 2 мкм-плазмиды (смотри фиг.1), как описано в Thim, L. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6766-6770. Экспрессирующий дрожжевой вектор содержит ген триозофосфатизомеразы (РОТ) Schizosaccharomyces pombe для селекции и стабилизации плазмиды в S. cerevisiae. Кроме того, используют промотор и терминатор гена триозофосфатизомеразы (ТРИ) S. cerevisiae для инициации и терминации транскрипции рекомбинантного гена, кодирующего слитый белок лидер-Asp^B28IP. Секрецию Asp^B28IP обеспечивали лидером -фактора, хотя можно использовать множество известных дрожжевых лидерных последовательностей.

Как показано на фиг.1, экспрессирующая плазмида рАК721 S. cerevisiae, которая экспрессирует слитый белок лидер LA19-ЕЕАЕАЕАЕРК (SEQ ID NO:3)-1Р, конструировали на основе челночной плазмиды РОТ S. cerevisiae - E. coli(патент США 5871957). На фиг 1. L-IP обозначает кассету, экспрессирующую слитый белок, кодирующую слитый белок лидер-IP; TPI-ПРОМОТОР означает промотор TPI1 S. cerevisiae, а TPI-ТЕРМИНАТОР означает терминатор TPI1 S. cerevisiae; TPI-POMBE обозначает ген РОТ S. pombe, используемый для селекции в S. cerevisiae; НАЧАЛО РЕПЛИКАЦИИ обозначает начало репликации S. cerevisiae, полученное из 2 мкм-плазмиды; AMP-R обозначает ген (S-лактамазы, придающий устойчивость к ампициллину, облегчающий селекцию в Е coli, и НАЧАЛО РЕПЛИКАЦИИ-PBR322 обозначает начало репликации Е. coli.

ДНК, кодирующую ряд слитых белков лидерных последовательностей и Asp^B28IP с различными мини-С-пептидами, создавали посредством ПЦР, используя в качестве праймеров соответствующие олигонуклеотиды, которые описаны ниже. Использовали стандартные способы для того, чтобы субклонировать фрагменты ДНК, кодирующие слитые белки лидер-Asp⁸²⁸ IP, в экспрессирующем векторе СРОТ в следующем составе: лидер-Lys-Arg-спейсер-Asp ^B28IP, где Lys-Arg является потенциальным диосновным сайтом процессинга эндопротеазой и спейсер является N-концевым удлинением. Чтобы оптимизировать процессинг слитого белка эндопротеазой Кех2 S. cerevisiae, ДНК, кодирующую спейсерный пептид (N-концевое удлинение), например, ЕЕАЕАЕАРК (SEQ ID NO: 4), встраивали между ДНК, кодирующими лидер и Asp^B28IP (Kjeldsen et al. (1996) Gene 170, 107-112.). Однако наличие спейсерного пептида не обязательно. Зрелый Asp^B28IP секретировался в виде одноцепочечного предшественника инсулина с удлиненным N-концом и мини-С-пептидом, связывающим Lys^B29 и Gly^A1 . После очистки Asp^B28IP и протеолитического удаления удлинения N-конца и мини-С-пептида к Lys^B29 можно добавить аминокислоту Thr⁸³⁰ с помощью опосредованной ферментом транспептидации, чтобы получить Asp⁸²⁸-инсулин человека (Markussen, et al. (1987) in «Peptides 1986» (Theodoropoulos, D., Ed.), p.189-194, Walter de Gruyter and Co., Berlin.).

Разработку синтетических мини-С-пептидов осуществляли рандомизацией одного или нескольких кодонов, кодирующих аминокислоты в мини-С-пептиде. Характерной особенностью всех синтетических мини-С-пептидов является сайт ферментативного процессинга (Lys) на С-конце, который позволяет осуществлять ферментативное удаление синтетического мини-С-пептида (патент США 4916212, специально включенный здесь в виде ссылки). Рандомизацию выполняли, используя олигонуклеотиды с изменяемой структурой, которые вводили изменения кодона(нов) в одном или нескольких положениях синтетических мини-С-пептидов. Обычно изменяли структуру одного из двух праймеров (олигонуклеотидов), используемых для ПЦР. Примером пары олигонуклеотидов, используемой для создания методом ПЦР лидер-Asp^B28IP со случайными синтетическими мини-С-пептидами, применяемой для создаваемых синтетических мини-С-пептидов общей формулы: Xaa-Trp-Lys (XWK), являются следующие олигонуклеотиды:

Праймер А: 5'-ТАААТСТАТААСТАСААААААСАСАТА-3' (SEQ ID NO:13) и

Праймер В: 3'-CCAAAGAAGATGTGACTGTTCNNMACCTTCCCATAGCAACTT GTTACAACATGAAGATAGACAAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATCAGATCTTT GA-TTC-5' (SEQ ID NO:14), где N означает А, С, G или Т, а М означает С или А.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР обычно выполняли, как указано ниже: 5 мкл праймера А (20 пмоль), 5 мкл праймера В (20 пмоль), 10 мкл 10 × буфера для ПЦР, 8 мкл смеси дНТФ, 0,75 мкл фермента E.H.F., 1 мкл плазмиды рАК1150 в качестве матрицы (примерно 0,2 мкг ДНК) и 70,25 мкл дистиллированной воды.

Обычно выполняли от 10 до 15 циклов, один цикл обычно представлял собой 94°С в течение 45 сек.; 55°С в течение 1 мин; 72°С в течение 1,5 мин. Затем смесь ПЦР наносили на 2% агарозный гель и выполняли электрофорез, используя стандартные способы. Полученный в результате фрагмент ДНК вырезали из агарозного геля и выделяли с помощью набора для очистки генов.

На фиг.2 показана последовательность ДНК рАК1150, используемая в качестве матрицы для ПЦР, и рассчитанные аминокислоты кодируемого слитого белка ( -фактор-лидер-ЕЕАЕАЕАРК (SEQ ID NO:4)-Asp^B28 IP плазмиды рАК1150 (SEQ ID NO:5 и 6). Плазмида рАК1150 сходна с рАК721, показанной на фиг.1. С-конец лидера -фактора модифицировали для того, чтобы ввести сайт рестрикции эндонуклеазой Nco I, который изменяет рассчитанные аминокислотные последовательности с SerLeuAsp на SerMetAla. Кроме того, кодируемый Asp^B28IP не содержит мини-С-пептида, a Lys непосредственно связан с Gly^A1.

Очищенный ПЦР-фрагмент ДНК растворяли в воде и буфере для эндонуклеаз рестрикции и расщепляли подходящими рестрикционными эндонуклеазами (например, Bgl II и Xba I) стандартными способами. BglII-Xbal-фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле и очищали, используя набор для очистки генов.

Экспрессирующую плазмиду рАК1150 или сходную плазмиду СРОТ-типа. (смотри фиг.1) расщепляли эндонуклеазами рестрикции Bgl II и Xba I и выделяли фрагмент вектора длиной 10765 пар нуклеотидных оснований, используя набор для очистки генов.

Два расщепленных и выделенных фрагмента ДНК (фрагмент вектора и ПЦР-фрагмент) лигировали вместе, используя ДНК-лигазу Т4 и стандартные условия. Затем лигированной смесью трансформировали компетентный штамм Е. coli (R-, М+), после чего проводили селекцию на устойчивость к ампициллину. Плазмиды из полученных в результате клеток Е. coli выделяли с использованием колонок QIAGEN.

Затем плазмиды использовали для трансформации подходящего штамма-хозяина S. cerevisiae, например, МТ663 (MATalMAT рер4-3/рер4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir⁺ ). Отдельные трансформированные клоны S. cerevisiae выращивали в жидкой культуре и определяли количество Asp^B28IP, секретированного в надосадки культуры, с помощью ОФ-ВЭЖХ. Затем определяли последовательность ДНК, кодирующую синтетический мини-С-пептид экспрессирующих плазмид клонов S. cerevisiae, секретирующих повышенное количество Asp^B28IP. Затем идентифицированную последовательность синтетического мини-С-пептида можно подвергнуть еще одному раунду рандомизированной оптимизации.

Пример последовательности ДНК, кодирующей слитый белок лидер-Asp⁸²⁸IP(GluTrpLys), содержащий синтетический мини-С-пептид (GluTrpLys), полученный в результате описанного способа рандомизированной оптимизации, показан на фиг.3 (SEQ ID NO:7 и 8).

В таблице 1 и 2 показаны аналоги предшественников инсулина, созданные описанным выше способом, и выход продукции, выраженный в виде процента от контроля. Ферментацию проводили при 30°С в течение 72 час в 5 мл YPD. Выход предшественника инсулина определяли посредством ОФ-ВЭЖХ в надосадке культуры и выражали относительно выхода в контрольном штамме, экспрессирующем либо слитый белок лидер-Asp^B28IP, в котором остаток В29 связан с остатком А1 пептидной связью; либо слитый белок лидер-Asp^B28IP, в котором остаток В29 связан с остатком А1 мини-С-пептидом, соответственно. В таблицах « *» указан лидер -фактора, в котором С-конец до LysArg был изменен с «SLD (SerLeuAsp)» на «SMA (SerMetAla)», и «ех4» обозначено N-концевое удлинение с аминокислотной последовательностью ЕЕАЕАЕАРК (SEQ ID NO:4). YАР3 означает сигнальную последовательность YAP3, ТА39 означает синтетическую пропоследовательность QPIDDTESNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAGGLDVVNLISMAKR (SEQ ID NO:16). Последовательность EEGEPK (SEQ ID NO:17) представляет собой N-концевое удлинение В-цепи аналога инсулина. ТА57 означает синтетическую пропоследовательность QPIDDTESQTTSVNLMADDTESA FATQTNSGGLDVVGLISMAKR (SEQ ID NO:18).

ТАБЛИЦА 1
Лидер-N-концевое удлинение	Предшественник		Мини-С-пептид		Выход*		SEQ ID NO;
*-ех4	AspB28IP (control)		None		100
*-ех4	AspB28IP		MetTrpLys		378
*-ех4	AspB28IP		AlaTrpLys		270
*-ех4	AspB28IP		ValTrpLys		284
*-ех4	AspB28IP		IleTrpLys		330
*-ех4	AspB28IP		LeuTrpLys		336
*-ех4	AspB28IP		LysTrpLys		288
*-ех4	AspB28IP		GluGluPheLys		272		SEQ ID NO:15
*-ех4	AspB28IP		GluPheLys		379
*-ех4	AspB28IP		GluTrpLys		374
*-ех4	AspB28IP		SerTrpLys		226
*-ех4	AspB28IP		ThrTrpLys		270
*-ех4	AspB28IP		ArgTrpLys		227
*-ех4	AspB28IP		GluMetTrpLys		212		SEQ ID NO:1
*-ех4	AspB28IP		GlnMetTrpLys		239		SEQ ID NO:2
ТАБЛИЦА 2
Лидер-N-концевое удлинение		Предшественник		Мини-С-пептид		Выход*		SEQ ID NO:
*-ех4		AspB28IP (control)		AlaAlaLys		100
*-ех4		AspB28IP		GluTrpLys		626
*-ех4		AspB28IP		GluTyrLys		466
*-ех4		AspB28IP		GluPheLys		444
*-ех4		AspB28IP		AspTrpLys		460
YAP3-TA57-EEGEPK		AspB28IP		GluTrpLys		767		(SEQ ID NO:17)
YАР3-ТА39-EEGEPK		Asp B28IP		MetTrpLys		687		(SEQ ID NO:17)

Пример 2

Определение структуры Asp³²⁸IP (MetTrpLys) в водном растворе способом ЯМР-спектроскопии ЯМР-спектроскопия.

Образцы для ЯМР готовили растворением лиофилизированного белкового порошка в 10/90 D₂O/H₂O с 10 мМ фосфатным буфером, и рН доводили до нужного значения добавлением небольших объемов 1 М DCl или NaOD. Все показания рН-метра даны без корректировки на влияние изотопа. Образцы Asp⁸²⁸IP (MetTrpLys) для ЯМР готовили в концентрациях в пределах от 25 мкМ до 1 мМ при рН 8,0. Двумерные спектры ¹H-¹Н-ЯМР 1 мМ образцов, DQF-COSY (Piantini et al. (1982) J. Am. Chem. Soc. 104: 6800-6801, Rance et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117: 479-485), TOCSY (Braunschweiler et al. (1983) J. Magn. Reson. 53: 521-528, Bax et al. (1985) J. Magn. Reson. 65: 355-360) и NOESY (Jeener et al. (1979) J. Chem. Phys. 71: 4546-4553) записывали при 600 МГц на ЯМР-спектрометре Varian Unity Inova, оборудованном ¹H/¹³С/¹⁵N-датчиком тройного резонанса с самоэкранированной градиентной катушкой по трем осям, используя стандартные импульсные последовательности из библиотеки Varian для пользователей. Рабочая температура была установлена на уровне 27°С. Для каждого фазочувствительного двумерного ЯМР-спектра получали 512 t₁-инкрементов, каждый с 2048 или 4096 реальными точками данных, способом TPPI-States (Marion et al. (1989) J. Magn. Reson. 85: 393-399). Использовали ширину спектров, равную 6983 Гц, в обоих измерениях, при этом опорная частота была расположена точно на резонансном сигнале воды, который подавляли либо насыщением между сканами в течение 1,5 сек, либо селективным возбуждением импульсной последовательностью возбуждения заданного градиента (WATERGATE, Piotto et al. (1992) J. Biomol. NMR 2: 661-665). Спектры DQFCOSY записывали, используя градиентно-усиленную версию с применением градиентов под магическим углом (Mattiello et al. (1996) J. Am. Ch'em. Soc. 118: 3253-3261). Для спектров TOCSY использовали время смешивания от 30 до 80 мсек, а для NOESY время смешивания составляло от 50 до 200 мсек.

Обработку двумерных ЯМР-спектров осуществляли с использованием пакета программ Xwinnmr (версия 2.5, компьютерная программа для обработки данных ЯМР Bruker Analytische Messtechnik GmbH, D-76275 Ettlingen, Germany). Каждое измерение обрабатывали с аподизацией сдвинутого «колокола» функции синуса и заполнением нулями, выполненном один раз в каждом измерении. При необходимости применяли корректировки базовой линии, используя стандартные способы Xwinnmr.

Спектральное отнесение, интегрирование кросс-пиков, специфичное отнесение последовательностей, стереоспецифичное отнесение и все другие типы обработок выполняли, используя программу PRONTO (PRONTO Software Development and Distribution, Copenhagen Denmark) (Kjaer et al. (1991) NATO ASI Series (Hoch, J.C., Redfield C., and Poulsen, F.M., Eds.) Plenum, New York). Химические сдвиги измеряли в м.д., и резонансный сигнал воды устанавливали при 4,75 м.д.

Расчеты структуры. Ограничения расстояний для последующего расчета структуры получали из интегрированных кросс-пиков NOESY, классифицированных как слабые, средние или сильные, соответствующие верхним ограничениям расстояний 5,5; 3,3 и 2,7 Å, соответственно. Что касается ограничений расстояний, относящихся к метильным группам, к верхнему пределу дополнительно добавляли 0,5 Å (Wagner et al. (1985) J. Mol. Biol. 196: 611-639). Расчеты структур выполняли, используя гибридный способ, объединяющий геометрию расстояний (Crippen et al. (1988) Distance Geometry and Molecular Conformation, Research Studies Press, Taunton, Somerset, England; Kuszewski et al. (1992) J. Biomol NMR 2: 33-56) и модельный отжиг, основанный на идеях Nilges et al. (1988) FEBS Lett. 229: 317-324, используя Х-PLOR 3.0 (Brünger (1992) версия 3.1 X-PLOR: A System for X-ray Crystallography and NMR, Yale University Press, New Haven) в соответствии с примерами, приведенными в руководстве X-PLOR manual (dg_sub_embed.inp.dgsa.inp,refine.inp). Номера остатков взяты из стандартной нумерации остатков инсулина, остатки в В-цепи пронумерованы В1-29, остатки в С-пептиде (например, MetTrpLys) пронумерованы С1-С3, и остатки в А-цепи пронумерованы А1-А21.

При спектральном отнесении ЯМР-спектра для большинства резонансов следовали стандартному способу последовательного отнесения, описанного Wüthrich (1986 NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York). Стандартный способ отнесения был неудачным в том случае, когда протон амида отдельного остатка аминокислоты быстро обменивался с протонами в воде. При рН 8,0 это имело место для нескольких аминокислотных остатков, однако сравнение с более ранними отнесениями ЯМР-спектров мутантного инсулина и идентификация соседних (в пространстве) аминокислотных остатков с помощью NOE дают возможность для получения почти полного спектрального отнесения. Анализ спектров NOESY показал, что несколько аминокислотных остатков образуют сеть взаимодействия NOE с окружающими остатками, сходную с взаимодействием, которое ранее было установлено для других молекул инсулина, т.е. мутанта His^B16 инсулина человека (Ludvigsen et al. (1994) Biochemistry 33: 7998-8006), и указанные сходные связи были обнаружены для остатков В1-В10, В13-В14, В17-В24 и А4-А21. Кроме того, ограничения двугранных углов для перечисленных выше остатков приняты, исходя из ограничений, использованных ранее (Ludvigsen et al. (1994), выше).

Несколько аминокислот, в частности В27-В29, С1-С3, А1-А3, имеют картины кросс-пиков, которые согласуются с пептидными цепями, которые менее упорядочены, чем хорошо определенные элементы вторичной структуры в большинстве случаев. Таким образом, дополнительные величины NOE превращали в ограничения расстояний без какой-либо дальнейшей классификации, кроме верхних пределов 5,5 Å или 6,0 Å в том случае, если включали метильную группу. Рассчитывали набор 20 конвергентных структур (фиг.5) и соответствующие параметры конвергентных структур перечислены в таблице 3. Каждое значение NOE, которое здесь идентично ограничению расстояния, рассчитано только один раз, даже хотя оно может несколько раз встречаться в спектре NOESY. Качественное отнесение на карте Рамачандрана представляет собой стандартные качественные параметры для оценки особенности локальной геометрии. В общем, описанные качественные параметры сравнимы со структурами белков, основанными на рентгеноструктурном анализе при разрешении 2,5 Å (Laskowski et al. (1996) J. Biomol. NMR 8: 477-486).

Описание рассчитанной структуры

Характерная структура, наиболее близкая к средней из группы, показана на фиг.6. Asp^B28IP (MetTrpLys) структурно сходен со структурой нативного инсулина в районах, содержащих остатки В1-В10, В14-В23, А4-А21. Различия, главным образом, четко выражены в районах вблизи соединительного пептида в положениях В26-В29, С1-С3, А1-А3 и менее выражены для остатков В11-В13. Структура Asp^B28 IP (MetTrpLys) вблизи С-пептида значительно отличается от структуры, подобной нативной структуре (Ludvigsen (1994) выше). Боковые цепи метионина и триптофана в Asp^B28IP(MetTrpLys) открывают традиционную структуру кора инсулина, отодвигая в одну сторону боковые цепи отдельных Tyr^B26 и Phe^B25 и оставляя интактным другой обычный близлежащий гидрофобный участок, состоящий из боковых цепей Leu^B11, Val ^B12, Ile^A2 и Tyr^A19. Указанный карман, полученный передвижением Phe^B25, Tyr^B26 и пептидная цепь, образованная остатками с В25 по В29, по-видимому, хорошо подходят для размещения боковых цепей Met^C1 и Trp^C2 из С-пептида. Несколько NOE от указанных двух боковых цепей к близлежащим в структуре остаткам подтверждают указанное новое расположение боковых цепей, не наблюдаемое ранее ни в одной структуре инсулина. Met^C1 размещается в кармане, образованном остатками Leu^B15, Phe^B24 , Tyr^B26, Trp^C1 Ile^A2 и Tyr ^A19, все из которых имеют NOE с Met^C1. Trp ^C2 имеет даже более протяженную сеть NOE, но в результате факта обмена протона амида индола можно отнести только четыре резонанса, относящихся к ароматической кольцевой системе Trp ^C2. Несмотря на это в спектре NOESY Asp^B28IP (Met Trp Lys) было обнаружено 21 NOE между остатками между Trp ^C2 и соседними с ним положениями, занятыми Leu^B11 , Val^B12, Leu^B15, Tyr^B26, Met ^C1 и Ile^A2.

Присутствие боковой цепи триптофана в кармане также оказывает большое влияние на химические сдвиги, наблюдаемые в спектре Asp^B28IP(Met Trp Lys). В условиях, используемых- для ЯМР на спектры Asp^B28IP(Met Trp Lys) в некоторой степени влияет самоассоциация (фиг.7), но обмен между мономером и димером на временной шкале ЯМР наблюдается только как среднее между двумя состояниями. Между концентрациями 25 мкМ и 0,2 мМ степень самоассоциации не меняется, как видно при ЯМР.

В таблице 4 показаны химические сдвиги Asp ^B28IP (MetTrpLys) при 27° по Цельсию, полученные при 600 мГц, рН 8 в 10%/90% D₂O/H₂O с 10 мМ фосфатным буфером. Химические сдвиги сравнивали с эталоном при установке остаточного сигнала воды при 4,75 м.д. N/A означает, что нет отнесения. Отнесения Asp^B28IP (MetTrpLys) - (1-29=В1-В29; 30-32=C1-C3 и 33-53=A1-A21), и таблица 5 дает координаты атомов Asp^B28IP (MetTrpLys) в форме PDB.

Таблица 4
Отнесения ЯМР-спектров для AspB28IP (MetTrpLys)
Система спинов HN		НА	Другие
Phe-1		4.52	HB#a: 2.976, HB#b: 3.040, HD#: 7.104, HE#: 7.214, HZ: 7.177
Val-2	N/А	N/А	HB: N/A, HG#a: N/A, HG#b: N/A
Asn-3		N/A	HB#a: N/A, HB#b: N/A, HD2#a: N/A, HD2#b: N/A
Glu-4		N/А	HB#a: N/A, HB#b: N/A
His-5		4.30	HB#a: 3.311, HB#a: 2.992, HD2: 6.850, HE1: 7.605
Leu-6		4.47	HB#a: 1.635, HB#b: 0.807, HG: 1.506, HD#a: 0.753 HD#b: 0.675
Cys-7	8.30	4.83	HB#a: 2.901, HB#b: 3.173
Gly-8		N/А, N/А
Ser-9		N/А	HB#: N/A
His-10	N/A	4.41	HB#a: 3.140, HB#b: 3.351, HD2: 7.112, HE1: 7.729
Leu-11	N/A	3.93	HB#a: N/A, HB#b: 1.143, HG: 1.257, HD#a: 0.375, HD#b: 0.559
Val-12	7.25	3.37	HB: 2.000, HG#a: 0.849, HG#b: N/A
Glu-13	N/А	N/A	HB#a: N/A, HB#a: N/A, HG#b: N/A
Ala-14	7.71	3.98	HB#: 1.307
Leu-l5	7.83	3.74	HB#a: 0.671, HB#b: 1.254, HG: 1.157, HD#a: N/A, HD#b: 0.295
Tyr-16	8.15	4.31	HB#a: 3.115, HD#: 7.204, HE#: 6.734
Leu-17	7.99	4.05	HB#A: 2.004, HB#b: 1.849, HG: 1.732, HD#a: 0.900, HD#b: 0.879
Val-18	8.49	3.71	HB: 1.996, HG#a: 0.994, HG#b: 0.834
Cys-19	8.57	4.81	HB#a: 2.820, HB#b: 3.250
Gly-20	7.75	3.96, N/A
Arg-22	N/А	N/А	HB#a: N/A, HB#b: N/A, HG#a: N/A, HG#b: N/A, HD#a: N/A, HD#b: N/A
Gly-23	7.12	4.06, 3.76
Phe-24	7.56	4.99	HB#a: 2.971, HB#b: 3.206, HD#: 6.746, HE#: 6.877, HZ: N/A
Phe-25	N/А	4.78	HB#a: 3.051, HB#b: N/A, HD#: 7.172, HE#: 7.249
Tyr-26	N/А	4.63	HB#a: 2.770, HB#b: N/A, HD#: 6.694, HE#: 6.291
Thr-27	N/A	N/А	HB: N/A, HG2#: N/A
Asp-28	N/А	N/А	HB#a: N/A, HB#b: N/A
Lys-29
Met-30	7.84	4.18	HB#: 2.627, HG#: 2.904, HE#: 2.110
Trp-31		4.19	HB#a: 3.182, HE3: 7.037, HH2: 6.763, HZ2: 7.147, HZ3: 6.437
Lys-32
Gly-33		N/A, N/A
Ile-34	7.98	3.53	HB: 0.953, HG1#a: 0.382, HG1#b: 0.562, HG2#: 0.234, HD#: 0.029
Val-35	7.75	N/A, 4.00	HB: N/A, HB: 1.925, HG#a: N/A, HG#b: N/A, HG#b: 0.807
Glu-36	N/А	N/А	HB#a: N/A, HG#a: N/A
Gln-37	7.73	3.96	HB: 2.033, HG#: 2.313
Cys-38	8.24	4.89	HB#a: 3.103, HB#b: 2.700
Cys-39	N/А	N/А	HB#a: N/A, HB#b: N/A
Thr-40		3.95	HB: 4.411, HG2#: 1.167
Ser-41	6.97	4.59	HB#a: 3.698, HB#b: 3.867
Ile-42	7.59	4.32	HB: 1.399, HG1#a: N/A, HG2#: 0.573, HD#: 0.389
Cys-43	N/А	N/А	HB#a: N/A
Ser-44	N/А	N/A	HB#a: N/A, HB#b: N/A
Leu-45		3.86	HB#a: 1.412, HB#b: 1.489, HG: 1.565, HD#a: 0.808, HD#b: 0.733
Tyr-46	7.59	4.27	HB#a: 2.938, HD#: 7.049, HE#: 6.784
Gln-47	7.49	3.87	HB#a: 2.235, HB#b: 1.948, HG#a: 2.305, HG#b: 2.076
Leu-48	7.66	4.11	HB#a: 1.930, HB#b: 1.409, HG: 1.683, HD#a: 0.677, HD#b: N/A
Glu-49	7.75	4.12	HB#a: N/A, HB#b: 1.935, HG#a: 2.291, HG#b: 2.191
Asn-50	7.21	4.34	HB#a: 2.363, HB#b: N/A
Tyr-51	7.76	4.50	HB#a: 3.269, HB#b: 2.774, HD#: 7.250, HE#: 6.670
Cys-52	7.35	5.01	HB#a: 2.785, HB#b: 3.322
Asn-53	8.18	4.40	HB#a: 2.555, HB#b: 2.716, HD2#a: 7.426, HD2#b: N/A

Таблица 5
Координаты атомов AspB28IP (MetTrpLys) в формате PDB.
ATOM	1	CA	РНЕ	1	-6.075	-6.762	-0.761	1.00	0.00
ATOM	2	НА	РНЕ	1	-5.526	-6.571	0.150	1.00	0.00
ATOM	3	СВ	РНЕ	1	-5.359	-6.093	-1.942	1.00	0.00
ATOM	4	ВВ1	РНЕ	1	-5.934	-6.258	-2.842	1.00	0.00
ATOM	5	ВВ2	РНЕ	1	-4.382	-6.535	-2.061	1.00	0.00
ATOM	6	CG	РНЕ	1	-5.208	-4.597	-1.715	1.00	0.00
ATOM	7	CD1	РНЕ	1	-4.925	-4.081	-0.436	1.00	0.00
ATOM	8	BD1	РНЕ	1	-4.817	-4.749	0.405	1.00	0.00
ATOM	9	CD2	РНЕ	1	-5.346	-3.722	-2.799	1.00	0.00
ATOM	10	HD2	РНЕ	1	-5.563	-4.112	-3.783	1.00	0.00
ATOM	11	СЕ1	РНЕ	1	-4.787	-2.702	-0.251	1.00	0.00
ATOM	12	НЕ1	РНЕ	1	-4.573	-2.308	0.732	1.00	0.00
ATOM	13	СЕ2	РНЕ	1	-5.204	-2.341	-2.612	1.00	0.00
ATOM	14	НЕ2	РНЕ	1	-5.310	-1.668	-3.451	1.00	0.00
ATOM	15	CZ	РНЕ	1	-4.926	-1.831	-1.338	1.00	0.00
ATOM	16	HZ	РНЕ	1	-4.818	-0.768	-1.195	1.00	0.00
ATOM	17	C	РНЕ	1	-7.491	-6.201	-0.628	1.00	0.00
ATOM	18	O	РНЕ	1	-8.361	-6.497	-1.425	1.00	0.00
ATOM	19	N	РНЕ	1	-6.144	-8.234	-0.995	1.00	0.00
ATOM	20	НТ1	РНЕ	1	-6.303	-8.723	-0.091	1.00	0.00
ATOM	21	HT2	РНЕ	1	-5.250	-8.560	-1.415	1.00	0.00
ATOM	22	HT3	РНЕ	1	-6.930	-8.446	-1.642	1.00	0.00
ATOM	23	N	VAL	2	-7.730	-5.399	0.380	1.00	0.00
ATOM	24	HN	VAL	2	-7.013	-5.181	1.011	1.00	0.00
ATOM	25	CA	VAL	2	-9.095	-4.819	0.578	1.00	0.00
ATOM	26	НА	VAL	2	-9.838	-5.571	0.354	1.00	0.00
ATOM	27	CB	VAL	2	-9.270	-4.345	2.030	1.00	0.00
ATOM	28	HB	VAL	2	-8.787	-3.387	2.154	1.00	0.00
ATOM	29	CG1	VAL	2	-10.760	-4.206	2.339	1.00	0.00
ATOM	30	HG11	VAL	2	-11.281	-3.863	1.457	1.00	0.00
ATOM	31	HG12	VAL	2	-10.897	-3.493	3.139	1.00	0.00
ATOM	32	HG13	VAL	2	-11.156	-5.164	2.641	1.00	0.00
ATOM	33	CG2	VAL	2	-8.653	-5.362	3.001	1.00	0.00
ATOM	34	HG21	VAL	2	-8.836	-6.363	2.637	1.00	0.00
ATOM	35	HG22	VAL	2	-9.103	-5.245	3.976	1.00	0.00
ATOM	36	HG23	VAL	2	-7.589	-5.193	3.071	1.00	0.00
ATOM	37	С	VAL	2	-9.279	-3.628	-0.369	1.00	0.00
ATOM	38	O	VAL	2	-8.349	-2.692	-0.637	1.00	0.00
ATOM	39	Н	ASN	3	-10.473	-3.437	-0.874	1.00	0.00
ATOM	40	HN	ASN	3	-11.204	-4.045	-0.641	1.00	0.00
ATOM	41	CA	ASN	3	-10.725	-2.296	-1.806	1.00	0.00
ATOM	42	НА	ASN	3	-9.782	-1.927	-2.184	1.00	0.00
ATOM	43	СВ	ASN	3	-11.594	-2.772	-2.975	1.00	0.00
ATOM	44	ВВ1	ASN	3	-12.168	-1.940	-3.357	1.00	0.00
ATOM	45	ВВ2	ASN	3	-12.265	-3.545	-2.633	1.00	0.00
ATOM	46	CG	ASN	3	-10.702	-3.324	-4.087	1.00	0.00
ATOM	47	OD1	ASN	3	-9.628	-3.832	-3.824	1.00	0.00
ATOM	48	ND2	ASN	3	-11.103	-3.251	-5.327	1.00	0.00
ATOM	49	HD21	ASN	3	-11.968	-2.842	-5.538	1.00	0.00
ATOM	50	HD22	ASN	3	-10.539	-3.603	-6.046	1.00	0.00
ATOM	51	С	ASN	3	-11.448	-1.171	-1.055	1.00	0.00
ATOM	52	O	ASN	3	-12.648	-1.002	-1.182	1.00	0.00
ATOM	53	N	GLN	4	-10.727	-0.404	-0.276	1.00	0.00
ATOM	54	HN	GLN	4	-9.763	-0.562	-0.193	1.00	0.00

ATOM	55	CA	GLN	4	-11.370	0.711	0.484	1.00	0.00
ATOM	56	НА	GLN	4	-12.282	1.008	-0.011	1.00	0.00
ATOM	57	СВ	GLN	4	-11.690	0.260	1.917	1.00	0.00
ATOM	58	НВ1	GLN	4	-12.381	0.958	2.365	1.00	0.00
ATOM	59	НВ2	GLN	4	-10.779	0.237	2.498	1.00	0.00
ATOM	60	CG	GLN	4	-12.318	-1.136	1.905	1.00	0.00
ATOM	61	HG1	GLN	4	-11.533	-1.879	1.890	1.00	0.00
ATOM	62	НG2	GLN	4	-12.936	-1.245	1.028	1.00	0.00
ATOM	63	CD	GLN	4	-13.173	-1.325	3.160	1.00	0.00
ATOM	64	OE1	GLN	4	-13.712	-0.374	3.692	1.00	0.00
ATOM	65	NE2	GLN	4	-13.323	-2.522	3.660	1.00	0.00
ATOM	66	HE21	GLN	4	-12.892	-3.289	3.231	1.00	0.00
ATOM	67	HE22	GLN	4	-13.867	-2.653	4.465	1.00	0.00
ATOM	68	С	GLN	4	-10.410	1.903	0.543	1.00	0.00
ATOM	69	O	GLN	4	-9.424	1.950	-0.168	1.00	0.00
ATOM	70	N	HIS	5	-10.690	2.857	1.392	1.00	0.00
ATOM	71	HN	HIS	5	-11.488	2.787	1.958	1.00	0.00
ATOM	72	CA	HIS	5	-9.799	4.044	1.516	1.00	0.00
ATOM	73	НА	HIS	5	-9.334	4.246	0.562	1.00	0.00
ATOM	74	СВ	HIS	5	-10.622	5.258	1.951	1.00	0.00
ATOM	75	НВ1	HIS	5	-9.995	6.137	1.964	1.00	0.00
ATOM	76	HB2	HIS	5	-11.024	5.087	2.939	1.00	0.00
ATOM	77	CG	HIS	5	-11.749	5.459	0.974	1.00	0.00
ATOM	78	ND1	HIS	5	-12.883	4.665	0.982	1.00	0.00
ATOM	79	HD1	HIS	5	-13.076	3.934	1.608	1.00	0.00
ATOM	80	CD2	HIS	5	-11.918	6.343	-0.064	1.00	0.00
ATOM	81	HD2	HIS	5	-11.211	7.103	-0.355	1.00	0.00
ATOM	82	CE1	HIS	5	-13.677	5.080	-0.021	1.00	0.00
ATOM	83	HЕ1	HIS	5	-14.629	4.635	-0.264	1.00	0.00
ATOM	84	NE2	HIS	5	-13.136	6.102	-0.690	1.00	0.00
ATOM	85	С	HIS	5	-8.718	3.742	2.554	1.00	0.00
ATOM	86	O	HIS	5	-9.006	3.446	3.697	1.00	0.00
ATOM	87	N	LEU	6	-7.475	3.794	2.152	1.00	0.00
ATOM	88	HN	LEU	6	-7.277	4.020	1.219	1.00	0.00
ATOM	89	CA	LEU	6	-6.360	3.485	3.093	1.00	0.00
ATOM	90	НА	LEU	6	-6.687	2.754	3.815	1.00	0.00
ATOM	91	СВ	LEU	6	-5.180	2.923	2.298	1.00	0.00
ATOM	92	HВ1	LEU	6	-4.416	2.580	2.979	1.00	0.00
ATOM	93	HB2	LEU	G	-4.776	3.705	1.667	1.00	0.00
ATOM	94	CG	LEU	6	-5.654	1.752	1.428	1.00	0.00
ATOM	95	HG	LEU	6	-6.504	2-065	0.841	1.00	0.00
ATOM	96	CD1	LEU	6	-4.523	1.318	0.486	1.00	0.00
ATOM	97	HD11	LEU	6	-3.801	2.116	0.395	1.00	0.00
ATOM	98	HD12	LEU	6	-4.935	1.094	-0.487	1.00	0.00
ATOM	99	HD13	LEU	6	-4.039	0.437	0.881	1.00	0.00
ATOM	100	CD2	LEU	6	-6.058	0.574	2.328	1.00	0.00
ATOM	101	HD21	LEU	6	-5.710	-0.352	1.892	1.00	0.00
ATOM	102	HD22	LEU	6	-7.136	0.544	2.417	1.00	0.00
ATOM	103	HD23	LEU	6	-5.621	0.699	3.308	1,00	0.00
ATOM	104	С	LEU	6	-5.912	4.757	3.814	1.00	0.00
ATOM	105	O	LEU	6	-5.356	5.654	3.213	1.00	0.00
ATOM	106	N	CYS	7	-6.143	4.833	5.101	1.00	0.00
ATOM	107	HN	CYS	7	-6.585	4.090	5.563	1.00	0.00
ATOM	108	CA	CYS	7	-5.721	6.041	5.870	1.00	0.00
ATOM	109	НА	CYS	7	-4.835	6.453	5.422	1.00	0.00
ATOM	110	BB1	CYS	7	-7.133	7.322	6.855	1.00	0.00
ATOM	111	НВ2	CYS	7	-7.695	6.688	5.314	1.00	0.00
ATOM	112	С	CYS	7	-5.408	5.640	7.314	1.00	0.00
ATOM	113	O	CYS	7	-6.280	5.231	8.058	1.00	0.00

ATOM	114	CB	CYS	7	-6.844	7.087	5.846	1.00	0.00
ATOM	115	SG	CYS	7	-6.272	8.597	5.019	1.00	0.00
ATOM	116	N	GLY	8	-4.167	5.760	7.712	1.00	0.00
ATOM	117	HN	GLY	8	-3.488	6.094	7.050	1.00	0.00
ATOM	118	СА	GLY	8	-3.781	5.394	9.105	1.00	0.00
ATOM	119	HА1	GLY	S	-4.671	5.213	9.690	1.00	0.00
ATOM	120	НА2	GLY	8	-3.219	6.205	9.546	1.00	0.00
ATOM	121	С	GLY	8	-2.923	4-129	9.085	1.00	0.00
ATOM	122	O	GLY	8	-1.949	4.041	8.360	1.00	0.00
ATOM	123	N	SER	9	-3.278	3.150	9.877	1.00	0.00
ATOM	124	НН	SER	9	-4.068	3.251	10.451	1.00	0.00
ATOM	125	СА	SER	9	-2.490	1.883	9.916	1.00	0.00
ATOM	126	НА	SER	9	-1.437	2.116	9.986	1.00	0.00
ATOM	127	CB	SER	9	-2.912	1.063	11.135	1.00	0.00
ATOM	128	HB1	SER	9	-3.777	0.464	10.881	1.00	0.00
ATOM	129	HB2	SER	9	-3.164	1.724	11.947	1.00	0.00
ATOM	130	CG	SER	9	-1.837	0.222	11.531	1.00	0.00
ATOM	131	HG	SER	9	-1.789	-0.510	10.913	1.00	0.00
ATOM	132	С	SER	9	-2.751	1.076	8.643	1.00	0.00
ATOM	133	O	SER	9	-1.897	0.350	8.173	1.00	0.00
ATOM	134	N	HIS	10	-3.929	1.197	8.088	1.00	0.00
ATOM	135	HN	HIS	10	-4.599	1.790	8.489	1.00	0.00
ATOM	136	СА	HIS	10	-4.258	0.439	6.843	1.00	0.00
ATOM	137	НА	HIS	10	-4.122	-0.614	7.021	1.00	0.00
ATOM	138	CB	HIS	10	-5.720	0.706	6.456	1.00	0.00
ATOM	139	НВ1	HIS	10	-5.771	0.967	5.413	1.00	0.00
ATOM	140	HB2	HIS	10	-6.107	1.522	7.049	1.00	0.00
ATOM	141	CG	HIS	10	-6.547	-0.528	6.700	1.00	0.00
ATOM	142	ND1	HIS	10	-6.371	-1.687	5.963	1.00	0.00
ATOM	143	HD1	HIS	10	-5.723	-1.822	5.241	1.00	0.00
ATOM	144	CD2	HIS	10	-7.556	-0.797	7.591	1.00	0.00
ATOM	145	HD2	HIS	10	-7.945	-0.101	8.319	1.00	0.00
ATOM	146	СЕ1	HIS	10	-7.253	-2.594	6.419	1.00	0.00
ATOM	147	HE1	HIS	10	-7.345	-3.595	6.027	1.00	0.00
ATOM	148	NE2	HIS	10	-8.001	-2.104	7.412	1.00	0.00
ATOM	149	С	HIS	10	-3.332	0.880	5.701	1.00	0.00
ATOM	150	O	HIS	10	-3.149	0.160	4.737	1.00	0.00
ATOM	151	N	LEU	11	-2.755	2.052	5.797	1.00	0.00
ATOM	152	HN	LEU	11	-2.922	2.619	6.578	1.00	0.00
ATOM	153	СА	LEU	11	-1.851	2.536	4.713	1.00	0.00
ATOM	154	НА	LEU	11	-2.384	2.534	3.774	1.00	0.00
ATOM	155	CB	LEU	11	-1.392	3.961	5.031	1.00	0.00
ATOM	156	НВ1	LEU	11	-0.726	3.942	5.880	1.00	0.00
ATOM	157	HB2	LEU	11	-2.253	4.572	5.261	1.00	0.00
ATOM	158	CG	LEU	11	-0.658	4.543	3.823	1.00	0.00
ATOM	159	HG	LEU	11	0.144	3.879	3.533	1.00	0.00
ATOM	160	CD1	LEU	11	-1.635	4.701	2.655	1.00	0.00
ATOM	161	HD11	LEU	11	-2.565	5.114	3.017	1.00	0.00
ATOM	162	HD12	LEU	11	-1.821	3.735	2.209	1.00	0.00
ATOM	163	HD13	LEU	11	-1.209	5.362	1.916	1.00	0.00
ATOM	164	CD2	LEU	11	-0.082	5.912	4.194	1.00	0.00
ATOM	165	HD21	LEU	11	-0.855	6.660	4.114	1.00	0.00
ATOM	166	HD22	LEU	11	0.727	6.156	3.522	1.00	0.00
ATOM	167	HD23	LEU	11	0.288	5.883	5.207	1.00	0.00
ATOM	168	С	LEU	11	-0.628	1.620	4.604	1.00	0.00
ATOM	169	O	LEU	11	-0.303	1.133	3.539	1.00	0.00
ATOM	170	N	VAL	12	0.055	1.390	5.699	1.00	0.00
ATOM	171	HN	VAL	12	-0.226	1.800	6.543	1.00	0.00
ATOM	172	СА	VAL	12	1.265	0.514	5.663	1.00	0.00

ATOM	173	НА	VAL	12	1.903	0.819	4.847	1.00	0.00
ATOM	174	СВ	VAL	12	2.033	0.651	6.981	1.00	0-00
ATOM	175	НВ	VAL	12	1.442	0.243	7.787	1.00	0.00
ATOM	176	CG1	VAL	12	3.356	-0.110	6.883	1.00	0.00
ATOM	177	HG11	VAL	12	3.936	0.059	7.777	1.00	0.00
ATOM	178	HG12	VAL	12	3.909	0.239	6.023	1.00	0.00
ATOM	179	HG13	VAL	12	3.157	-1.167	6.778	1.00	0.00
ATOM	180	CG2	VAL	12	2.321	2.130	7.253	1.00	0.00
ATOM	181	HG21	VAL	12	2.917	2.534	6.446	1.00	0.00
ATOM	182	HG22	VAL	12	2.862	2.225	8.182	1.00	0.00
ATOM	183	HG23	VAL	12	1.390	2.673	7.322	1.00	0.00
ATOM	184	С	VAL	12	0.852	-0.950	5.461	1.00	0.00
ATOM	185	O	VAL	12	1.637	-1.764	5.009	1.00	0.00
ATOM	186	N	GLU	13	-0.365	-1.294	5.802	1.00	0.00
ATOM	187	HN	GLU	13	-0.978	-0.625	6.171	1.00	0.00
ATOM	188	СА	GLU	13	-0.827	-2.706	5.640	1.00	0.00
ATOM	189	НА	GLU	13	-0.099	-3.371	6.080	1.00	0.00
ATOM	190	СВ	GLU	13	-2.165	-2.882	6.361	1.00	0.00
ATOM	191	НВ1	GLU	13	-2.707	-3.703	5.916	1.00	0.00
ATOM	192	HВ2	GLU	13	-2.745	-1.975	6.270	1.00	0.00
ATOM	193	CG	GLU	13	-1.913	-3.185	7.840	1.00	0.00
ATOM	194	HG1	GLU	13	-2.783	-2.910	8.417	1.00	0.00
ATOM	195	HG2	GLU	13	-1.060	-2.619	8.182	1.00	0.00
ATOM	196	CD	GLU	13	-1.638	-4.680	8.016	1.00	0.00
ATOM	197	OE1	GLU	13	-2.032	-5.217	9.038	1.00	0.00
ATOM	198	OE2	GLU	13	-1.036	-5.261	7.128	1.00	0.00
ATOM	199	С	GLU	13	-1.001	-3.058	4.154	1.00	0.00
ATOM	200	O	GLU	13	-1.130	-4.219	3.805	1.00	0.00
ATOM	201	N	ALA	14	-1.020	-2.079	3.277	1.00	0.00
ATOM	202	HN	ALA	14	-0.923	-1.151	3.574	1.00	0.00
ATOM	203	СА	ALA	14	-1.200	-2.381	1.824	1.00	0.00
ATOM	204	НА	ALA	14	-1.699	-3.333	1.714	1.00	0.00
ATOM	205	СВ	ALA	14	-2.055	-1.288	1.178	1.00	0.00
ATOM	206	НВ1	ALA	14	-2.984	-1.191	1.722	1.00	0.00
ATOM	207	HВ2	ALA	14	-2.266	-1-556	0.152	1.00	0.00
ATOM	208	HB3	ALA	14	-1.522	-0.350	1.203	1.00	0.00
ATOM	209	C	ALA	14	0.160	-2.443	1.120	1.00	0.00
ATOM	210	O	ALA	14	0.340	-3.189	0.176	1.00	0.00
ATOM	211	N	LEU	15	1.114	-1.662	1.565	1.00	0.00
ATOM	212	HN	LEU	15	0.943	-1.065	2.324	1.00	0.00
ATOM	213	СА	LEU	15	2.459	-1.675	0.914	1.00	0.00
ATOM	214	НА	LEU	15	2.338	-1.551	-0.153	1.00	0.00
ATOM	215	СВ	LEU	15	3.309	-0.529	1.462	1.00	0.00
ATOM	216	НВ1	LEU	15	4.336	-0.661	1.152	1.00	0.00
ATOM	217	НВ2	LEU	15	3.256	-0.525	2.542	1.00	0.00
ATOM	218	CG	LEU	15	2.785	0.801	0.921	1.00	0.00
ATOM	219	HG	LEU	15	1.729	0.885	1.137	1.00	0.00
ATOM	220	CD1	LEU	15	3.533	1.956	1.590	1.00	0.00
ATOM	221	НD11	LEU	15	3.903	1.635	2.554	1.00	0.00
ATOM	222	HD12	LEU	15	2.863	2.791	1.723	1.00	0.00
ATOM	223	HD13	LEU	15	4.364	2.256	0.969	1.00	0.00
ATOM	224	CD2	LEU	15	3.006	0.859	-0.594	1.00	0.00
ATOM	225	НD21	LEU	15	2.950	1.884	-0.927	1.00	0.00
ATOM	226	HD22	LEU	15	2.243	0.278	-1.092	1.00	0.00
ATOM	227	HD23	LEU	15	3.978	0.456	-0.834	1.00	0.00
ATOM	228	С	LEU	15	3.156	-3.009	1.190	1.00	0.00
ATOM	229	O	LEU	15	3.865	-3.528	0.349	1.00	0.00
ATOM	230	N	TYR	16	2.957	-3.571	2.358	1.00	0.00
ATOM	231	HN	TYR	16	2.378	-3.135	3.018	1.00	0.00

ATOM	232	CA	TYR	16	3.606	-4.876	2.681	1.00	0.00
ATOM	233	НА	TYR	16	4.609	-4.869	2.277	1.00	0.00
ATOM	234	СВ	TYR	16	3.689	-5.037	4.230	1.00	0.00
ATOM	235	ВВ1	TYR	16	3.494	-4.076	4.686	1.00	0.00
ATOM	236	НВ2	TYR	16	4.688	-5.346	4.492	1.00	0.00
ATOM	237	CG	TYR	16	2.704	-6.057	4.783	1.00	0.00
ATOM	238	CD1	TYR	16	3.181	-7.209	5.421	1.00	0.00
ATOM	239	HD1	TYR	16	4.244	-7.371	5.517	1.00	0.00
ATOM	240	CD2	TYR	16	1.324	-5.846	4.659	1.00	0.00
ATOM	241	HD2	TYR	16	0.954	-4.960	4.166	1.00	0.00
ATOM	242	СЕ1	TYR	16	2.282	-8.150	5.934	1.00	0.00
ATOM	243	НЕ1	TYR	16	2.651	-9.038	6.425	1.00	0.00
ATOM	244	СЕ2	TYR	16	0.423	-6.790	5.171	1.00	0.00
ATOM	245	НЕ2	TYR	16	-0.640	-6.628	5.076	1.00	0.00
ATOM	246	CZ	TYR	16	0.902	-7.941	5.809	1.00	0.00
ATOM	247	OH	TYR	16	0.016	-8.868	6.315	1.00	0.00
ATOM	248	HH	TYR	16	-0.479	-8.451	7.024	1.00	0.00
ATOM	249	C	TYR	16	2.815	-6.006	1.997	1.00	0.00
ATOM	250	O	TYR	16	3.363	-7.026	1.626	1.00	0.00
ATOM	251	N	LEU	17	1.531	-5.816	1.825	1.00	0.00
ATOM	252	HN	LEU	17	1.118	-4.981	2.129	1.00	0.00
ATOM	253	CA	LEU	17	0.691	-6.853	1.160	1.00	0.00
ATOM	254	НА	LEU	17	0.816	-7.799	1.665	1.00	0.00
ATOM	255	СВ	LEU	17	-0.778	-6.421	1.227	1.00	0.00
ATOM	256	НВ1	LEU	17	-0.897	-5.483	0.705	1.00	0.00
ATOM	257	НВ2	LEU	17	-1.068	-6.295	2.260	1.00	0.00
ATOM	258	CG	LEU	17	-1.668	-7.480	0.573	1.00	0.00
ATOM	259	HG	LEU	17	-1.242	-7.773	-0.377	1.00	0.00
ATOM	260	CD1	LEU	17	-1.767	-8.704	1.484	1.00	0.00
ATOM	261	HD11	LEU	17	-2.581	-9.332	1.154	1.00	0.00
ATOM	262	HD12	LEU	17	-1.950	-8.384	2.499	1.00	0.00
ATOM	263	HD13	LEU	17	-0.844	-9.260	1.442	1.00	0.00
ATOM	264	CD2	LEU	17	-3.064	-6.898	0.350	1.00	0.00
ATOM	265	HD21	LEU	17	-3.522	-7.382	-0.499	1.00	0.00
ATOM	266	HD22	LEU	17	-2.985	-5.838	0.163	1.00	0.00
ATOM	267	HD23	LEU	17	-3.668	-7.065	1.228	1.00	0.00
ATOM	268	С	LEU	17	1.128	-6.987	-0.302	1.00	0.00
ATOM	269	O	LEU	17	1.024	-8.044	-0.897	1.00	0.00
ATOM	270	N	VAL	18	1.614	-5.919	-0.883	1.00	0.00
ATOM	271	HN	VAL	18	1.683	-5.081	-0.380	1.00	0.00
ATOM	272	CA	VAL	18	2.059	-5.966	-2.306	1.00	0.00
ATOM	273	НА	VAL	18	1.392	-6.595	-2.875	1.00	0.00
ATOM	274	СВ	VAL	18	2.052	-4.548	-2.886	1.00	0.00
ATOM	275	HB	VAL	18	2.802	-3.954	-2.382	1.00	0.00
ATOM	276	CG1	VAL	18	2.375	-4.606	-4.380	1.00	0.00
ATOM	277	HG11	VAL	18	1.457	-4.614	-4.947	1.00	0.00
ATOM	278	HG12	VAL	18	2.939	-5.504	-4.594	1.00	0.00
ATOM	279	HG13	VAL	18	2.961	-3.741	-4.656	1.00	0.00
ATOM	280	CG2	VAL	18	0.674	-3.907	-2.683	1.00	0.00
ATOM	281	HG21	VAL	18	0.117	-4.466	-1.943	1.00	0.00
ATOM	282	HG22	VAL	18	0.131	-3.910	-3.617	1.00	0.00
ATOM	283	HG23	VAL	18	0.799	-2.889	-2.345	1.00	0.00
ATOM	284	С	VAL	18	3.480	-6.523	-2.376	1.00	0.00
ATOM	285	O	VAL	18	3.801	-7.325	-3.233	1.00	0.00
ATOM	286	N	CYS	19	4.334	-6.086	-1.490	1.00	0.00
ATOM	287	HN	CYS	19	4.048	-5.430	-0.821	1.00	0.00
ATOM	288	CA	CYS	19	5.746	-6.566	-1.501	1.00	0.00
ATOM	289	НА	CYS	19	5.981	-6.963	-2.478	1.00	0.00
ATOM	290	НВ1	CYS	19	7.708	-5.690	-1.396	1.00	0.00

ATOM	291	HB2	CYS	19	6.603	-5.126	-0.146	1.00	0.00
ATOM	292	С	CYS	19	5.910	-7.669	-0.451	1.00	0.00
ATOM	293	O	CYS	19	6.116	-8.822	-0.782	1.00	0.00
ATOM	294	СВ	CYS	19	6.693	-5.394	-1.186	1.00	0.00
ATOM	295	SG	CYS	19	6.271	-3.960	-2.210	1.00	0.00
ATOM	296	N	GLY	20	5.806	-7.326	0.809	1.00	0.00
ATOM	297	HN	GLY	20	5.629	-6.392	1.048	1.00	0.00
ATOM	298	СА	GLY	20	5.938	-8.354	1.885	1.00	0.00
ATOM	299	НА1	GLY	20	5.615	-9.313	1.508	1.00	0.00
ATOM	300	HА2	GLY	20	5.319	-8.074	2.725	1.00	0.00
ATOM	301	С	GLY	20	7.395	-8.458	2.341	1.00	0.00
ATOM	302	O	GLY	20	7.969	-7.508	2.837	1.00	0.00
ATOM	303	N	GLU	21	7.991	-9.615	2.186	1.00	0.00
ATOM	304	HN	GLU	21	7.499	-10.364	1.789	1-00	0.00
ATOM	305	СА	GLU	21	9.410	-9.809	2.615	1.00	0.00
ATOM	306	НА	GLU	21	9.482	-8.667	3.684	1.00	0.00
ATOM	307	СВ	GLU	21	9.856	-11.229	2.262	1.00	0.00
ATOM	308	НВ1	GLU	21	10.925	-11.314.	2.391	1.00	0.00
ATOM	309	HB2	GLU	21	9.598	-11.441	1.235	1.00	0.00
ATOM	310	CG	GLU	21	9.154	-12.227	3.183	1.00	0.00
ATOM	311	HG1	GLU	21	8.975	-13.149	2.647	1.00	0.00
ATOM	312	HG2	GLU	21	8.212	-11.813	3.513	1.00	0.00
ATOM	313	CD	GLU	21	10.040	-12.513	4.398	1.00	0.00
ATOM	314	OE1	GLU	21	9.858	-11.851	5.407	1.00	0.00
ATOM	315	ОЕ2	GLU	21	10.885	-13.387	4.298	1.00	0.00
ATOM	316	С	GLU	21	10.321	-8.800	1.908	1.00	0.00
АТОМ	317	O	GLU	21	11.338	-8.394	2.441	1.00	0.00
ATOM	318	N	ARG	22	9.965	-8.395	0.715	1.00	0.00
ATOM	319	HN	ARG	22	9.141	-8.739	0.310	1.00	0.00
ATOM	320	СА	ARG	22	10.807	-7.413	-0.030	1.00	0.00
ATOM	321	НА	ARG	22	11.805	-7.809	-0.145	1.00	0.00
ATOM	322	СВ	ARG	22	10.198	-7.162	-1.410	1.00	0.4)0
ATOM	323	НВ1	ARG	22	10.595	-6.244	-1.813	1.00	0.00
ATOM	324	HВ2	ARG	22	9.126	-7.079	-1.314	1.00	0.00
ATOM	325	CG	ARG	22	10.537	-8.329	-2.351	1.00	0.00
ATOM	326	HG1	ARG	22	9.626	-8.727	-2.767	1.00	0.00
ATOM	327	HG2	ARG	22	11.050	-9.104	-1.801	1.00	0.00
ATOM	328	CD	ARG	22	11.438	-7.835	-3.489	1.00	0.00
ATOM	329	HD1	ARG	22	10.951	-7.021	-4.006	1.00	0.00
ATOM	330	HD2	ARG	22	11.618	-8.644	-4.182	1.00	0.00
ATOM	331	NE	ARG	22	12.735	-7.363	-2.928	1.00	0.00
ATOM	332	HE	ARG	22	12.747	-6.827	-2.107	1.00	0.00
ATOM	333	CZ	ARG	22	13.854	-7.662	-3.527	1.00	0.00
ATOM	334	NH1	ARG	22	13.963	-7.517	-4.820	1.00	0.00
ATOM	335	HH11	ARG	22	13.186	-7.175	-5.351	1.00	0.00
ATOM	336	НН12	ARG	22	14.821	-7.746	-5.280	1.00	0.00
ATOM	337	NH2	ARG	22	14.867	-8.105	-2.835	1.00	0.00
ATOM	338	НН21	ARG	22	14.785	-8.216	-1.845	1.00	0.00
ATOM	339	HH22	ARG	22	15.726	-8.335	-3.294	1.00	0.00
ATOM	340	С	ARG	22	10.870	-6.098	0.750	1.00	0.00
ATOM	341	O	ARG	22	11.919	-5.497	0.889	1.00	0.00
ATOM	342	N	GLY	23	9.752	-5.652	1.266	1.00	0.00
ATOM	343	HN	GLY	23	8.923	-6.159	1.141	1.00	0.00
ATOM	344	СА	GLY	23	9.734	-4.378	2.045	1.00	0.00
ATOM	345	НА1	GLY	23	10.693	-4.233	2.520	1.00	0.00
ATOM	346	НА2	GLY	23	8.962	-4.434	2.800	1.00	0.00
ATOM	347	С	GLY	23	9.450	-3.200	1.111	1.00	0.00
ATOM	348	O	GLY	23	9.449	-3.339	-0.098	1.00	0.00
ATOM	349	N	PHE	24	9.207	-2.041	1.668	1.00	0.00

ATOM	350	HN	РНЕ	24	9.214	-1.961	2.646	1.00	0.00
ATOM	351	CA	РНЕ	24	8.919	-0.838	0.829	1.00	0.00
ATOM	352	НА	РНЕ	24	9.341	-0.984	-0.155	1.00	0.00
ATOM	353	СВ	РНЕ	24	7.400	-0.629	0.703	1.00	0.00
ATOM	354	НВ1	РНЕ	24	7.001	-1.341	-0.004	1,00	0.00
ATOM	355	HВ2	РНЕ	24	7.203	0.372	0.350	1.00	0.00
ATOM	356	CG	РНЕ	24	6.723	-0.828	2.043	1.00	0.00
ATOM	357	CD1	РНЕ	24	6.408	-2.122	2.472	1.00	0.00
ATOM	358	HD1	РНЕ	24	6.652	-2.968	1.848	1.00	0.00
ATOM	359	CD2	РНЕ	24	6.406	0.272	2.848	1.00	0.00
ATOM	360	HD2	РНЕ	24	6.648	1.272	2.520	1.00	0.00
ATOM	361	СЕ1	РНЕ	24	5.778	-2.318	3.706	1.00	0.00
ATOM	362	HЕ1	РНЕ	24	5.537	-3.318	4.036	1.00	0.00
ATOM	363	СE2	РНЕ	24	5.776	0.077	4.083	1.00	0.00
ATOM	364	НЕ2	PHE	24	5.531	0.926	4.706	1.00	0.00
ATOM	365	С2	РНЕ	24	5.461	-1.220	4.513	1.00	0.00
ATOM	366	HZ	РНЕ	24	4.975	-1.370	5.464	1.00	0.00
ATOM	367	С	РНЕ	24	9.557	0.396	1.472	1.00	0.00
ATOM	368	O	РНЕ	24	9.004	0.992	2.376	1.00	0.00
ATOM	369	N	РНЕ	25	10.722	0.780	1.010	1.00	0.00
ATOM	370	HN	РНЕ	25	11.146	0.278	0.283	1.00	0.00
ATOM	371	CA	РНЕ	25	11.408	1.972	1.590	1.00	0.00
ATOM	372	НА	PHE	25	11.138	2.074	2.631	1.00	0.00
ATOM	373	CB	РНЕ	25	12.924	1.791	1.474	1.00	0.00
ATOM	374	НВ1	РНЕ	25	13.411	2.748	1.591	1.00	0.00
ATOM	375	НВ2	РНЕ	25	13.163	1.382	0.503	1.00	0.00
ATOM	376	CG	РНЕ	25	13.407	0.848	2.551	1.00	0.00
ATOM	377	CD1	РНЕ	25	13.976	-0.381	2.200	1.00	0.00
ATOM	378	HD1	РНЕ	25	14.069	-0.657	1.161	1.00	0.00
ATOM	379	CD2	РНЕ	25	13.284	1.206	3.898	1.00	0.00
ATOM	380	HD2	РНЕ	25	12.845	2.154	4.169	1.00	0.00
ATOM	381	СЕ1	РНЕ	25	14.423	-1.255	3.197	1.00	0.00
ATOM	382	HE1	РНЕ	25	14.864	-2.204	2.927	1.00	0.00
ATOM	383	CE2	РНЕ	25	13.732	0.332	4.896	1.00	0.00
ATOM	384	НЕ2	РНЕ	25	13.639	0.606	5.937	1.00	0.00
ATOM	385	CZ	РНЕ	25	14.302	-0.900	4.545	1.00	0.00
ATOM	386	HZ	PHE	25	14.648	-1.573	5.315	1.00	0.00
ATOM	387	С	РНЕ	25	10.991	3.230	0.926	1.00	0.00
ATOM	388	O	PHE	25	10.374	3.155	-0.220	1.00	0.00
ATOM	389	N	TYR	26	11.325	4.386	1.345	1.00	0.00
ATOM	390	HN	TYR	26	11.823	4.414	2.188	1.00	0.00
ATOM	391	CA	TYR	26	10.956	5.659	0.659	1.00	0.00
ATOM	392	НА	TYR	26	10.108	5.486	0.011	1.00	0.00
ATOM	393	СВ	TYR	26	10.594	6.719	1.703	1.00	0.00
ATOM	394	НВ1	TYR	26	10.213	7.598	1.205	1.00	0.00
ATOM	395	НВ2	TYR	26	11.475	6.980	2.270	1.00	0.00
ATOM	396	CG	TYR	26	9.539	6.173	2.635	1.00	0.00
ATOM	397	CD1	TYR	26	8.289	5.794	2.131	1.00	0.00
ATOM	398	HD1	TYR	26	8.079	5.891	1.076	1.00	0.00
ATOM	399	CD2	TYR	26	9.809	6.046	4.002	1.00	0.00
ATOM	400	HD2	TYR	26	10.772	6.339	4.392	1.00	0.00
ATOM	401	СЕ1	TYR	26	7.311	5.287	2.993	1.00	0.00
ATOM	402	HE1	TYR	26	6.348	4.994	2.604	1.00	0.00
ATOM	403	CE2	TYR	26	8.829	5.540	4.866	1.00	0.00
ATOM	404	НЕ2	TYR	26	9.038	5.442	5.922	1.00	0.00
ATOM	405	CZ	TYR	26	7.581	5.161	4.362	1.00	0.00
ATOM	406	ОН	TYR	26	6.616	4.661	5.212	1.00	0.00
ATOM	407	HH	TYR	26	6.614	3.707	5.129	1.00	0.00
ATOM	408	С	TYR	26	12.143	6.150	-0.171	1.00	0.00

ATOM	409	O	TYR	26	13.211	5.565	-0.147	1.00	0.00
ATOM	410	N	THR	27	11.966	7.221	-0.907	1.00	0.00
ATOM	411	HN	THR	27	11.096	7.673	-0.908	1.00	0.00
ATOM	412	CA	THR	27	13.084	7.753	-1.741	1.00	0.00
ATOM	413	НА	THR	27	14.023	7.574	-1.237	1.00	0.00
ATOM	414	СВ	THR	27	13.094	7.039	-3.097	1.00	0.00
ATOM	415	HB	THR	27	13.715	7.589	-3.787	1.00	0.00
ATOM	416	OG1	THR	27	11.770	6.969	-3.604	1.00	0.00
ATOM	417	HG1	THR	27	11.816	6.651	-4.509	1.00	0.00
ATOM	418	CG2	THR	27	13.657	5.627	-2.928	1.00	0.00
ATOM	419	HG21	THR	27	13.880	5.211	-3.899	1.00	0.00
ATOM	420	HG22	THR	27	12.925	5.007	-2.429	1.00	0.00
ATOM	421	HG23	THR	27	14.559	5.666	-2.337	1.00	0.00
ATOM	422	С	THR	27	12.906	9.258	-1.960	1.00	0.00
ATOM	423	O	THR	27	13.757	10.048	-1.596	1.00	0.00
ATOM	424	N	ASP	28	11.813	9.660	-2.564	1.00	0.00
ATOM	425	HN	ASP	28	11.147	9.003	-2.857	1.00	0.00
ATOM	426	CA	ASP	28	11.588	11.115	-2.820	1.00	0.00
ATOM	427	НА	ASP	28	12.312	11.692	-2.264	1.00	0.00
ATOM	429	СВ	ASP	28	11.759	11.396	-4.315	1.00	0.00
ATOM	429	НВ1	ASP	28	11.472	12.415	-4.524	1.00	0.00
ATOM	430	HВ2	ASP	28	11.133	10.722	-4.881	1.00	0.00
ATOM	431	CG	ASP	28	13.222	11.188	-4.712	1.00	0.00
ATOM	432	OD1	ASP	28	13.942	12.170	-4-780	1.00	0.00
ATOM	433	OD2	ASP	28	13.597	10.050	-4.941	1.00	0.00
ATOM	434	С	ASP	28	10.176	11.519	-2.384	1.00	0.00
ATOM	435	O	ASP	28	9.993	12.153	-1.363	1.00	0.00
ATOM	436	N	LYS	29	9.177	11.162	-3.157	1.00	0.00
ATOM	437	HN	LYS	29	9.353	10.656	-3.978	1.00	0.00
ATOM	438	CA	LYS	29	7.776	11.533	-2.797	1.00	0.00
ATOM	439	НА	LYS	29	7.756	11.902	-1.782	1.00	0.00
ATOM	440	СВ	LYS	29	7.278	12.631	-3.746	1.00	0.00
ATOM	441	НВ1	LYS	29	7.869	13.523	-3.607	1.00	0.00
ATOM	442	НВ2	LYS	29	6.242	12.850	-3.528	1.00	0.00
ATOM	443	CG	LYS	29	7.404	12.159	-5.200	1.00	0.00
ATOM	444	HG1	LYS	29	6.628	11.440	-5.413	1.00	0.00
ATOM	445	HG2	LYS	29	8.370	11.697	-5.344	1.00	0.00
ATOM	446	CD	LYS	29	7.258	13.356	-6.151	1.00	0.00
ATOM	447	HD1	LYS	29	6.898	14.215	-5.604	1.00	0.00
ATOM	448	HD2	LYS	29	6.553	13.107	-6.931	1.00	0.00
ATOM	449	СЕ	LYS	29	8.613	13.691	-6.780	1.00	0.00
ATOM	450	HE1	LYS	29	9.391	13.596	-6.036	1.00	0.00
ATOM	451	HE2	LYS	29	8.596	14.702	-7.156	1.00	0.00
ATOM	452	NZ	LYS	29	8.885	12.749	-7.905	1.00	0.00
ATOM	453	HZ1	LYS	29	8.366	13.060	-8.750	1.00	0.00
ATOM	454	HZ2	LYS	29	8.574	11.792	-7.638	1.00	0.00
ATOM	455	HZ3	LYS	29	9.904	12.739	-8.110	1.00	0.00
ATOM	456	С	LYS	29	6.874	10.299	-2.904	1.00	0.00
ATOM	457	O	LYS	29	5.911	10.280	-3.649	1.00	0.00
ATOM	459	N	MET	30	7.179	9.270	-2.156	1.00	0.00
ATOM	459	HN	MET	30	7.957	9.312	-1.562	1.00	0.00
ATOM	460	CA	MET	30	6.346	8.032	-2.201	1.00	0.00
ATOM	461	НА	MET	30	5.882	7.948	-3.171	1.00	0.00
ATOM	462	СВ	MET	30	7.237	6.813	-1.957	1.00	0.00
ATOM	463	НВ1	MET	30	7.274	6.597	-0.900	1.00	0.00
ATOM	464	НВ2	MET	30	8.235	7.018	-2.319	1.00	0.00
ATOM	465	CG	MET	30	6.664	5.607	-2.701	1.00	0.00
ATOM	466	HG1	MET	30	6.455	5.880	-3.724	1.00	0.00
ATOM	467	HG2	MET	30	5.751	5.288	-2.219	1.00	0.00

ATOM	468	SD	MET	30	7.863	4.254	-2.670	1.00	0.00
ATOM	469	CE	MET	30	7.265	3.464	-1.156	1.00	0.00
ATOM	470	HE1	MET	30	6.460	4.055	-0.737	1.00	0.00
ATOM	471	HE2	MET	30	8.069	3.399	-0.441	1.00	0.00
ATOM	472	HE3	MET	30	6.907	2.471	-1.387	1.00	0.00
ATOM	473	С	MET	30	5.260	8.094	-1.119	1.00	0.00
ATOM	474	O	MET	30	4.242	7.434	-1.221	1.00	0.00
ATOM	475	N	TRP	31	5.469	8.873	-0.086	1.00	0.00
ATOM	476	HN	TRP	31	6.298	9.389	-0.024	1.00	0.00
ATOM	477	СА	TRP	31	4.455	8.970	1.007	1.00	0.00
ATOM	478	НА	TRP	31	3.952	8.022	1.116	1.00	0.00
ATOM	479	СВ	TRP	31	5.158	9.324	2.319	1.00	0.00
ATOM	480	НВ1	TRP	31	5.222	10.397	2.414	1.00	0.00
ATOM	481	НВ2	TRP	31	6.154	8.903	2.317	1.00	0.00
ATOM	482	CG	TRP	31	4.385	8.766	3.468	1.00	0.00
ATOM	483	CD1	TRP	31	3.902	9.490	4.503	1.00	0.00
ATOM	484	HD1	TRP	31	4.010	10.557	4.630	1.00	0.00
ATOM	485	CD2	TRP	31	3.999	7.384	3.719	1.00	0.00
ATOM	486	NE1	TRP	31	3.246	8.639	5.376	1.00	0.00
ATOM	487	HE1	TRP	31	2.807	8.913	6.208	1.00	0.00
ATOM	488	СЕ2	TRP	31	3.277	7.331	4.935	1.00	0.00
ATOM	489	СЕ3	TRP	31	4.203	6.185	3.016	1.00	0.00
ATOM	490	HE3	TRP	31	4.748	6.195	2.084	1.00	0.00
ATOM	491	CZ2	TRP	31	2.778	6.127	5.435	1.00	0.00
ATOM	492	HZ2	TRP	31	2.231	6.112	6.367	1.00	0.00
ATOM	493	CZ3	TRP	31	3.703	4.972	3.516	1.00	0.00
ATOM	494	HZ3	TRP	31	3.866	4.056	2.968	1.00	0.00
ATOM	495	СН2	TRP	31	2.991	4.944	4.724	1.00	0.00
ATOM	496	НН2	TRP	31	2.610	4.007	5.104	1.00	0.00
ATOM	497	С	TRP	31	3.421	10.058	0.691	1.00	0.00
ATOM	498	O	TRP	31	2.338	10.065	1.243	1.00	0.00
ATOM	499	N	LYS	32	3.745	10.983	-0.178	1.00	0.00
ATOM	500	HN	LYS	32	4.625	10.969	-0.605	1.00	0.00
ATOM	501	СА	LYS	32	2.775	12.072	-0.503	1.00	0.00
ATOM	502	НА	LYS	32	2.200	12.313	0.378	1,00	0.00
ATOM	503	СВ	LYS	32	3.542	13.314	-0.962	1.00	0.00
ATOM	504	НВ1	LYS	32	3.751	13.236	-2.019	1.00	0.00
ATOM	505	НВ2	LYS	32	4.473	13.381	-0.417	1.00	0.00
ATOM	506	CG	LYS	32	2.700	14.570	-0.696	1.00	0.00
ATOM	507	HG1	LYS	32	3.132	15.122	0.125	1.00	0.00
ATOM	508	HG2	LYS	32	1.690	14.284	-0.442	1.00	0.00
ATOM	509	CD	LYS	32	2.679	15.456	-1.946	1.00	0.00
ATOM	510	HD1	LYS	32	1.794	16.073	-1.933	1.00	0.00
ATOM	511	HD2	LYS	32	2.669	14.831	-2.826	1.00	0.00
ATOM	512	CE	LYS	32	3.923	16.347	-1.966	1.00	0.00
ATOM	513	HE1	LYS	32	4.337	16.417	-0.971	1.00	0.00
ATOM	514	HE2	LYS	32	3.652	17.333	-2.314	1.00	0.00
ATOM	515	NZ	LYS	32	4.935	15.758	-2.887	1.00	0.00
ATOM	516	HZ1	LYS	32	5.633	16.483	-3.145	1.00	0.00
ATOM	517	HZ2	LYS	32	4.461	15.410	-3.745	1.00	0.00
ATOM	518	HZ3	LYS	32	5.418	14.970	-2.412	1.00	0.00
ATOM	519	С	LYS	32	1.829	11.620	-1.617	1.00	0.00
ATOM	520	O	LYS	32	0.658	11.951	-1.616	1.00	0.00
ATOM	521	N	GLY	33	2.328	10.879	-2.574	1.00	0.00
ATOM	522	HN	GLY	33	3.277	10.635	-2.556	1.00	0.00
ATOM	523	СА	GLY	33	1.463	10.419	-3.697	1.00	0.00
ATOM	524	HA1	GLY	33	2.079	10.208	-4.559	1.00	0.00
ATOM	525	HA2	GLY	33	0.756	11.198	-3.947	1.00	0.00
ATOM	526	С	GLY	33	0.698	9.149	-3.306	1.00	0.00

ATOM	527	O	GLY	33	-0.296	8.811	-3.921	1.00	0.00
ATOM	528	N	ILE	34	1.156	8.431	-2.306	1.00	0.00
ATOM	529	HN	ILE	34	1.965	8.711	-1.830	1.00	0.00
ATOM	530	CA	ILE	34	0.449	7.175	-1.908	1.00	0.00
ATOM	531	НА	ILE	34	0.084	6.687	-2.798	1.00	0.00
ATOM	532	СВ	ILE	34	1.427	6.230	-1.189	1.00	0.00
ATOM	533	НВ	ILE	34	2.272	6.041	-1.832	1.00	0.00
ATOM	534	CG1	ILE	34	0.714	4.903	-0.882	1.00	0.00
ATOM	535	HG11	ILE	34	0.348	4.473	-1.803	1.00	0.00
ATOM	536	HG12	ILE	34	-0.119	5.089	-0.218	1.00	0.00
ATOM	537	CG2	ILE	34	1.922	6.864	0.119	1.00	0.00
ATOM	538	HG21	ILE	34	1.094	6.969	0.804	1.00	0.00
ATOM	539	HG22	ILE	34	2.346	7.835	-0.087	1.00	0.00
ATOM	540	HG23	ILE	34	2.677	6.228	0.561	1.00	0.00
ATOM	541	CD1	ILE	34	1.685	3.924	-0.218	1.00	0.00
ATOM	542	HD11	ILE	34	1.227	2.947	-0.158	1.00	0.00
ATOM	543	HD12	ILE	34	1.922	4.272	0.778	1.00	0.00
ATOM	544	HD13	ILE	34	2.592	3.862	-0.801	1.00	0.00
ATOM	545	С	ILE	34	-0.743	7.490	-0.992	1.00	0.00
ATOM	546	O	ILE	34	-1.738	6.797	-1.017	1.00	0.00
ATOM	547	N	VAL	35	-0.644	8.509	-0.177	1.00	0.00
ATOM	548	HN	VAL	35	0.175	9.048	-0.161	1.00	0.00
ATOM	549	CA	VAL	35	-1.773	8.837	0.750	1.00	0.00
ATOM	550	НА	VAL	35	-2.296	7.928	1.006	1.00	0.00
ATOM	551	СВ	VAL	35	-1.216	9.472	2.028	1.00	0.00
ATOM	552	НВ	VAL	35	-0.771	10.427	1.791	1.00	0.00
ATOM	553	CG1	VAL	35	-2.352	9.673	3.034	1.00	0.00
ATOM	554	HG11	VAL	35	-3.111	8.923	2.874	1.00	0.00
ATOM	555	HG12	VAL	35	-2.781	10.655	2.900	1.00	0.00
ATOM	556	HG13	VAL	35	-1.964	9.584	4.037	1.00	0.00
ATOM	557	CG2	VAL	35	-0.158	8.546	2.637	1.00	0.00
ATOM	558	HG21	VAL	35	-0.220	8.585	3.714	1.00	0.00
ATOM	559	HG22	VAL	35	0.823	8.866	2.323	1.00	0.00
ATOM	560	HG23	VAL	35	-0.329	7.533	2.305	1.00	0.00
ATOM	561	С	VAL	35	-2.751	9.808	0.080	1.00	0.00
ATOM	562	O	VAL	35	-3.919	9.847	0.420	1.00	0.00
ATOM	563	N	GLU	36	-2.289	10.591	-0.858	1.00	0.00
ATOM	564	HN	GLU	36	-1.341	10.547	-1.110	1.00	0.00
ATOM	565	CA	GLU	36	-3.195	11.563	-1.539	1.00	0.00
ATOM	566	НА	GLU	36	-3.896	11.962	-0.820	1.00	0.00
ATOM	567	СВ	GLU	36	-2.362	12.709	-2.121	1.00	0.00
ATOM	568	HB1	GLU	36	-2.130	12.494	-3.154	1.00	0.00
ATOM	569	HB2	GLU	36	-1.442	12.803	-1.560	1.00	0.00
ATOM	570	CG	GLU	36	-3.148	14.022	-2.036	1.00	0.00
ATOM	571	HG1	GLU	36	-2.483	14.820	-1.745	1.00	0.00
ATOM	572	HG2	GLU	36	-3.935	13.924	-1.300	1.00	0.00
ATOM	573	CD	GLU	36	-3.764	14.346	-3.399	1.00	0.00
ATOM	574	OE1	GLU	36	-3.838	15.520	-3.730	1.00	0.00
ATOM	575	OE2	GLU	36	-4.152	13.417	-4.088	1.00	0.00
ATOM	576	С	GLU	36	-3.962	10.866	-2.667	1.00	0.00
ATOM	577	O	GLU	36	-5.076	11.237	-2.987	1.00	0.00
ATOM	578	N	GLN	37	-3.372	9.874	-3.281	1.00	0.00
ATOM	579	HN	GLN	37	-2.470	9.602	-3.012	1.00	0.00
ATOM	580	CA	GLN	37	-4.059	9.163	-4.402	1.00	0.00
ATOM	581	НА	GLN	37	-4.738	9.848	-4.893	1.00	0.00
ATOM	582	СВ	GLN	37	-3.018	8.680	-5.413	1.00	0.00
ATOM	583	HB1	GLN	37	-2.589	7.751	-5.071	1.00	0.00
ATOM	584	HВ2	GLN	37	-2.239	9.423	-5.511	1.00	0.00
ATOM	585	CG	GLN	37	-3.690	8.460	-6.770	1.00	0.00

ATOM	586	HG1	GLN	37	-3.755	9.399	-7.298	1.00	0.00
ATOM	587	HG2	GLN	37	-4.683	8.063	-6.617	1.00	0.00
ATOM	588	CD	GLN	37	-2.867	7.468	-7.592	1.00	0.00
ATOM	589	OE1	GLN	37	-2.395	7.794	-8.663	1.00	0.00
ATOM	590	NE2	GLN	37	-2.672	6.264	-7.133	1.00	0.00
ATOM	591	HE21	GLN	37	-3.052	6.001	-6.268	1.00	0.00
ATOM	592	HE22	GLN	37	-2.145	5.620	-7.652	1.00	0.00
ATOM	593	С	GLN	37	-4.852	7.960	-3.883	1.00	0.00
ATOM	594	O	GLN	37	-5.831	7.556	-4.480	1.00	0.00
ATOM	595	N	CYS	38	-4.422	7.368	-2.797	1.00	0.00
ATOM	596	HN	CYS	38	-3.618	7.697	-2.345	1.00	0.00
ATOM	597	CA	CYS	38	-5.138	6.167	-2.265	1.00	0.00
ATOM	598	НА	CYS	38	-5.589	5.631	-3.086	1.00	0.00
ATOM	599	HВ1	CYS	38	-4.649	4.387	-1.174	1.00	0.00
ATOM	600	HB2	CYS	38	-3.674	5.787	-0.749	1.00	0.00
ATOM	601	С	CYS	38	-6.231	6.567	-1.272	1.00	0.00
ATOM	602	O	CYS	38	-7.400	6.350	-1.513	1.00	0.00
ATOM	603	CB	CYS	38	-4.136	5.252	-1.563	1.00	0.00
ATOM	604	SG	CYS	38	-2.871	4.725	-2.746	1.00	0.00
ATOM	605	N	CYS	39	-5.860	7.122	-0.147	1.00	0.00
ATOM	606	HN	CYS	39	-4.906	7.264	0.032	1.00	0.00
ATOM	607	CA	CYS	39	-6.874	7.508	0.889	1.00	0.00
ATOM	608	НА	CYS	39	-7.297	6.610	1.316	1.00	0.00
ATOM	609	НВ1	CYS	39	-5.793	9.221	1.592	1.00	0.00
ATOM	610	HB2	CYS	39	-5.368	7.724	2.406	1.00	0.00
ATOM	611	С	CYS	39	-8.010	8.348	0.274	1.00	0.00
ATOM	612	O	CYS	39	-9.169	8.146	0.589	1.00	0.00
ATOM	613	СВ	CYS	39	-6.181	8.305	2.000	1.00	0.00
ATOM	614	SG	CYS	39	-7.365	8.682	3.324	1.00	0.00
ATOM	615	N	THR	40	-7.696	9.288	-0.585	1.00	0.00
ATOM	616	NH	THR	40	-6.757	9.440	-0.821	1.00	0.00
ATOM	617	CA	THR	40	-8.770	10.135	-1.197	1.00	0.00
ATOM	618	НА	THR	40	-9.290	10.671	-0.415	1.00	0.00
ATOM	619	СВ	THR	40	-8.143	11.138	-2.166	1.00	0.00
ATOM	620	HB	THR	40	-8.918	21.747	-2.607	1.00	0.00
ATOM	621	OG1	THR	40	-7.452	10.438	-3.192	1.00	0.00
ATOM	622	HG1	THR	40	-6.826	9.844	-2.773	1.00	0.00
ATOM	623	CG2	THR	40	-7.168	12.038	-1.408	1.00	0.00
ATOM	624	HG21	THR	40	-6.743	12.762	-2.087	1.00	0.00
ATOM	625	HG22	THR	40	-6.380	11-434	-0.983	1.00	0.00
ATOM	626	HG23	THR	40	-7.695	12.552	-0.619	1.00	0.00
ATOM	627	С	THR	40	-9.766	9.251	-1.954	1.00	0.00
ATOM	628	O	THR	40	-10.959	9.491	-1.933	1.00	0.00
ATOM	629	N	SER	41	-9.284	8.238	-2.620	1.00	0.00
ATOM	630	HN	SER	41	-8.318	8.071	-2.619	1.00	0.00
ATOM	631	CA	SER	41	-10.192	7.333	-3-385	1.00	0.00
ATOM	632	НА	SER	41	-11.218	7.626	-3.211	1.00	0.00
ATOM	633	СВ	SER	41	-9.865	7.469	-4.877	1.00	0.00
ATOM	634	НВ1	SER	41	-10.646	6.998	-5.460	1.00	0.00
ATOM	635	HВ2	SER	41	-8.924	6.989	-5.088	1.00	0.00
ATOM	636	OG	SER	41	-9.772	8.847	-5.212	1.00	0.00
ATOM	637	HG	SER	41	-8.925	9.172	-4.895	1.00	0.00
ATOM	638	C	SER	41	-9.981	5.884	-2.900	1.00	0.00
ATOM	639	O	SER	41	-9.741	5.659	-1.728	1.00	0.00
ATOM	640	N	ILE	42	-10.066	4.901	-3.772	1.00	0.00
ATOM	641	HN	ILE	42	-10.263	5.091	-4.711	1.00	0.00
ATOM	642	CA	ILE	42	-9.857	3.491	-3.335	1.00	0.00
ATOM	643	НА	ILE	42	-9.606	3.477	-2.283	1.00	0.00
ATOM	644	СВ	ILE	42	-11.139	2.683	-3.562	1.00	0.00

ATOM	645	HB	ILE	42	-11.390	2.690	-4.611	1.00	0.00
ATOM	646	CG1	ILE	42	-12.270	3.324	-2.756	1.00	0.00
ATOM	647	HG11	ILE	42	-12.357	4.365	-3.023	1.00	0.00
ATOM	648	HG12	ILE	42	-12.052	3.240	-1.701	1.00	0.00
ATOM	649	CG2	ILE	42	-10.933	1.237	-3.093	1.00	0.00
ATOM	650	HG21	ILE	42	-10.172	1.212	-2.326	1.00	0.00
ATOM	651	HG22	ILE	42	-10.622	0.628	-3.928	1.00	0.00
ATOM	652	HG23	ILE	42	-11.860	0.853	-2.694	1.00	0.00
ATOM	653	CD1	ILE	42	-13.589	2.614	-3.059	1.00	0.00
ATOM	654	HD11	ILE	42	-13.641	2.388	-4.112	1.00	0.00
ATOM	655	HD12	ILE	42	-14.413	3.255	-2.785	1.00	0.00
ATOM	656	HD13	ILE	42	-13.642	1.696	-2.490	1.00	0.00
ATOM	657	С	ILE	42	-8.699	2.897	-4.139	1.00	0.00
ATOM	658	O	ILE	42	-8.885	2.325	-5.197	1.00	0.00
ATOM	659	N	CYS	43	-7.499	3.050	-3.643	1.00	0.00
ATOM	660	HN	CYS	43	-7.387	3.527	-2.793	1.00	0.00
ATOM	661	СА	CYS	43	-6.295	2.525	-4.354	1.00	0.00
ATOM	662	НА	CYS	43	-6.180	3.043	-5.293	1.00	0.00
ATOM	663	HВ1	CYS	43	-4.550	1.830	-3.290	1.00	0.00
ATOM	664	НВ2	CYS	43	-5.378	3.183	-2.530	1.00	0.00
ATOM	665	С	CYS	43	-6.442	1.022	-4.617	1.00	0.00
ATOM	666	O	CYS	43	-7.100	0.312	-3.880	1.00	0.00
ATOM	667	CB	CYS	43	-5.059	2.767	-3.471	1.00	0.00
ATOM	668	SG	CYS	43	-3.918	3.924	-4.276	1.00	0.00
ATOM	669	N	SER	44	-5.813	0.539	-5.657	1.00	0.00
ATOM	670	HN	SER	44	-5.283	1.137	-6.225	1.00	0.00
ATOM	671	СА	SER	44	-5.883	-0.912	-5.981	1.00	0.00
ATOM	672	НА	SER	44	-6.568	-1.404	-5.305	1.00	0.00
ATOM	673	CB	SER	44	-6.360	-1.092	-7.422	1.00	0.00
ATOM	674	HB1	SER	44	-7.440	-1.078	-7.445	1.00	0.00
ATOM	675	НВ2	SER	44	-6.006	-2.033	-7.808	1.00	0.00
ATOM	676	OG	SER	44	-5.843	-0.035	-8.221	1.00	0.00
ATOM	677	HG	SER	44	-6.246	-0.095	-9.091	1.00	0.00
ATOM	678	С	SER	44	-4.485	-1.511	-5.823	1.00	0.00
ATOM	679	O	SER	44	-3.498	-0.798	-5.827	1.00	0.00
ATOM	680	N	LEU	45	-4.387	-2.808	-5.682	1.00	0.00
ATOM	681	HN	LEU	45	-5.194	-3.364	-5.681	1.00	0.00
ATOM	682	СА	LEU	45	-3.045	-3.444	-5.521	1.00	0.00
ATOM	683	НА	LEU	45	-2.560	-3.041	-4.644	1.00	0.00
ATOM	684	CB	LEU	45	-3.206	-4.956	-5.361	1.00	0.00
ATOM	685	HB1	LEU	45	-3.320	-5.413	-6.332	1.00	0.00
ATOM	686	НВ2	LEU	45	-4.079	-5.164	-4.759	1.00	0.00
ATOM	687	CG	LEU	45	-1.965	-5.522	-4.677	1.00	0.00
ATOM	688	HG	LEU	45	-1.079	-5.102	-5.132	1.00	0.00
ATOM	689	CD1	LEU	45	-1.995	-5.150	-3.193	1.00	0.00
ATOM	690	HD11	LEU	45	-2.974	-5.355	-2.791	1.00	0.00
ATOM	691	HD12	LEU	45	-1.774	-4.099	-3.081	1.00	0.00
ATOM	692	HD13	LEU	45	-1.257	-5.732	-2.660	1.00	0.00
ATOM	693	CD2	LEU	45	-1.947	-7.044	-4.825	1.00	0.00
ATOM	694	HD21	LEU	45	-2.936	-7.435	-4.638	1.00	0.00
ATOM	695	HD22	LEU	45	-1.252	-7.467	-4.114	1.00	0.00
ATOM	696	HD23	LEU	45	-1.640	-7.303	-5.827	1.00	0.00
ATOM	697	С	LEU	45	-2.187	-3.154	-6.754	1.00	0.00
ATOM	698	O	LEU	45	-0.976	-3.060	-6.671	1.00	0.00
ATOM	699	N	TYR	46	-2.809	-3.008	-7.895	1.00	0.00
ATOM	700	HN	TYR	46	-3.786	-3.087	-7.930	1.00	0.00
ATOM	701	СА	TYR	46	-2.045	-2.721	-9.141	1.00	0.00
ATOM	702	НА	TYR	46	-1.290	-3.477	-9.281	1.00	0.00
ATOM	703	CB	TYR	46	-3.007	-2.732	-10.336	1.00	0.00

ATOM	704	HB1	TYR	46	-3.810	-2.033	-10.158	1.00	0.00
ATOM	705	HB2	TYR	46	-3.414	-3.724	-10.459	1.00	0.00
ATOM	706	CG	TYR	46	-2.264	-2.335	-11.590	1.00	0.00
ATOM	707	CD1	TYR	46	-2.461	-1.062	-12.137	1.00	0.00
ATOM	708	HD1	TYR	46	-3.146	-0.369	-11.659	1.00	0.00
ATOM	709	CD2	TYR	46	-1.376	-3.233	-12.193	1.00	0.00
ATOM	710	HD2	TYR	46	-1.220	-4.211	-11.760	1.00	0.00
ATOM	711	CE1	TYR	46	-1.770	-0.686	-13.295	1.00	0.00
ATOM	712	HE1	TYR	46	-1.921	0.296	-13.719	1.00	0.00
ATOM	713	CE2	TYR	46	-0.683	-2.856	-13.349	1.00	0.00
ATOM	714	HE2	TYR	46	0.002	-3.547	-13.819	1.00	0.00
ATOM	715	CZ	TYR	46	-0.882	-1.583	-13.902	1.00	0.00
ATOM	716	ОН	TYR	46	-0.199	-1.212	-15.042	1.00	0.00
ATOM	717	HN	TYR	46	0.494	-0.600	-14.786	1.00	0.00
ATOM	718	С	TYR	46	-1.371	-1.349	-9.025	1.00	0.00
ATOM	719	O	TYR	46	-0.223	-1.183	-9.391	1.00	0.00
ATOM	720	N	GLN	47	-2.080	-0.369	-8.541	1.00	0.00
ATOM	721	HN	GLN	47	-3.008	-0.524	-8.266	1.00	0.00
ATOM	722	CA	GLN	47	-1.485	0.990	-8.416	1.00	0.00
ATOM	723	НА	GLN	47	-1.092	1.295	-9.376	1.00	0.00
ATOM	724	CB	GLN	47	-2.567	1.969	-7.974	1.00	0.00
ATOM	725	HB1	GLN	47	-2.118	2.917	-7.729	1.00	0.00
ATOM	726	HВ2	GLN	47	-3.075	1.572	-7.110	1.00	0.00
ATOM	727	CG	GLN	47	-3.573	2.161	-9.110	1.00	0.00
ATOM	728	HG1	GLN	47	-4.325	1.388	-9.057	1.00	0.00
ATOM	729	HG2	GLN	47	-3.060	2.100	-10.060	1.00	0.00
ATOM	730	CD	GLN	47	-4.246	3.531	-8.980	1.00	0.00
ATOM	731	OE1	GLN	47	-4.262	4.117	-7.915	1.00	0.00
ATOM	732	NE2	GLN	47	-4.809	4.068	-10.028	1.00	0.00
ATOM	733	HE21	GLN	47	-4.797	3.595	-10.887	1.00	0.00
ATOM	734	HE22	GLN	47	-5.241	4.943	-9.957	1.00	0.00
ATOM	735	С	GLN	47	-0.346	0.951	-7.393	1.00	0.0,0
ATOM	736	O	GLN	47	0.610	1.696	-7.495	1.00	0.00
ATOM	737	N	LEU	48	-0.436	0.081	-6.417	1.00	0.00
ATOM	738	HN	LEU	48	-1.212	-0.516	-6.363	1.00	0.00
ATOM	739	CA	LEU	48	0.651	-0.016	-5.396	1.00	0.00
ATOM	740	НА	LEU	48	1.124	0.947	-5.295	1.00	0.00
ATOM	741	CB	LEU	48	0.065	-0.441	-4.042	1.00	0.00
ATOM	742	HВ1	LEU	48	0.833	-0.930	-3.460	1.00	0.00
ATOM	743	HB2	LEU	48	-0.748	-1.132	-4.208	1.00	0.00
ATOM	744	CG	LEU	48	-0.457	0.777	-3.266	1.00	0.00
ATOM	745	HG	LEU	48	-1.261	1.240	-3.821	1.00	0.00
ATOM	746	CD1	LEU	48	-0.977	0.309	-1.910	1.00	0.00
ATOM	747	HD11	LEU	48	-2.009	0.009	-2.004	1.00	0.00
ATOM	748	HD12	LEU	48	-0.896	1.117	-1.199	1.00	0.00
ATOM	749	HD13	LEU	48	-0.385	-0.528	-1.572	1.00	0.00
ATOM	750	CD2	LEU	48	0,667	1.794	-3.037	1.00	0.00
ATOM	751	HD21	LEU	48	1.622	1.292	-3.091	1.00	0.00
ATOM	752	HD22	LEU	48	0.555	2.248	-2.064	1.00	0.00
ATOM	753	HD23	LEU	48	0.617	2.558	-3.797	1.00	0.00
ATOM	754	С	LEU	48	1.707	-1.051	-5.829	1.00	0.00
ATOM	755	O	LEU	48	2.726	-1.202	-5.182	1.00	0.00
ATOM	756	N	GLU	49	1.473	-1.775	-6.905	1.00	0.00
ATOM	757	HN	GLU	49	0.646	-1.650	-7.410	1.00	0.00
ATOM	758	CA	GLU	49	2.467	-2.800	-7.360	1.00	0.00
ATOM	759	НА	GLU	49	2.543	-3.576	-6,616	1.00	0.00
ATOM	760	CB	GLU	49	2.004	-3.420	-8.684	1.00	0.00
ATOM	761	HB1	GLU	49	2.865	-3.647	-9.297	1.00	0.00
ATOM	762	HB2	GLU	49	1.371	-2.717	-9.205	1.00	0.00

ATOM	763	CG	GLU	49	1.215	-4.711	-8.413	1.00	0.00
ATOM	764	HG1	GLU	49	0.227	-4.613	-8.820	1.00	0.00
ATOM	765	HG2	GLU	49	1.144	-4.879	-7.351	1.00	0.00
ATOM	766	CD	GLU	49	1.916	-5.902	-9.074	1.00	0.00
ATOM	767	ОE1	GLU	49	2.492	-6.701	-8.351	1.00	0.00
ATOM	768	OE2	GLU	49	1.866	-5.996	-10.289	1.00	0.00
ATOM	769	С	GLU	49	3.844	-2.156	-7.574	1.00	0.00
ATOM	770	O	GLU	49	4.860	-2.823	-7.537	1.00	0.00
ATOM	771	N	ASN	50	3.881	-0.869	-7.823	1.00	0.00
ATOM	772	HN	ASN	50	3.046	-0.357	-7.869	1.00	0.00
ATOM	773	СА	ASN	50	5.185	-0.185	-8.071	1.00	0.00
ATOM	774	НА	ASN	50	5.893	-0.902	-8.457	1.00	0.00
ATOM	775	СВ	ASN	50	4.975	0.920	-9.111	1.00	0.00
ATOM	776	НВ1	ASN	50	5.648	1.741	-8.908	1.00	0.00
ATOM	777	HB2	ASN	50	3.953	1.271	-9.062	1.00	0.00
ATOM	778	CG	ASN	50	5.258	0.368	-10.509	1.00	0.00
ATOM	779	OD1	ASN	50	6.361	0.475	-11.005	1.00	0.00
ATOM	780	ND2	ASN	50	4.300	-0.219	-11.169	1.00	0.00
ATOM	781	HD21	ASN	50	3.409	-0.305	-10.770	1.00	0.00
ATOM	782	HD22	ASN	50	4.469	-0.577	-12.066	1.00	0.00
ATOM	783	С	ASN	50	5.743	0.428	-6.778	1.00	0.00
ATOM	784	O	ASN	50	6.350	1.482	-6.806	1.00	0.00
ATOM	785	N	TYR	51	5.553	-0.216	-5.650	1.00	0.00
ATOM	786	HN	TYR	51	5.063	-1.063	-5.643	1.00	0.00
ATOM	787	СА	TYR	51	6.088	0.349	-4,372	1.00	0.00
ATOM	788	НА	TYR	51	6.472	1.335	-4.569	1,00	0.00
ATOM	789	СВ	TYR	51	4.956	0.454	-3.351	1.00	0.00
ATOM	790	НВ1	TYR	51	5.360	0.475	-2.351	1.00	0.00
ATOM	791	HВ2	TYR	51	4.289	-0.387	-3.464	1.00	0.00
ATOM	792	CG	TYR	51	4.204	1.725	-3.623	1.00	0.00
ATOM	793	CD1	TYR	51	3.397	1.803	-4.753	1.00	0.00
ATOM	794	HD1	TYR	51	3.300	0.945	-5.398	1.00	0.00
ATOM	795	CD2	TYR	51	4.331	2.827	-2.772	1.00	0.00
ATOM	796	HD2	TYR	51	4.953	2.763	-1.891	1.00	0.00
ATOM	797	СЕ1	TYR	51	2.709	2.982	-5.046	1.00	0.00
ATOM	798	HЕ1	TYR	51	2.086	3.038	-5.925	1.00	0.00
ATOM	799	СЕ2	TYR	51	3.641	4.011	-3.057	1.00	0.00
ATOM	800	HE2	TYR	51	3.738	4.862	-2,402	1.00	0.00
ATOM	801	CZ	TYR	51	2.830	4.090	-4.197	1.00	0.00
ATOM	802	ОН	TYR	51	2.152	5.257	-4.482	1.00	0.00
ATOM	803	НВ	TYR	51	1.390	5.308	-3.900	1.00	0.00
ATOM	804	С	TYR	51	7.230	-0.518	-3.818	1.00	0.00
ATOM	805	O	TYR	51	7.923	-0.117	-2.901	1.00	0.00
ATOM	806	N	CYS	52	7.442	-1.687	-4.368	1.00	0.00
ATOM	807	HN	CYS	52	6.879	-1.991	-5.103	1.00	0.00
ATOM	808	СА	CYS	52	8.546	-2.564	-3.875	1.00	0.00
ATOM	809	НА	CYS	52	8.538	-2.580	-2.794	1.00	0.00
ATOM	810	НВ1	CYS	52	9.063	-4.649	-3.923	1.00	0.00
ATOM	811	HB2	CYS	52	8.548	-3.997	-5.475	1.00	0.00
ATOM	812	С	CYS	52	9.886	-2.011	-4.367	1.00	0.00
ATOM	813	O	CYS	52	10.029	-1.645	-5.519	1.00	0.00
ATOM	814	СВ	CYS	52	8.362	-3.989	-4.411	1.00	0.00
ATOM	815	SG	CYS	52	6.671	-4.570	-4.093	1.00	0.00
ATOM	816	N	ASN	53	10.868	-1.949	-3.501	1.00	0.00
ATOM	817	HN	ASN	53	10.726	-2.252	-2.580	1.00	0.00
ATOM	818	СА	ASN	53	12.203	-1.421	-3.913	1.00	0.00
ATOM	819	НА	ASN	53	12.072	-0.513	-4.483	1.00	0.00
ATOM	820	СВ	ASN	53	13.041	-1.123	-2.665	1.00	0.00
ATOM	821	НВ1	ASN	53	13.670	-1.974	-2.443	1.00	0.00

Пример 3

Относительная стабильность укладки аналогов Asp^B28IP.

Для оценки стабильности укладки аналогов предшественников инсулина, образцы денатурации получали, комбинируя разные соотношения аналога предшественника инсулина и исходных растворов GuHCl с 10 мМ Трис/ClO₄ ^-, рН 8,0. Концентрация исходных растворов белков обычно составляла 0,06 мМ в 10 мМ Трис/ClO₄ ^-, рН 8,0. Концентрация исходных растворов GuHCl составляла 8,25 М в 10 мМ Трис/ClO₄ ^-, рН 8,0. Спектры КД записывали на спектрополяриметре Jasco J-715, откалиброванном с помощью (+)-10-камфаросульфоновой кислотой. Все спектры записывали при 20°С. Образцы денатурации сканировали от 250 до 218 нм. Типичная длина оптического пути в кювете и концентрация белка составляли 0,5 см и 3 мкМ соответственно. Все спектры сглаживали перед вычитанием соответствующих пустых контролей с растворителем. Круговой дихроизм выражали в виде на основании молярной концентрации пептидной связи. В целях представления каждую кривую нормализовали по шкале 0-1 делением наблюдаемого изменения в каждой точке на общее изменение, наблюдаемое в эксперименте.

Анализ данных. Кривые денатурации GuHCl анализировали, полагая, что переход укладка/разворачивание представляет собой два состояния, как описано Santoro and Bolen (1988) Biochemistry 27: 8063-8068 and Kaarsholm et al. (1993) Biochemistry 32: 10773-10778, и обе эти публикации специально включены здесь в виде ссылки в качестве пособий в отношении способов расчета стабильности при денатурации GuHCl. Указанный анализ дает ряд параметров, включая концентрацию' GuHCl в средней точке кривой денатурации, Cmid, отражающую концентрацию денатурирующего агента, необходимую для того, чтобы развернуть половину популяции белков. Таким образом, увеличение стабильности укладки проявляется в увеличении значения Cmid. Константы равновесия можно получить при каждой концентрации денатурирующего агента, используя K=( _N- )/( - _U), где означает наблюдаемое значение КД, а _N и _U представляют значения КД для нативной и развернутой форм, соответственно, при данной концентрации GuHCl (Расе, 1975). Значения _N и _U при концентрациях GuHCl в районе перехода получают линейной экстраполяцией базовых линий до и после перехода в район перехода, т.е. _N= °_N+m_N[GuHCl], и _U= °_U+m_U[GuHCl], где °_N и °_U означают пересечения, а m_N и m_U являются наклонами базовых линий до и после перехода соответственно. Свободная энергия развертывания при данной концентрации денатурирующего агента в зоне перехода имеет вид G=-RTInK. Допуская линейную зависимость ДС от концентрации денатурирующего агента: G= G_H2O-m[GuHCl], где G_H2O представляет собой значение G в отсутствии денатурирующего агента, a m является мерой зависимости G от концентрации денатурирующего агента. Следовательно, значения G, полученные при К в зоне перехода, можно экстраполировать назад к 0 М денатурирующего агента, чтобы получить G_H2O. Взаимосвязь между и [GuHCl] для кривой полного разворачивания показана в уравнении 1 (Santoro and Bolen, 1988):

При в качестве ответного сигнала и [GuHCl] в качестве независимой переменной уравнение (1) подлежит нелинейному анализу методом наименьших квадратов с использованием процедуры NLIN PC SAS (SAS Inc. Cary, North Carolina). В таком случае кривая денатурации описывается шестью параметрами: °_N, °_U, m_N, m_U, m и G_H2O. Кроме того, концентрация GuHCl в средней точке кривой денатурации, Cmid, определяется G_H2O/m.

Оценку относительной стабильности укладки молекул производных Asp^B28IP с С-пептидом Met Trp Lys (Asp^B28IP(MetTrpLys)) проводили относительно Asp^B28IP. Результаты показывают, что молекула Asp ^B28IP(MetTrpLys) гораздо более стабильна, чем Asp^B28 IP (фиг.5), что очевидно на основании изменения Cmid. В то время как Cmid для Asp^B28IP составляет примерно около 5,5 М GuHCl, для Asp^B28IP(MetTrpLys) она увеличивается, по меньшей мере, примерно до 6,5 М GuHCl, при этом увеличение составляет примерно 18%.

Пример 4

Предшественник аналога инсулина Asp^B28IP(EWK) получили, культивируя штамм дрожжей МТ663, трансформированный экспрессирующей плазмидой, которая экспрессирует слитый белок YAP3-TA39-EEGEPK (SEQ ID NO:17)-Asp ^B28IP (EWK) или слитый белок YAP3-TA57-EEGEPK (SEQ ID NO:17)-Asp ^B28IP (EWK).

кДНК, кодирующую лидерные последовательности YAP3-TA39 и YAP3-TA57, и кДНК, кодирующие Asp^B28IP (EWK) и N-концевое удлинение, клонировали в экспрессирующем векторе С-РОТ-типа, используя стандартные способы (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis Т, Molecular cloning. Cold spring Harbour laboratory press, 1989). Последовательность ДНК и рассчитанные аминокислотные последовательности показаны на фиг.8 и 9.

В таблице 6 показаны выходы. Ферментацию проводили при 30°С в течение 72 час в 5 мл YPD. Выход IP определяли ОФ-ВЭЖХ надосадка культуры и выражали относительно выхода IP контрольного штамма.

В таблице 6 « *» указан лидер -фактора, в котором С-конец до LysArg был изменен с «SLD (SerLeuAsp)» на «SMA (SerMetAla)», и «ех4» обозначено N-концевое удлинение с аминокислотной последовательностью ЕЕАЕАЕАРК (SEQ ID NO:4). YAP3 означает сигнальную последовательность YAP3. ТА39 означает синтетическую пропоследовательность QPIDDTESNTTSVNLMADDTESRFATNTTLAGGLDVVNLISMAKR (SEQ ID NO:16). Последовательность EEGEPK (SEQ ID NO:17) представляет собой N-концевое удлинение В-цепи аналога инсулина. ТА57 означает синтетическую пропоследовательность QPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR (SEQ ID NO:18).

ТАБЛИЦА 6
Лидер	Предшественник	N-концевое удлинение	С-пептид	Выход*
*-ех4	AspB28 IP	GluGluAlaGluAlaGluAlaProLys (SEQ ID NO:4)	None	100
YAP3-TA39	AspB28IP	GluGluGlyGluProLys (SEQ ID NO:17)	GluTrpLys	531%
YАР3-ТА57	AspB28IP	GluGluGlyGluProLys (SEQ (D NO:17)	GluTrpLys	500%

Пример 5

Расщепление инсулинового предшественника продеазой Achromobacter lyticos (ALP)

В 1 мл 50 мМ глутамата натрия, рН 9,0, растворяли 10 мг одноцепочечного предшественника инсулина B28Asp desB30, содержащего на N-конце последовательность EEGEPK и в качестве соединительного пептида между В29 и А1 последовательность MWK. Послед того как рН доводили до 9,0, добавляли 12 мкл водного раствора, содержащего 100 мкг ALP, и реакционную смесь оставляли при температуре 23 С. Через 0,5 часа, 1 час и 2 часа отбирали образцы для анализа ВЭЖХ с обращенной фазой, и результаты показали 98%-ное преобразование в инсулин des(B30Thr) B28Asp (инсулин Aspart) через 2 часа. Данные показаны на фигуре 10.