рекомбинантная плазмида pci-neo-odc-nsp1 и ее варианты pci-neo-odc-e2-l и pci-neo-odc-e2-m, кодирующие белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и белок орнитиндекарбоксилазы, предназначенные для разработки средств профилактики вирусных инфекционных заболеваний (на примере вируса вэл)

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-nsP1, представленная на фиг. 4, кодирующая неструктурный белок nsP1 вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), депонированная в Специализированной коллекции рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации под №02/1, характеризующаяся следующими конструктивными признаками:

размер 7321 пар оснований (п.о.);

маркерный признак: устойчивость к ампициллину;

размер векторной части: 5472 пары оснований;

структурные элементы векторной части: ori-сайт, промотор фага Т7, ori pBR322, ген устойчивости к ампициллину, множественный сайт клонирования, энхансер-промотор цитомегаловируса и поли(А)-последовательность вируса SV40, маркерный ген устойчивости к антибиотику G-418 под промотором и энхансером вируса SV40, содержащий на 3'-конце синтетическую поли(А)-последовательность;

описание клонированного фрагмента: кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (48-497) (nsP1) и кДНК гена орнитиндекарбоксилазы (ODC);

размер фрагмента: 450 п.о. - фрагмент кДНК гена вирусного белка nsP1;

сайт клонирования: ODC по сайтам NheI-SaI 1; кДНК фрагмента гена вируса ВЭЛ по BstXI-сайту, расположенному между двух PEST участков ген-эквивалентов ODC;

и предназначенная для разработки ДНК-вакцины против вируса ВЭЛ.

2. Рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-E2-L, представленная на фиг. 5, кодирующая фрагмент L структурного белка Е2 вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, депонированная в Специализированной коллекции рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации под №02/2, характеризующаяся следующими конструктивными признаками:

размер 7294 пар оснований (п.о.);

маркерный признак: устойчивость к ампициллину;

размер векторной части: 5472 пары оснований;

структурные элементы векторной части: ori-сайт, промотор фага Т7, ori pBR322, ген устойчивости к ампициллину, множественный сайт клонирования, энхансер-промотор цитомегаловируса и поли(А)-последовательность вируса SV40, маркерный ген устойчивости к антибиотику G-418 под промотором и энхансером вируса SV40, содержащий на 3'-конце синтетическую поли(А)-последовательность;

описание клонированного фрагмента: кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (8564-8986) (E2-L) и кДНК гена (ODC);

размер фрагмента: 423 п.о. - фрагмент кДНК гена вирусного белка E2-L;

сайт клонирования: ODC по сайтам NheI-SaI 1; кДНК фрагмента гена вируса ВЭЛ по BstXI-сайту, расположенному между двух PEST участков ген-эквивалентов ODC;

и предназначенная для разработки ДНК-вакцины против вируса ВЭЛ.

3. Рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-E2-M, представленная на фиг. 5, кодирующая фрагмент М структурного белка Е2 вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, депонированная в Специализированной коллекции рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации под № 02/3, характеризующаяся следующими конструктивными признаками:

размер 7291 пар оснований (п.о.);

маркерный признак: устойчивость к ампициллину;

размер векторной части: 5472 пары оснований;

структурные элементы векторной части: ori-сайт, промотор фага Т7, ori pBR322, ген устойчивости к ампициллину, множественный сайт клонирования, энхансер-промотор цитомегаловируса и поли(А)-последовательность вируса SV40, маркерный ген устойчивости к антибиотику G-418 под промотором и энхансером вируса SV40, содержащий на 3'-конце синтетическую поли(А)-последовательность;

описание клонированного фрагмента: кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (8990-9409) (Е2-М) и кДНК гена (ODC);

размер фрагмента: 420 п.о. - фрагмент кДНК гена вирусного белка Е2-М;

сайт клонирования: ODC по сайтам NheI-SaI 1; кДНК фрагмента гена вируса ВЭЛ по BstXI-сайту, расположенному между двух PEST участков ген-эквивалентов ODC;

и предназначенная для разработки ДНК-вакцины против вируса ВЭЛ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии.

Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических исследованиях по разработке защитных препаратов нового поколения против вирусных инфекционных заболеваний.

Проблема специфической профилактики вирусных инфекций является одной из важнейших, поскольку в структуре заболеваемости и смертности населения Российской Федерации эти заболевания занимают одно из ведущих мест. В настоящее время эта проблема является актуальной еще и в связи с низкой противовирусной эффективностью широко распространенных в настоящее время химиотерапевтических препаратов.

Достижения современной молекулярной биологии, генетической инженерии и биотехнологии открывают принципиально новые перспективные направления в области создания эффективных вакцин различных классов.

К вакцинам нового поколения относятся ДНК-вакцины, векторные рекомбинантные вакцины, пептидные вакцины, трансгенные вакцины и антиидиотипические вакцины [1]. Параллельно развитию методов конструирования вакцинных препаратов появляются новые данные о механизмах презентации антигенов иммунной системе хозяина. Так, в настоящее время сформировалось мнение о том, что клеточные органеллы животных - протеасомы - участвуют в процессинге антигенов, представляемых молекулами первого класса главного комплекса гистосовместимости. Реализуется данный процесс в непосредственной связи с убиквитинконъюгирующей системой [2].

Помимо убиквитина потенциальной специфичностью к протеасомному комплексу обладает и ряд других конститутивных пептидов млекопитающих, что связано с наличием в их последовательностях сочетаний некоторых аминокислотных остатков, являющихся сильными сигналами деградации (деградоны). К числу последних относится фермент орнитиндекарбоксилаза (ODC), который в настоящее время выделен и клонирован в ряде плазмидных векторов [3]. Использование орнитиндекарбоксилазы в качестве лидерного протеина при получении гибридных белков может позволить транспортировать любой целевой пептид в протеасомный комплекс, что приведет к его протеасомоопосредованной деградации. Перенос данного механизма на конструирование вакцин нового поколения может позволить получать высокоэффективные антигенные препараты, лишенные дополнительной "фоновой" нагрузки, приводящей к различного рода поствакцинальным осложнениям. Реализовать описанный подход можно, например, если протеасомоопосредованную деградацию целевого химерного антигена перенести in vivo. В этом случае, проклонировав гибридный ген в векторной плазмиде под сильным эукариотическим промотором, можно использовать технологию ДНК-вакцинации.

Одним из эффективных эукариотических плазмидных векторов является вектор pCl-neo (фиг.1), относящийся к типу pUC. Сайт ori, используемый в плазмидах pUC типа, обеспечивает высокий выход плазмидной ДНК. Вакцинные плазмиды, созданные на основе pUC, продуцируют до 30 мкг/мл плазмидной ДНК при культивировании на богатых жидких питательных средах. Благодаря гену устойчивости к антибиотикам только плазмидсодержащие бактерии способны расти на средах, содержащих данный антибиотик.

Для достижения эффективной экспрессии в организме человека используют такие регуляторные элементы, как ранний промотор цитомегаловируса (ЦМВ) человека, промотор вируса саркомы Рауса, ранний промотор вируса SV40.

Также в плазмиду вводят терминирующую транскрипцию последовательность, в качестве которой обычно используют 3'-нетранслируемый поли-А регион гена бычьего гормона роста или терминирующую последовательность вируса SV40.

Эффективность экспрессии многих генов в эукариотических клетках зависит от наличия в плазмиде интрона, в качестве которого обычно используют интрон А [4, 5].

В качестве модельного возбудителя инфекционного заболевания, против которого разрабатываются профилактические средства, выбирают хорошо изученный возбудитель.

Вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) является одним из наиболее полно изученных как структурно, так и с точки зрения иммуно- и патогенеза возбудителей вирусных инфекций. Структурно возбудитель содержит одну молекулу РНК, ковалентно связанную с белком капсида и окруженную димером гликопротеинов оболочки Е1 и Е2, однако в условиях высокой множественности заражения возможно формирование полиплоидных вирионов, содержащих под одним суперкапсидом несколько нуклеокапсидов. При репликации генома вируса транскрибируются 2 типа мРНК - 42S и 26S, определяющих, соответственно, синтез как неструктурных (nsP), так и только структурных белков.

Оба гликопротеина оболочки (E1 и Е2) имеют значение для сохранения инфекционности и патогенности вируса, однако, если Е1 в большей степени определяет этап связывания вируса с рецепторами клеточной оболочки и последующий виропексис, то Е2 преимущественно индуцирует иммунный ответ организма на вирусную инфекцию, что показано в исследованиях с сыворотками реконвалесцентов. В этой связи для получения иммуногенных препаратов вируса ВЭЛ был выбран структурный белок возбудителя Е2.

При клонировании фрагментов структурных пептидов вирусов, имеющих антигенные детерминанты, необходимым условием для их иммуногенности является сохранение наиболее актуальных эпитопов. К настоящему времени антигенная структура гликопротеина Е2 достаточно хорошо изучена, а эпитопы на его поверхности картированы как американскими, так и отечественными специалистами [6]. Иммунодоминантное положение занимает высоко консервативный участок, в состав которого входит фрагмент гена белка Е2 - М вируса ВЭЛ (фиг.2), расположенный в центральной зоне белка Е2 на небольшом удалении от сайта гликозилирования. Меньшую значимость имеют расчетные конформационные эпитопы, расположенные в концевых областях L и N пептида.

Известен рекомбинантный штамм вируса осповакцины, экспрессирующего белки вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (патент (19) RU (11) 2091489 (51), C 12 N 007/00, C 12 N 015/33, C 12 N 015/86, (21) 93018105 (22) 27.09.1997 (71)(73) Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (54) Штамм рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующий структурные белки вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей и пригодный для производства иммунобиологических препаратов и способ его получения).

Данное изобретение является ближайшим аналогом заявленного изобретения исключительно по назначению, по другим характеристикам настоящее изобретение не имеет общих признаков с ранее представленным Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор». Штамм получали путем встраивания в ген тимидинкиназы коммерческого штамма вируса осповакцины (ЛИВП) под контролем промотора белка 7,5 К вируса осповакцины последовательности, кодирующей только структурные белки вируса ВЭЛ (полноразмерной ДНК-копии всей 26S РНК). В результате получали штамм вируса осповакцины, при использовании которого генерируется наиболее полноценный иммунный ответ против вируса ВЭЛ. При инфицировании клеток полученным штаммом на их поверхности экспрессируются гликопротеины суперкапсидной оболочки вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Однако до настоящего времени данное изобретение не получило распространения в профилактики ВЭЛ.

Целью настоящего изобретения является получение рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-Е2-М), предназначенной для разработки защитных препаратов нового поколения против вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, как средства профилактики в отношении данного возбудителя.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате последовательного клонирования ген-эквивалента неструктурного белка nsP1 (фрагментов L, М структурного белка Е2) вируса ВЭЛ в составе гена орнитиндекарбоксилазы сначала в прокариотический плазмидный вектор рЕТ-23b, а затем в эукариотический плазмидный вектор pCI-neo в результате генно-инженерных исследований получена рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-Е2-М). Полученная рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать данную конструкцию в качестве иммунобиологического препарата (вакцины) и для оценки его эффективности.

Полученная рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) обладает нижеописанными характеристиками.

1. Родословная рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) представлена на фиг.3.

2. Число пассажей к моменту паспортизации 1.

3. Стандартные условия выращивания in vitro

Условия культивирования - культура Е.coli DH5 , HB10 или Jm109 на среде LB с добавлением 25 мкг/мл ампициллина при температуре (37,0±0,5)°С.

4. Молекулярно-биологические свойства рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M)

Размер: 7321 (варианты 7294, 7291) пар оснований (п.о.)

Маркерный признак: устойчивость к ампициллину

Данные рестриктного анализа: см. схематическую карту (фиг.4, 5, 6)

Векторная часть:

Размер векторной части: 5472 пары оснований

Структурные элементы: ori-сайт, промотор фага Т7, ori pBR322, ген устойчивости к ампициллину, множественный сайт клонирования, энхансер-промотор цитомегаловируса и поли (А)-последовательность вируса SV40, маркерный ген устойчивости к антибиотику G-418 под промотором и энхансером вируса SV40, содержащий на 3'-конце синтетическую поли (А)-последовательность.

Клонированный фрагмент:

Описание фрагментов:

кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (48-497) (nsP1) и кДНК гена орнитиндекарбоксилазы (фиг.4);

кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (8564-8986) (E2-L) и кДНК гена орнитиндекарбоксилазы (фиг.5);

кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (8990-9409) (Е2-М) и кДНК гена орнитиндекарбоксилазы (фиг.6).

Размер фрагментов:

450 п.о. - фрагмент кДНК гена вирусного белка nsP1, 1848 п.о. - суммарный размер фрагмента ODC и nsP1;

423 п.о. - фрагмент кДНК гена вирусного белка E2-L, 1821 п.о. - суммарный размер фрагмента ODC и E2-L;

420 п.о. - фрагмент кДНК гена вирусного белка Е2-М, 1818 п.о. - суммарный размер фрагмента ODC и Е2-М.

Сайт клонирования:

ODC по сайтам NheI-SaI 1; кДНК фрагментов генов вируса ВЭЛ по BstXI-сайту, расположенному между двух PEST участков ген-эквивалентов ODC.

5. Устойчивость рекомбинантной плазмиды

Хранение в течение 2 лет (срок наблюдения) в культуре Е. coli с добавлением 50% глицерина при температуре минус (20,0±2,0)°С.

6. Контроль контаминации культуры рекомбинантной плазмиды

Грибковая и гетерологичная бактериальная микрофлора в культуре Е. coli, содержащей рекомбинантную плазмиду pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) отсутствует.

7. Дополнительные сведения о рекомбинантной плазмиде pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) представлены в таблице 1.

8. Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана физическая карта плазмидного вектора pCI-neo.

На фиг.2 представлена диаграмма конформационных эпитопов белка Е2 вируса ВЭЛ, проецированных на клонируемые фрагменты пептида в составе векторных плазмид рЕТ-23b и pCl-neo.

На фиг.3 представлена родословная рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M).

На фиг.4 (5, 6) представлена схематическая карта данных рестриктного анализа рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M).

Примером наилучшего использования рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) может являться ее использование в качестве основы для конструирования ДНК-вакцины против вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

Пример выполнения

Пробирку с культурой Е. coli, содержащей рекомбинантную плазмиду pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) извлекают из холодильника, температура хранения минус (20,0±2,0)°С. Проводят культивирование на среде LB с добавлением 25 мкг/мл ампициллина. Продолжительность культивирования составляет от 12 до 18 часов при температуре (37,0±0,5)°С.

Лизис бактериальных клеток осуществляют лизоцимом (10 мг/мл в 0,25 М Трис-HCl, рН 8,0) в присутствии 10%-ного SDS. Хромосомную ДНК удаляют высокоскоростным центрифугированием с последующей двойной экстракцией нуклеиновых кислот смесью фенол/хлороформ и одной экстракцией хлороформом. Остатки РНК удаляют методом гель-фильтрации на колонках с сефарозой 2В и осаждают двойным объемом перегнанного холодного 70%-ного этилового спирта. Концентрацию выделенной плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически, учитывая тот факт, что одна оптическая единица при 260 нм соответствует 50 мкг ДНК в 1 мл [7]. После осаждения центрифугированием осадок плазмидной ДНК растворяют в буфере ТЕ до концентрации 1 мг/мл.

Выделенные и очищенные препараты ДНК оценивают затем электрофоретически в 0,8% агарозном геле. Электрофорез проводят при температуре (20,0±2,0)°С в течение 18 часов при напряженности электрического поля 1-2 В/см. Размер пластины 20×20 см².

Полученный препарат представляет собой очищенный препарат ДНК рекомбинантной плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M), который может быть использован в качестве ДНК-вакцины против вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (таблица 2).

Рекомбинантная плазмида pCI-neo-ODC-nsP1 (варианты pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M) депонирована в Специализированную коллекцию рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №02/1 (02/2, 02/3).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines // Amer. J. Respir. Crit Care Med. - 2000. - Vol.162. - P.190-193.

2. Ciechanover A. The ubiqutin-proteasome pathway: on protein death and cell life // J. EMBO. - 1998. - Vol.17. - P.7151-7160.

3. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji Т., Hayashi S., Igarashi K., Tamura Т., Tanaka K., Ichihara A. Omithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination // Nature. - 1992. - Vol.360. - P.597-599.

4. Molecular Cloning. (A Laboratory Manual). Ed. by Sambrook J., Fritseh E.F., Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 1678 p.

5. Сайт "Методические руководства по генетической инженерии" (США) http://www.molbio.net/.

7. Fields Virology. Edited by B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley et al. - Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers. - 1996. - 480 p.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. под ред. А.А.Баева, К.Г.Скрябина. - М.: Мир, 1984. - 479 с.

7. Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1998. - 208 с.