инъецируемая галеновая композиция для применения в диагностике или фотодинамической терапии и способ ее получения

Формула изобретения

1. Инъецируемая галеновая композиция для применения в диагностике или фотодинамической терапии (PDT), причем вышеуказанная галеновая композиция содержит соединение, отвечающее следующей общей формуле (I):

в которой R₂ означает атом водорода, ОН или группу -COOR₄, где R₄ означает атом водорода или (С₁-С₁₂)-алкил или (С ₃-С₁₂)-циклоалкил;

R₃ означает атом водорода, ОН или (С₁-С₁₂)-алкил или (С₁-С₁₂)-алкоксил;

* означает асимметричный атом углерода;

в форме соли щелочного металла, в количестве, не превышающем 1 вес.% по отношению к общему весу композиции (10 мг/мл), в качестве фотосенсибилизирующего агента;

фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе, причем соединение, представленное общей формулой I, и наполнитель в водной фазе составляют 100% композиции; отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе включает по меньшей мере смесь бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси от 15:85 до 25:75 об./об. или пропиленгликоль в качестве солюбилизирующего агента для фотосенсибилизирующего агента и поверхностно-активное вещество, позволяющее уменьшать агрегацию фотосенсибилизирующего агента, причем вышеуказанное поверхностно-активное вещество содержится в количестве, не превышающем 20 вес.% по отношению к общему весу композиции, при условии, что когда поверхностно-активным веществом является Cremophore, его количество не должно превышать 5 вес.% по отношению к общему весу композиции.

2. Композиция по п.1, характеризующаяся тем, что фотосенсибилизирующим агентом формулы (I) является палладий-бактериофеофорбид-а (Pd-Bpheide-а), представленный следующей формулой (II):

в форме соли щелочного металла.

3. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что соединение формулы (I) или соединение формулы (II) находится в форме натриевой соли.

4. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что солюбилизирующим агентом является смесь бензилового спирта и этанола, содержащаяся в композиции в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению к общему весу композиции.

5. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что солюбилизирующим агентом является смесь бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси, составляющим 20:80 об./об.

6. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что солюбилизирующим агентом является пропиленгликоль, содержащийся в композиции в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению к общему весу композиции.

7. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что поверхностно-активным веществом является Cremophore® EL, Cremophore® ELP или SolutolHS 15 .

8. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что она содержит в качестве поверхностно-активного вещества Cremophore® EL или Cremophore® ELP в количестве, не превышающем 5 вес.% по отношению к общему весу композиции.

9. Способ получения инъецируемой галеновой композиции для применения в диагностике или фотодинамической терапии (PDT), содержащей соединение, отвечающее следующей формуле (I):

в которой

R₂ означает атом водорода, ОН или группу -COOR₄, где R₄ означает атом водорода или (С₁-С₁₂)-алкил или (С₃-С₁₂)-циклоалкил;

R₃ означает атом водорода, ОН или (С₁-С₁₂ )-алкил или (С₁-С₁₂)-алкоксил;

* означает асимметричный атом углерода;

в форме соли щелочного металла в количестве, не превышающем 1 вес.% по отношению к общему весу композиции (10 мг/мл), в качестве фотосенсибилизирующего агента, и фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе, причем вышеуказанный способ включает в указанном порядке стадии, состоящие в

(1) смачивании фотосенсибилизирующего агента формулы (I) в его кислотной форме с помощью солюбилизирующего агента, образованного смесью бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси от 15:85 до 25:75 об./об. или пропиленгликолем;

(2) добавлении поверхностно-активного вещества, позволяющего уменьшить агрегацию фотосенсибилизирующего агента, в количестве, не превышающем 20 вес.% по отношению к конечному весу композиции, при условии, что когда поверхностно-активным веществом является Cremophore, его количество не должно превышать 5 вес.% по отношению к конечному весу композиции;

(3) добавлении гидроксида щелочного металла в количестве, достаточном для нейтрализации кислотной функциональной группы фотосенсибилизирующего агента формулы (I);

(4) перемешивании смеси в водной фазе образом, достаточным для полного солеобразования фотосенсибилизирующего агента и его полной солюбилизации;

(5) добавлении буферного агента, предназначенного для установления рН на физиологически приемлемом уровне 7,2±0,4;

(6) при необходимости, доведении объема композиции с помощью воды для инъецируемого препарата таким образом, чтобы композиция была доведена до 100% своего конечного веса.

10. Способ по п.9, характеризующийся тем, что фотосенсибилизирующим агентом формулы (I) в его кислотной форме является палладий-бактериофеофорбид-а (Pd-Bpheide-a), отвечающий следующей формуле (II):

11. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что солюбилизирующий агент добавляют в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению к общему весу композиции.

12. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что добавляемым солюбилизирующим агентом является смесь бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси, составляющим 20:80 об./об.

13. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что добавляемым поверхностно-активным веществом является Cremophore® EL, Cremophore® ELP или SolutolHS15 .

14. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что добавляемым поверхностно-активным веществом является Cremophore® EL или Cremophore® ELP и его добавляют в количестве, не превышающем 5 вес.% по отношению к общему весу композиции.

15. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что гидроксидом щелочного металла является гидроксид натрия.

16. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что добавляемым буферным агентом, предназначенным для установления значения рН, является лимонная кислота.

17. Способ по п.9 или 10, характеризующийся тем, что стадии (1)-(6) осуществляют в атмосфере инертного газа.

18. Инъецируемая галеновая композиция, получаемая способом по любому из пп.9-17.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к инъецируемой галеновой композиции для применения в диагностике или фотодинамической терапии (PDT), содержащей фотосенсибилизатор - производное модифицированного бактериохлорофилла и фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе.

Настоящее изобретение относится также к способу получения этой инъецируемой галеновой композиции.

Уровень техники

Уже более пятидесяти лет как доказано, что порфирины могут аккумулироваться в опухолевых тканях и, кроме того, что они могут флуоресцировать в этих облучаемых опухолевых тканях, поглощая свет in situ.

Принимая во внимание их свойства, эти порфирины, следовательно, оказались средством, представляющим интерес для детектирования опухоли путем локализации флуоресценции.

В эти последние годы применение фотосенсибилизирующих агентов при лечении рака составило объект многочисленных исследований, которые оказались очень обещающими, так что интерес к этому известному способу под названием фотодинамическая терапия (РТД) продолжает увеличиваться.

Согласно этому способу фотодинамической терапии вводят фотосенсибилизирующий агент, который способен предпочтительно фиксироваться в тканях с пролиферирующими клетками, и освещают эти ткани светом с длиной волны, которая поглощается фотосенсибилизирующим продуктом, используя монохроматический свет (лазер) или полихроматический свет (лампа).

Фотосенсибилизирующий продукт, который сам по себе не является токсическим, обладает свойством после возбуждения за счет поглощения фотонов возвращаться в свое основное состояние вследствие переноса энергии к окружающему кислороду в форме синглетного кислорода (фотоокисление типа II) и/или свободных кислородных радикалов (фотоокисление типа I).

Эти производные кислорода являются крайне реакционноспособными и токсичными, и они окисляют все находящиеся с ними в контакте тканевые составляющие.

Кроме того, они очень мало диффундируют и обладают коротким временем жизни, так что фототоксический эффект, вызываемый за счет освещения фотосенсибилизирующего агента, остается локализованным.

Основные показания фотодинамической терапии касаются главным образом области онкологии, вирусологии, офтальмологии, особенно в случае лечения связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (DMLA), кардиологии (рестеноз после ангиопластики), ревматологии и дерматологии.

Исследовано большое число фотосенсибилизирующих молекул на предмет их применения в фотодинамической терапии.

Широко изучено применение производных гематопорфирина и особенно Photofrin^® (фотофрин) (натриевый порфимер, смесь простых и сложных эфиров дигематопорфирина, выпускаемая фирмой Quadra Logic Technologies, Inc., Ванкувер, ВС, Канада) в фотодинамической терапии (см., например, T.J.Dougherty, Photochem. PhotobioL, 46, 569 (1987); Kessel и др., Photochem. PhotobioL, 46, 563 (1987); T.J.Dougherty, Semin. Surg. OncoL, 2, 24 (1986); J.S.McCaughan, Photochem. Photobiol., 46, 903 (1987); и C.J.Gomer, Semin. HematoL, 26 (1), 27 (1989).

В большинстве клинических исследований использовали производное гематопорфирина (HPD), которое образовано смесью порфириновых соединений (мономеры порфирина, гематопорфирина, гидроксиэтилвинилдейтеропорфирина, протопорфирина и димеры/полимеры порфирина) (см., например, T.J.Dougherty, Photochem. Photobiol., 46, 569 (1987).

В результате этих исследований обнаружено, что применение в терапии этих производных гематопорфирина связано с двумя большими недостатками.

Первым является то, что при длине волны света, активирующей соединение, свет не проникает достаточно глубоко в ткань (см., например, Doiron и др., в "Porphyrins in Tumor Phototherapy" под ред. A. Andreoni и R. Cuulbreddu, Plenum Press, Нью-Йорк, 1984 г., с.281-291), так что применение этих соединений ограничено лечением опухолей небольшого размера и, кроме того, не позволяет лечить опухоли, локализованные в глубине ткани.

Вторым большим недостатком этих производных гематопорфирина является то, что они обладают тенденцией к аккумуляции в тканях пациента, вызывая в особенности кожную и глазную фотосенсибилизацию, которая может длиться в течение четырех-восьми недель после обработки, что вызывает необходимость принимать особые меры предосторожности, как, например, не находиться под воздействием солнечного излучения, использовать высокоэффективный фотозащитный крем и носить соответствующую одежду и солнцезащитные очки.

В качестве единственного примера этих производных гематопорфирина, получившего разрешение на продажу (АММ) для применения в целях лечения путем фотодинамической терапии, можно назвать Photonfrin^® (фотофрин) (например, выдача АММ в США в 1994 г. и в Европе, начиная с 1996 г.), причем водный инъецируемый раствор содержит смесь порфириновых соединений, поглощающих свет с длиной волны 630 нм и вызывающих кожную и глазную фотосенсибилизацию, продолжающуюся в течение еще двух месяцев после лечения.

С целью преодоления недостатков вышеуказанных производных геаматопорфирина появилось новое поколение фотосенсибилизирующих агентов, обладающих, в качестве общей характеристики, тем, что это чистые соединения с вполне определенной структурой и что они поглощают свет с длиной волны, находящейся в диапазоне 650-800 нм.

В качестве примеров фотосенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии и принадлежащих к этому второму поколению, можно назвать производные бензопорфирина (см., например, A.M.Richter, S. Yip, H. Meadows и др. "Photosensitizing potencies of the structural analogues of benzoporphyrin derivative in different biological test systems", J. Clin. Laser Med. Surg., 14, 335-341 (1996); J.G.Levy, A. Chan, H.A. Strong "The clinical status of benzoporphyrin derivative", SPIE, 2625, 86-95 (1996); U. Schmidt-Erfurht, W. Bauman, E. Gragoudas и др. "Photodynamic therapy of experimental choroidal melanoma using lipoprotein-delivered benzoporphyrin", Ophtalmology, 101, 89-99 (1994).

Производные бензопорфирина обладают преимуществом в том, что соединение активируется под действием света с большей длиной волны ( 690 нм), чем у такового, который активирует производные гематопорфирина, так что свет проникает более глубоко в ткани.

Кроме того, обнаружено, что при применении этих производных бензопорфирина значительно уменьшается эффект кожной и глазной фотосенсибилизации.

Однако в качестве основного недостатка производных бензопорфирина (BPD) является то, что они нерастворимы в водной среде, так что их фармацевтическое применение парентерально оказывается затруднительным.

В заявке на патент США А-5289378 предлагается преодолеть этот недостаток за счет включения производных бензопорфирина в липосомы.

В качестве примера инъецируемой липосомальной композиции, содержащей производное бензопорфирина, которую используют в фотодинамической терапии для лечения центральных неоваскулярных форм с заметным преобладанием связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (DMLA), можно назвать Visudyne ^® (визудин) (Ciba-Vision), который содержит в качестве фотосенсибилизирующей молекулы вертепорфин, поглощающий свет с длиной волны 690 нм и вызывающий ограниченную во времени кожную и глазную фотосенсибилизацию.

В качестве других примеров фотосенсибилизирующих агентов, пригодных для фотодинамической терапии, которые принадлежат к этому новому поколению, можно особенно назвать производные бактериохлорофилла следующей общей формулы:

в которой М представляет собой атом металла или 2 атома водорода и R₁, R₂ и R₃ представляет собой каждый независимо атом водорода или вариабельную группу.

Эти соединения, например, называют:

Bchl, или бактериохлорофилл, когда М представляет собой Mg; R₁ представляет собой фитильную группу; R₂ представляет собой атом водорода; R₃ представляет собой группу -СООСН₃;

Bchlide, или бактериохлорофиллид, когда М представляет собой Mg; R₁ представляет собой атом водорода; R₂ представляет собой атом водорода; R ₃ представляет собой группу -СООСН₃; и

BPheide, или бактериофеофорбид, когда М представляет собой 2 атома водорода; R₁ представляет собой атом водорода; R₂ представляет собой атом водорода; R₃ представляет собой группу -СООСН₃.

Некоторые из этих производных описаны, в частности, в заявке на патент ФРГ А-4121876, заявке на европейский патент А-0584552 и в международной публикации WO-97/19081.

Другими производными бактериохлорофилла, которые оказались особенно представляющими интерес, являются производные бактериохлорофилла, в которых атом магния заменен атомом палладия, как таковые, описанные, например, в международной публикации WO-00/33833.

Из этих производных бактериохлорофилла, модифицированных на уровне металла и описанных в международной публикации WO-00/33833, соединения, отвечающие следующей общей формуле (I):

в которой:

R₂ представляет собой атом водорода, ОН или группу -COOR₄, где R ₄ представляет собой атом водорода или (С₁-С ₁₂)-алкил, или (С₃-С₁₂)-циклоалкил;

R₃ представляет собой атом водорода, ОН или (С ₁-С₁₂)-алкил, или (C₁-C₁₂ )-алкоксил; и

* означает асимметричный атом углерода;

или их соли оказались особенно представляющими интерес, и из этих соединений вышеуказанной формулы (I) Pd-бактериофеофорбид-а, отвечающий следующей формуле (II):

или его соль оказалась обладающей очень высокими фототоксичностью и стабильностью во времени по сравнению с другими производными бактериохлорофилла.

Кроме того, Pd-бактериофенофорбид-а, также называемый Pd-Bpheide-a, поглощает свет с длиной волны около 760 нм, то есть с большей длиной волны, чем другие фотосенсибилизаторы, что позволяет свету проникать более глубоко в ткани, и он вызывает в незначительной степени или не вызывает кожной фотосенсибилизации.

Однако все соединения, отвечающие вышеуказанной формуле (I), имеют очень выраженный липофильный характер с сильной тенденцией к агрегации в водной среде, что делает затруднительным их фармацевтическое применение парентеральным путем.

В международной публикации WO-00/33833 заявляется, в частности, фармацевтическая композиция, включающая соединение вышеуказанной формулы (I), предпочтительно Pd-Bpheide-a вышеуказанной формулы (II), и фармацевтически приемлемый носитель.

В описании к WO-00/33833, однако, указано, что для получения такой фармацевтической композиции, вводимой системным путем, необходимо добавлять достаточное для солюбилизации соединения количество нетоксического поверхностно-активного вещества.

Содержащие Pd-Bpheide-a композиции, особенно описанные в международной публикации WO-00/33833 и применяемые для тестов in vivo на животных, содержат очень большое количество Cremophore^® EL (кремофор) (20-50%), который оказался необходимым для солюбилизации фотосенсибилизирующего агента.

В этих композициях Cremophore ^® EL играет роль поверхностно-активного вещества, позволяющего уменьшать агрегацию и солюбилизировать Pd-Bpheide-a.

Cremophore^® EL представляет собой эмульгирующий наполнитель типа имеющегося в продаже полиоксиэтиленированного касторового масла, которое известно своим использованием в фармацевтических композициях из-за его способности солюбилизировать большое число различных липофильных действующих начал.

Однако композицию, содержащую более 5% Cremophore^® EL, трудно использовать для введения системным путем человеку из-за известной опасности возникновения нежелательных эффектов аллергического типа.

Попытки, направленные на замену Cremophore^® EL другими поверхностно-активными веществами, известными своим использованием в качестве солюбилизаторов липофильных действующих начал в инъецируемых композициях, такими как Solutol HS 15 , пропиленгликоль, полисорбат-80, соевые лецитины, яичные лецитины и N-метилпирролидон (Pharmasolve^®), не привели к удовлетворительным результатам.

В соответствии с особенно представляющими интерес свойствами соединений вышеуказанной формулы (I) и, в частности, Pd-Bpheide-a вышеуказанной формулы (II), в качестве фотосенсибилизирующих агентов в фотодинамической терапии, необходимо получить галеновую композицию, содержащую соединение вышеуказанной формулы (I), которая может быть введена внутривенно человеку без опасности вызываемых наполнителем осложнений.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является получение инъецируемой галеновой композиции, в которой соединение вышеуказанной формулы (I) полностью солюбилизировано и которая содержит очень небольшое количество поверхностно-активного вещества.

Эта цель была достигнута после того, как изобретатели неожиданно установили, что добавка небольшого количества неводных сорастворителей, а именно добавка небольшого количества смеси бензилового спирта/этанола или пропиленгликоля к Pd-Bpheide-a, позволяет солюбилизировать Bpheide-a в водной среде после образования его соли.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к инъецируемой галеновой композиции для применения в диагностике или фотодинамической терапии (PDT), причем вышеуказанная галеновая композиция содержит:

- соединение, представленное следующей общей формулой (I):

в которой:

R₂ представляет собой атом водорода, ОН или группу -COOR₄, где R ₄ означает атом водорода или (С₁-С₁₂ )-алкил, или (С₁₂-С₁₂)-циклоалкил;

R₃ представляет собой атом водорода, ОН или (С ₁-С₁₂)-алкил, или (C₁-C₁₂ )-алкоксил; и

* представляет собой асимметричный атом углерода;

в форме соли щелочного металла в количестве, не превышающем 10 мг/мл, в качестве фотосенсибилизирующего агента; и

- фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе;

отличающейся тем, что фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе включает, по меньшей мере, смесь бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси от 15:85 до 25:75 или пропиленгликоль в качестве солюбилизирующего агента для фотосенсибилизатора и поверхностно-активное вещество, позволяющее уменьшать агрегацию фотосенсибилизатора в количестве, не превышающем 20 мас.% по отношению к общей массе композиции.

Согласно второму аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения инъецируемой галеновой композиции для применения в диагностике или фотодинамической терапии (PDT), содержащей соединение, отвечающее следующей формуле (I):

в которой:

R₂ представляет собой атом водорода, ОН или группу -COOR₄, где R ₄ представляет собой атом водорода или (С₁-С ₁₂)-алкил, или (С₃-С₁₂)-циклоалкил;

R₃ представляет собой атом водорода, ОН или (С ₁-С₁₂)-алкил, или (C₁-C₁₂ )-алкоксил; и

* представляет собой асимметричный атом углерода;

в форме соли щелочного металла в количестве вплоть до 10 мг/мл в качестве фотосенсибилизирующего агента и фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе, причем вышеуказанный способ включает в указанном порядке стадии, состоящие в:

(1) смачивании фотосенсибилизирующего агента формулы (I) в его кислотной форме с помощью солюбилизирующего агента, образованного смесью бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси от 15:85 до 25:75 или пропиленгликолем;

(2) добавлении поверхностно-активного вещества в количестве, не превышающем 20 мас.% по отношению к конечной массе композиции;

(3) добавлении гидроксида щелочного металла в количестве, достаточном для нейтрализации кислотной функциональной группы фотосенсибилизирующего агента формулы (I);

(4) перемешивании смеси в водной фазе образом, достаточным для полного солеобразования фотосенсибилизирующего агента и его полной солюбилизации;

(5) добавлении буферного агента, предназначенного для установления рН на физиологически приемлемом уровне 7,2±0,4;

(6) при необходимости, доведении объема композиции с помощью воды для инъецируемого препарата.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к инъецируемой галеновой композиции, получаемой этим способом.

Галеновая композиция согласно настоящему изобретению содержит очень небольшое количество поверхностно-активного вещества, существенной ролью которого является уменьшение образования агрегатов.

Настоящее изобретение относится, таким образом, к галеновой композиции, в которой фотосенсибилизирующий агент, а именно соединение вышеуказанной формулы (I) в форме соли, полностью солюбилизирован и которая может быть введена путем инъекции с меньшей опасностью для человека в рамках фотодинамической терапии.

Другие преимущества настоящего изобретения следуют из нижеприводимого подробного описания изобретения.

Осуществление изобретения

Согласно настоящему изобретению инъецируемая галеновая композиция для применения в фотодинамической терапии содержит:

- соединение формулы (I):

в которой:

R₂ представляет собой атом водорода, ОН или группу -COOR₄, где R ₄ представляет собой атом водорода или (С₁-С ₁₂)-алкил, или (С₃-С₁₂)-циклоалкил;

R₃ представляет собой атом водорода, ОН или (С ₁-С₁₂)-алкил, или (C₁-С₁₂ )-алкоксил; и

* представляет собой асимметричный атом углерода;

в форме соли щелочного металла в качестве фотосенсибилизирующего агента; и

- фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе.

В галеновой композиции, согласно настоящему изобретению, соединением вышеуказанной формулы (I) предпочтительно является Pd-Bpheide-a нижеуказанной формулы (II):

в форме соли щелочного металла.

Солью щелочного металла соединения формулы (I) или соединения формулы (II) может быть натриевая или калиевая соль.

Предпочтительно, соль щелочного металла соединения формулы (I) или соединения формулы (II) представляет собой натриевую соль.

Соединения вышеуказанной формулы (I) и, в частности, Pd-Bpheide-a, представленный вышеуказанной формулой (II), а также их соли щелочного металла могут быть получены, как описано в международной публикации WO-00/33833.

Количество фотосенсибилизирующего соединения, содержащееся в инъецируемой галеновой композиции согласно настоящему изобретению, не должно быть выше 10 мг/мл, так как при превышающем 10 мг/мл количестве фотосенсибилизирующее соединение не будет полностью солюбилизироваться.

Когда инъецируемая галеновая композиция предназначена для применения в рамках фотодинамической терапии, количество фотосенсибилизирующего агента, содержащееся в композиции, предпочтительно не должно быть ниже 0,1 мг/мл, так как ниже этой концентрации слишком значительным будет вводимый объем композиции.

Однако могут быть предусмотрены количества фотосенсибилизатора ниже 0,1 мг/мл, когда инъецируемая галеновая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения в рамках фотодинамической диагностики.

Назначением фармацевтически приемлемого наполнителя в водной фазе, содержащегося в инъецируемой галеновой композиции согласно настоящему изобретению, является солюбилизация фотосенсибилизирующего агента при придании стабильности композиции во времени.

Этот фармацевтически приемлемый наполнитель в водной фазе включает, по меньшей мере, смесь бензилового спирта и этанола или пропиленгликоль в качестве солюбилизирующего агента для фотосенсибилизирующего агента и поверхностно-активное вещество, позволяющее уменьшать агрегацию фотосенсибилизирующего агента в количестве, не превышающем 20 мас.% по отношению к общей массе композиции.

Когда фармацевтический наполнитель включает смесь бензилового спирта и этанола в качестве солюбилизирующего агента, соотношение компонентов в смеси бензиловый спирт: этанол должно составлять от 15:85 до 25:75 объем/объем.

В случае соотношения компонентов в смеси при значении для бензилового спирта ниже 15 фотосенсибилизирующий агент не солюбилизируется полностью.

В случае соотношения компонентов в смеси при значении для бензилового спирта выше 25 смесь не смешивается с водой.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения наполнитель содержит смесь бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси бензиловый спирт: этанол, составляющим 20:80.

Смесь бензиловый спирт: этанол предпочтительно содержится в наполнителе в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению ко всему объему композиции.

Бензиловый спирт и этанол, содержащиеся в инъецируемой галеновой композиции согласно настоящему изобретению, должны отвечать соответствующим требованиям в отношении чистоты для их применения в инъецируемых композициях согласно Европейской фармакопее (РЕ) и Фармакопее США (USP).

Когда фармацевтический наполнитель включает пропиленгликоль в качестве смачивателя, то пропиленгликоль предпочтительно содержится в наполнителе в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению ко всему объему композиции.

Пропиленгликоль, содержащийся в инъецируемой галеновой композиции согласно настоящему изобретению, должен отвечать соответствующим требованиям в отношении чистоты для его применения в инъецируемых композициях, согласно Европейской фармакопее и Фармакопее США.

Поверхностно-активное вещество, содержащееся в фармацевтически приемлемом наполнителе в водной фазе, может представлять собой любое поверхностно-активное вещество, обладающее способностью уменьшать агрегацию фотосенсибилизирующего агента в инъецируемой галеновой композиции и которое должно содержаться в количестве, не превышающем 20 мас.% по отношению к общей массе композиции.

Этим поверхностно-активным веществом может быть, например, Cremophore^® EL (БАСФ, Германия), Cremophore^® ELP (БАСФ, Германия), Solutol HS 15 (БАСФ, Германия), пропиленгликоль, полисорбат-80, соевые лецитины, яичные лецитины и N-метилпирролидон (Pharmasolve ^®, БАСФ, Германия).

Предпочтительно, поверхностно-активным веществом является Cremophore^® EL, Cremophore ^® ELP или Solutol HS 15 .

Особенно предпочтительная согласно настоящему изобретению композиция содержит в качестве поверхностно-активного вещества, Cremophore^® EL или Cremophore^® ELP в количестве, не превышающем 5 об. % по отношению ко всему объему композиции.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения композиция содержит 0,25% масса/масса Pd-Bheide-a, 5% объем/масса смеси бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси бензиловый спирт: этанол, составляющим 20:80, и 5% масса/масса Cremophore ^® ELP.

Инъецируемая галеновая композиция согласно настоящему изобретению может быть получена согласно способу, включающему в указанном порядке стадии, состоящие в:

(1) смачивании фотосенсибилизирующего агента формулы (I) в его кислотной форме или формулы (II) в его кислотной форме с помощью солюбилизирующего агента, образованного смесью бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси от 15:85 до 25:75 или пропиленгликолем;

(2) добавлении поверхностно-активного вещества в количестве, не превышающем 20 мас.% по отношению к конечной массе композиции;

(3) добавлении гидроксида щелочного металла в виде водного раствора в количестве, достаточном для нейтрализации кислотной функциональной группы фотосенсибилизирующего агента формулы (I) или формулы (II);

(4) перемешивании смеси в водной фазе образом, достаточным для полного солеобразования фотосенсибилизирующего агента и его полной солюбилизации;

(5) добавлении буферного агента, предназначенного для установления рН на физиологически приемлемом уровне 7,2±0,4;

(6) при необходимости, доведении объема композиции с помощью воды для инъецируемого препарата.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения солюбилизирующий агент предпочтительно добавляют в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению ко всему объему композиции.

Согласно предлагаемому в изобретении способу добавляемый для смачивания фотосенсибилизирующего агента солюбилизирующий агент предпочтительно представляет собой смесь бензилового спирта и этанола с соотношением компонентов в смеси, составляющим 20:80.

Смачивание чистым бензиловым спиртом невозможно из-за несмешиваемости бензилового спирта с разбавленным раствором гидроксида натрия.

Добавка этанола к бензиловому спирту в указанных пропорциях делает возможной смешиваемость органической смачивающей фазы с разбавленным раствором гидроксида натрия.

Бензиловый спирт и этанол или пропиленгликоль, добавляемые для смачивания фотосенсибилизирующего агента, должны отвечать соответствующим требованиям в отношении чистоты для их применения в инъецируемых композициях согласно Европейской фармакопее и Фармакопее США (USP).

Поверхностно-активное вещество, добавляемое для уменьшения агрегации фотосенсибилизирующего агента в инъецируемой галеновой композиции, представляет собой, например, Cremophore ^® EL, Cremophore^® ELP, Solutol HS 15 , пропиленгликоль, полисорбат-80, соевые лецитины, яичные лецитины и N-метилпирролидон (Pharmasolve^®).

Предпочтительно, добавляемым поверхностно-активным веществом является Cremophore^® EL, Cremophore^® ELP или Solutol HS 15 .

Добавляемое количество поверхностно-активного вещества варьирует в зависимости от используемого поверхностно-активного вещества и конечной концентрации фотосенсибилизирующего агента в композиции. Однако это количество не должно быть выше 20 мас.% по отношению к конечной массе композиции.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления предлагаемого в настоящем изобретении способа в качестве поверхностно-активного вещества добавляют Cremophore^® EL или Cremophore^® ELP в количестве, не превышающем 5 об.% по отношению ко всему объему композиции.

Гидроксидом щелочного металла, используемым в способе согласно настоящему изобретению, может быть гидроксид натрия или гидроксид калия, и его добавляют в виде водного раствора.

Гидроксид щелочного металла добавляют к соединению формулы (I) в его кислотной форме или к соединению формулы (II) в его кислотной форме в количестве, позволяющем полностью переводить в соль кислотную функциональную группу соединения формулы (I) или соединения формулы (II).

Предпочтительно, используемым гидроксидом щелочного металла является гидроксид натрия в таком количестве, чтобы инъецируемая галеновая композиция содержала соединение формулы (I), предпочтительно соединение формулы (II), в форме натриевой соли.

Должно быть обеспечено в достаточной степени перемешивание для обеспечения полного солеобразования фотосенсибилизирующего агента и его полной солюбилизации в наполнителе.

Предназначенным для установления значения рН агентом, используемым в способе согласно настоящему изобретению, может быть, например, лимонная кислота, фосфорная кислота и их натриевые соли (однозамещенная и двухзамещенная), D-винная кислота, L-винная кислота, D-яблочная кислота, L-яблочная кислота.

Предназначенный для установления значения рН агент добавляют в количестве, необходимом для забуферивания инъецируемой композиции при физиологически приемлемом значении рН 7,2±0,4.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения добавляемым компонентом, предназначенным для установления значения рН, является лимонная кислота, так как она придает композиции улучшенную стабильность во времени и в присутствии воздуха.

С целью повышения стабильности инъецируемой композиции, получаемой по способу настоящего изобретения, различные стадии (1) - (6) способа предпочтительно осуществляют в атмосфере инертного газа.

В инъецируемой галеновой композиции, получаемой по способу настоящего изобретения, соединение формулы (I) или предпочтительно соединение формулы (II), является полностью солюбилизированным, причем об этом свидетельствует прозрачность и полное отсутствие осадка.

Кроме того, получаемая по способу настоящего изобретения инъецируемая композиция обладает превосходной стабильностью во времени.

В галеновой композиции согласно настоящему изобретению соединение формулы (I) и предпочтительно соединение формулы (II) находится в мономерной форме, однако с некоторым количеством соединения в форме агрегата (олигомеры).

Однако во время инъекции инъецируемой галеновой композиции согласно настоящему изобретению олигомерная форма, присутствующая в композиции, быстро превращается в мономерную, как только вступает в контакт с физиологической жидкостью, в частности, с кровью, так что активный фотосенсибилизирующий продукт целиком находится в мономерной форме.

Анализ инъецируемой композиции согласно настоящему изобретению путем УФ-спектроскопии может давать представляющие интерес сведения в отношении Pd-Bpheide-а, содержащегося в композиции, поскольку Pd-Bpheide-a имеет пик около 760 нм, его агрегация может быть определена по появлению соседнего пика около 815 нм и его деградация, в частности, за счет окисления может быть определена по гипохромным сдвигам максимумов, особенно максимума около 760 нм.

Следующие примеры предназначены для пояснения настоящего изобретения, однако они не должны никоим образом рассматриваться как ограничивающие его объем охраны.

Примеры

В нижеприводимых примерах все используемые реагенты представляют собой коммерчески доступные реагенты, выпускаемые, в частности, фирмами SDS (ВР 4-Valdonne, F-13124 Peypin), Merck Eurolab (Ewoparc, F-33608 Pessac Cedex), БАСФ (Германия), Fluka (Buchs, Швейцария) и т.д., если только не указано иное.

Получение фотосенсибилизирующего агента Pd-Bpheide-a

Примечание: весь способ осуществляют под неактиничным излучением и в атмосфере азота.

1) Экстракция бактериохлорофилла-а (BChla)

Используемые реагенты:

клетки Rhodovolum Sulfidophilum	11 кг
метанол (SDS или Merck, чистый для синтеза, чистота 99,8%)	126 л

Методика:

Лиофилизированные клетки Rhodovolum Sulfidophilum в количестве 11 кг экстрагировали с помощью 57 л метанола при температуре 25°С и среду отфильтровывали. Остаток клеток обрабатывали с помощью 47 л метанола и отфильтровывали. После промывки остатка с помощью 22 л метанола фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении.

Таким образом получали 3500 г сырого продукта, содержащего 70 г BChla (количество BChla, определенное путем УФ-анализа).

2) Синтез бактериофеофорбида-а

Используемые реагенты:

сырой продукт, содержащий 70 г бактериохлорофилла-а,	3500 г
полученного на стадии 1) трифторуксусная кислота
(SDS, чистая для синтеза, чистота 99%)	7 л
хлороформ (SDS, чистый для синтеза, чистота >99,9%)	11,2 л

Методика

3500 г сырого продукта, содержащего 70 г бактериохлорофилла-а, солюбилизировали в 11,2 л хлороформа и добавляли 7 л трифторуксусной кислоты. За глубиной протекания реакции следили с помощью тонкослойной хроматографии. Когда более не обнаруживали исходный продукт, в реакционную среду добавляли 56 л воды и 14 л хлороформа. После перемешивания, затем декантации выделяли две фазы. Органическую фазу промывали с помощью 25 л воды и хлороформ удаляли при пониженном давлении вплоть до объема 6 л.

Сырой Bpheide получали в виде раствора в хлороформе и не отделяли до очистки.

3) Очистка бактериофеофорбида-а

Реагенты:

раствор сырого Bpheide в хлороформе, полученный на стадии 2)

циклогексан (SDS, чистый для синтеза, чистота 99%)	10 л
пентан (SDS, чистый для синтеза, чистота 99%)	7 л
метанол (SDS или Merck,
чистый для синтеза, чистота 99,8%)	3 л
диоксид кремния (SDS, 60 А С.С., 70-200 мкм)	300 г
этилацетат (Merck, чистый, чистота 99,5%)	6 л

Методика

Циклогексан (10 л) добавляли к раствору сырого Bpheide в хлороформе, и растворители отгоняли при пониженном давлении с добавкой циклогексана вплоть до удаления хлороформа и вплоть до получения объема 7 л. Продукт затем осаждали путем добавления 7 л пентана, перемешивали в течение 15 минут при температуре 30°С и отфильтровывали. После высушивания в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С получали 60 г полуочищенного продукта (УФ-чистота: 50-60%).

Полуочищенный продукт в количестве 60 г растворяли в 6 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 95:5 и добавляли 300 г диоксида кремния. После перемешивания в течение 10 минут среду отфильтровывали. Фильтрат разбавляли 6 л этилацетата и растворители отгоняли при пониженном давлении. По ходу концентрирования добавляли этилацетат вплоть до достижения плотности дистиллята, равной 0,9. Объем раствора затем доводили до 3,0 л. Раствор фильтровали и полученный порошок высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С.

Выделяли около 35 г очищенного Bpheide (УФ-чистота: 80%).

4) Синтез палладий-бактериофеофорбида-а

Реагенты:

очищенный Bpheide, полученный на стадии 3)	6,25 г
ацетат палладия (SDS или Merck, содержание 99% масса/масса)	13,15 г
аскорбиновая кислота (SDS, чистота 99%)	105 г
хлороформ (SDS, чистый для синтеза, чистота 99,9%)	2,2 л
метанол (SDS, чистый для анализа, чистота 99,8%)	3,3 л
безводный сульфат натрия
(SDS, для анализа, чистота 99,5%)	1,5 кг

Методика

105 г аскорбиновой кислоты растворяли в 3,3 л метанола и среду нагревали при температуре 35°С. 6,25 г Bpheide, солюбилизированного в 1,5 л хлороформа, в течение 10 минут добавляли к предыдущей среде. После перемешивания в течение 10 минут к реакционной среде за 10 минут добавляли 13,15 г ацетата палладия, растворенного в 0,7 л хлороформа. За протеканием реакции следили с помощью УФ-спектроскопии. Спустя 15 минут (полное введение) смесь возвращали к температуре 20°С, затем ее выливали в 20 л воды. После перемешивания и декантации фазы разделяли. Органическую фазу промывали с помощью 20 л воды вплоть до значения рН 5, затем высушивали над 1,5 кг сульфата натрия. После удаления растворителей при пониженном давлении получали 5,85 г сырого продукта (УФ-чистота: 85%).

5) Очистка палладий-бактериофеофорбида-а

Используемые реагенты:

сырой Pd-Bpheide, полученный на стадии 4) (УФ-чистота: 85%)	5,85 г
хлороформ (SDS, чистый для синтеза, чистота 99,9%)	175 мл

Методика

Сырой продукт (5,85 г) обрабатывали 175 мл хлороформа и перемешивали в течение 5 минут. Суспензию фильтровали и полученное твердое вещество высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С.

Выделяли 5,0 г очищенного Pd-Bpheide-a (ВЭЖХ-чистота >97%).

Спектроскопия в УФ/видимой области (в хлороформе), _max [нм] (относительная интенсивность): 330 (0,798); 385 (0,597); 535 (0,292); 760 (1,711).

¹ Н-ЯМР (ацетон-D₆), [м.д.]: 9,27, 8,86, 8,77 (s, каждый, 1Н, 5-, 10-, 20-Н); 6,01 (s, 1Н, 13²-H); 4,7-4,0 (4 m, 1H, 7-, 8-, 17-, 18-Н); 3,86 (s, 3H, 13²-СО₂СН ₃); 3,51 (s, 3H, 2-СН₃); 3,34 (s, 3H, 12-СН ₃); 3,07 (s, 3H, 3-СОСН₃); 2,7-2,1 (3 m, 2H, 8-, 17¹-, 17²-CH₂); 1,79,1,69 (d, каждый, 3Н, 7-, 18-СН₃); 1,09 (t, 3H, 8-СН ₂СН₃).

Масс-спектрометрия: рассчитано для C₃₅H₃₆N₄O₆Pd: 714,1670 (М⁺); найдено: 714,1688 (M⁺).

Элементный анализ:

рассчитано (%): С 58,9; Н 5,07; N 7,83; О 13,42; Pd 14,88

найдено (%): С 59,13; Н 5,12; N 7,72; О 13,33; Pd 14,69

Вышеполученный Pd-Bpheide-а использовали для приготовления нижеуказанных инъецируемых композиций.

Инъецируемая композиция 1

Композиция 1, содержащая 2,5 мг/мл Pd-Bpheide-a в качестве фотосенсибилизирующего агента

Наполнитель:

органическая фаза: бензиловый спирт/этанол (20/80) 5%объем/масса

поверхностно-активное вещество: Cremophore ^® ELP 5% масса/масса

NaOH: 0,028 М раствор

значение рН, установленное при 7,2±0,4 с помощью 0,01М раствора лимонной кислоты.

Композицию 1 готовили следующим образом.

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 2,5 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мкл смеси бензилового спирта и этанола в соотношении 20:80 объем/объем и смесь слегка перемешивали. Затем к смеси добавляли 50 мг Cremophore^® ELP и смесь перемешивали на вортексе. Потом к смеси добавляли 500 мкл 8,4×10^-3 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI). Точный состав композиции 1 представлен в таблице 1.

Таблица 1
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Фотосенсибилизирующий агент
Pd-Bpheide-a	2,5 мг	0,25% м/м	Фотосенсибилизирующий агент
Другие компоненты
абсолютный этанол	40 мкл	4% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 1318, А2000
бензиловый спирт	10 мкл	1% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 0256,1997
Cremophore ® ELP	50 мг	5% м/м	поверхностно-активное вещество	РЕ, 4-е изд. 1082, 1997
8,4×10-3 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677, 1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456, 1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта композиция 1 настоящего изобретения является прозрачной, сильно окрашенной (темно-пурпурной), и она не содержит никаких следов осадка, что указывает на то, что Pd-Bpheide-a полностью солюбилизирован.

УФ-спектр поглощения Pd-Bpheide-a в этой композиции 1 настоящего изобретения имеет 5 основных пиков при 344, 385, 538, 763 и 818 нм с отношением оптических плотностей 763/818 выше 1, указывающим на то, что на спектральном уровне мономер составляет более 50% продукта.

Согласно условиям ICH эта композиция 1 стабильна при температуре 4°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, причем это подтверждено ВЭЖХ- и УФ-анализом.

Исследования токсичности инъецируемой композиции 1 проводили на различных видах животных после однократного или повторного внутривенного введения:

- крысе-самцу (Sprague Dawley), по 6-12 животных на каждую дозировку (2×5; 2×10 и 2×20 мг/кг). Продукт инъецировали внутривенно в хвостовую вену;

- кролику (новозеландский белый), по 5 животных при дозировке 5 мг/кг. Продукт инъецировали 3 раза внутривенно, 1 раз внутриартериально и 1 раз околовенно;

- обезьяне (Cynomolgus, массой, варьирующей от 2,5 кг до 3,2 кг), по 6-10 животных каждого пола и на каждую дозировку (1; 2,5 и 6 мг/кг). Продукт инъецировали внутривенно в подкожную вену ноги или головную вену один раз в сутки в течение 14 дней;

- обезьяне (Cynomolgus, массой, варьирующей от 2,25 кг до 4,7 кг), по 3-6 животных на каждую дозировку (2 мг/кг и 5 мг/кг). Продукт инъецировали внутривенно в подкожную вену ноги или головную вену.

Оценку животных осуществляли путем анализа клинических симптомов, биологических исследований крови и мочи, сердечно-сосудистых и гистопатологических исследований.

Эти исследования показали, что Pd-Bpheide-a и содержащая его инъецируемая композиция 1 хорошо переносятся при скоростях инъекции вплоть до 4 мл/мин.

Инъецируемая композиция 2

Композиция 2, содержащая 5 мг/мл Pd-Bpheide-a в качестве фотосенсибилизирующего агента

Наполнитель:

органическая фаза:
бензиловый спирт/этанол (20/80)	5% объем/масса
поверхностно-активное вещество:
Cremophore® ELP	5% масса/масса

NaOH: 0,028 М раствор

значение рН, установленное при 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты.

Композицию 2 получали следующим образом.

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 5 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мкл смеси бензилового спирта и этанола в соотношении 20:80 объем/объем и смесь слегка перемешивали. Затем к смеси добавляли 50 мг Cremophore ^® EL и смесь перемешивали на вортексе. Затем к смеси добавляли 500 мкл 0,028 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI). Точный состав композиции 2 представлен в таблице 2.

Таблица 2
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Фотосенсибилизирующий агент
Pd-Bpheide-a	5 мг	0,5% м/м	Фотосенсибилизирующий агент
Другие компоненты
абсолютный этанол	40 мкл	4% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 1318, А2000
бензиловый спирт	10 мкл	1% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 0256, 1997
Cremophore ® EL	50 мг	5% м/м	поверхностно-активное вещество	РЕ, 4-е изд. 1082, 1997
0,028 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677, 1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456, 1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта композиция 2 настоящего изобретения является прозрачной, сильно окрашенной (темно-пурпурной), и она не содержит никаких следов осадка, что указывает на то, что Pd-Bpheide-a полностью солюбилизирован.

УФ-спектр поглощения Pd-Bpheide-a в этой композиции 2 настоящего изобретения имеет 5 основных пиков при 344, 385, 538, 763 и 818 нм с отношением оптических плотностей 763/818 около 1, указывающим на то, что на спектральном уровне мономер составляет 50% продукта.

Согласно условиям ICH эта композиция 2 стабильна при температуре 4°С в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, причем это подтверждено ВЭЖХ- и УФ-анализом.

Следующие биологические тесты позволили показать важную роль и необходимость хорошей солюбилизации действующего начала, а также снижение содержания агрегированной формы по отношению к мономерной форме.

Тест, направленный на исследование дезагрегации однократно инъецированного полученного продукта, проводили на белом новозеландском кролике массой 3-4 кг.

Для этого исследования использовали трех кроликов.

Кролики получали дозу 5 мг/кг в ушную вену, то есть 3 мл инъецируемой композиции 2 с 5 мг/мл в случае кролика массой 3 кг.

Скорость вливания изменяли в пределах от 0,3 до 1 мл/мин.

Спектр поглощения Pd-Bpheide-a регистрировали непрерывно по спектроскопической отражательной способности при использовании многоканальной системы детектирования. Эта система позволяет осуществлять детектирование продукта на тканевом уровне на живом животном. Это позволяет, таким образом, наблюдать за превращением агрегатов в организме.

В этих условиях дезагрегация in vivo олигомера в мономерную форму происходит очень быстро между 15 и 30 минутами.

Отсутствие Cremophore в композиции не позволило достичь этой дезагрегации in vivo, и концентрация мономера тогда в продукте оставалась очень незначительной.

Исследования токсичности инъецируемой композиции 2 проводили на различных видах животных после однократного или повторного внутривенного введения:

1 - мыши (OF, массой, варьирующей от 25 г до 35 г), по 10 животных каждого пола и на каждую дозировку (0,2×25; 2×50; 2×75 и 1×100 мг/кг). Продукт инъецировали в хвостовую вену;

2 - крысе (Sprague Dawley, массой, варьирующей от 150 г до 230 г), по 4-10 животных каждого пола при дозировке (4 раза по 200 мг/кг). Продукт инъецировали в хвостовую вену;

3 - обезьяне (Cynomolgus, массой, варьирующей от 1,8 кг до 3,5 кг), по 1 животному каждого пола на каждую дозировку (8; 16 и 24 мг/кг). Продукт инъецировали внутривенно в подкожную вену ноги или головную вену один раз в сутки в течение 7 дней.

Оценку животных проводили путем анализа клинических симптомов, биологических исследований крови и мочи, гистопатологических исследований.

Эти исследования показали, что Pd-Bpheide-a и содержащая его инъецируемая композиция 2 хорошо переносятся при условии медленного проведения инъекций для того, чтобы имеющиеся олигомеры постепенно дезагрегировались в мономерную форму.

Инъецируемая композиция 3

Композиция 3, содержащая 5 мг/мл Pd-Bpheide-a в качестве фотосенсибилизирующего агента

Наполнитель:

органическая фаза:
бензиловый спирт/этанол (20/80)	5% объем/масса
поверхностно-активное вещество:
Solutol HS 15	10% масса/масса

NaOH: 0,028 М раствор

значение рН, установленное при 7,2±0,4 с помощью 0,01М раствора лимонной кислоты.

Композицию 3 получали следующим образом.

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 5 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мкл смеси бензилового спирта и этанола в соотношении 20:80 объем/объем и смесь слегка перемешивали. Затем к смеси добавляли 100 мг Solutol HS 15 (10% масса/масса) и смесь перемешивали на вортексе. Потом к смеси добавляли 500 мкл 0,028 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты, и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI). Точный состав композиции 3 представлен в таблице 3.

Таблица 3
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Фотосенсибилизирующий агент
Pd-Bpheide-a	5 мг	0,5% м/м	Фотосенсибилизирующий агент
Другие компоненты
абсолютный этанол	40 мкл	4% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 1318, А2000
бензиловый спирт	10 мкл	1% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 0256, 1997
Solutol HS 15	100 мг	10% м/м	поверхностно-активное вещество
0,028 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677, 1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456, 1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта композиция 3 настоящего изобретения является прозрачной, сильно окрашенной (темно-пурпурной), и она не содержит никаких следов осадка, что указывает на то, что Pd-Bpheide-a полностью солюбилизирован.

УФ-спектр поглощения Pd-Bpheide-а в этой композиции 3 настоящего изобретения имеет 5 основных пиков при 344, 385, 538, 763 и 818 нм с отношением оптических плотностей 763/818 около 1, указывающим на то, что на спектральном уровне мономер составляет 50% продукта.

Согласно условиям ICH эта композиция 3 стабильна при температуре 4°С в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, причем это подтверждено ВЭЖХ- и УФ-анализом.

Инъецируемая композиция 4

Композиция 4, содержащая 1 мг/мл Pd-Bpheide-a в качестве фотосенсибилизирующего агента

Наполнитель:

органическая фаза: бензиловый спирт/этанол (20/80) 5% объем/масса

поверхностно-активное вещество: Cremophore^®EL 5% масса/масса

NaOH: 0,007 М раствор

значение рН, установленное при 7,2±0,4 с помощью 0,01М раствора лимонной кислоты.

Композицию 4 получали следующим образом.

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 1 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мкл смеси бензилового спирта и этанола в соотношении 20:80 объем/объем и смесь слегка перемешивали. Затем к смеси добавляли 50 мг Cremophore^®EL и смесь перемешивали на вортексе. Потом к смеси добавляли 500 мкл 0,007 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI) Точный состав композиции 4 представлен в таблице 4.

Таблица 4
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Фотосенсибилизирующий агент
Pd-Bpheide-a	1 мг	0,1% м/м	фотосенсибилизирующий агент
Другие компоненты
абсолютный этанол	40 мкл	4% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 1318, А2000
бензиловый спирт	10 мкл	1% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 0256, 1997
Cremophore ®EL	50 мг	5% м/м	поверхностно-активное вещество	РЕ, 4-е изд. 1082, 1997
0,007 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677, 1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456, 1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта композиция 4 настоящего изобретения является прозрачной, сильно окрашенной (темно-пурпурной), и она не содержит никаких следов осадка, что указывает на то, что Pd-Bpheide-a полностью солюбилизирован.

УФ-спектр поглощения Pd-Bpheide-a в этой композиции 4 настоящего изобретения имеет 5 основных пиков при 344, 385, 538, 763 и 818 нм с отношением оптических плотностей 763/818, равным 80/20, указывающим на то, что на спектральном уровне мономер составляет 80% продукта.

Согласно условиям ICH эта композиция 4 стабильна при температуре 4°С в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, причем это подтверждено ВЭЖХ- и УФ-анализом.

Инъецируемая композиция 5

Композиция 5, содержащая 1 мг/мл Pd-Bpheid-a в качестве фотосенсибилизирующего агента

Наполнитель в водной фазе:

органическая фаза:пропиленгликоль	5% объем/масса
поверхностно-активное вещество:Cremophore®EL	5% масса/масса

NaOH: 0,007 М раствор

Значение рН, установленное при 7,2±0,4 с помощью 0,01М раствора лимонной кислоты.

Композицию 5 получали следующим образом,

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 1 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мкл пропиленгликоля и смесь слегка перемешивали. Затем к смеси добавляли 50 мг Cremophore^®EL и смесь перемешивали на вортексе. Потом к смеси добавляли 500 мкл 0,007 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI). Точный состав композиции 5 представлен в таблице 5.

Таблица 5
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Фотосенсибилизирующий агент
Pd-Bpheide-a	1 мг	0,1% м/м	фотосенсибилизирующий агент
Другие компоненты
пропилен-гликоль	50 мкл	5% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 0430,1997
Cremophore ®EL	50 мг	5% м/м	поверхностно-активное вещество	РЕ, 4-е изд. 1082,1997
0,007 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677,1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456,1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта композиция 5 настоящего изобретения является прозрачной, сильно окрашенной (темно-пурпурной), и она не содержит никаких следов осадка, что указывает на то, что Pd-Bpheide-a полностью солюбилизирован.

УФ-спектр поглощения Pd-Bpheide-a в этой композиции 5 настоящего изобретения имеет 5 основных пиков при 344, 385, 538, 763 и 818 нм с отношением оптических плотностей 763/818, равным 60/40, указывающим на то, что на спектральном уровне мономер составляет 60% продукта.

Согласно условиям ICH эта композиция 5 стабильна при температуре 4°С в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, причем это подтверждено ВЭЖХ- и УФ-анализом.

Композиция сравнения 1

Композиция сравнения 1, содержащая 1 мг/мл Pd-Bpheide-a

Наполнитель:

поверхностно-активное вещество:Cremophore ®EL

5% масса/масса

NaOH: 0,007 М раствор

значение рН, установленное при 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты.

Композицию сравнения 1 получали следующим образом.

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 1 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мг Cremophore ^®EL и смесь перемешивали на вортексе. Затем к смеси добавляли 500 мкл 0,007 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI). Точный состав сравнительной композиции 1 представлен в таблице 6.

Таблица 6
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Pd-Bpheide-a	1 мг	0,1% м/м	фотосенсибилизирующий агент
Cremophore®EL	50 мг	5% м/м	поверхностно-активное вещество	РЕ, 4-е изд. 1082, 1997
0,007 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677, 1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456, 1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта сравнительная композиция 1 содержит осадок, который указывает именно на то, что в отсутствие смеси бензилового спирта и этанола или пропиленгликоля Pd-Bpheide-a не полностью солюбилизирован.

Композиция сравнения 2

Композиция сравнения 2, содержащая 1 мг/мл Pd-Bpheide-a

Наполнитель:

этанол	5%
поверхностно-активное вещество: Cremophore ®EL	5% масса/масса

NaOH: 0,007 М раствор

значение рН, установленное при 7,2±0,4.

Композицию сравнения 2 получали следующим образом.

В стеклянный сосуд соответствующего размера, содержащий 1 мг Pd-Bpheide-a, полученного, как описано выше, добавляли 50 мкл этанола и смесь слегка перемешивали. Затем добавляли 50 мг Cremophore^®EL и смесь перемешивали на вортексе. Потом к смеси добавляли 500 мкл 0,007 М раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали в течение нескольких секунд на вортексе. Смесь после этого помещали под воздействие ультразвука на 30 минут (температура <25°С), перемешивая время от времени вручную. Затем значение рН устанавливали равным 7,2±0,4 с помощью 0,01 М раствора лимонной кислоты, и массу смеси доводили до 1 г с помощью воды для инъецируемого препарата (EPPI). Точный состав сравнительной композиции 2 представлен в следующей 7.

Таблица 7
Название соединений	Состав в ед. измерения в %		Функции	Ссылка на нормативные документы
Pd-Bpheide-a	1 мг	0,1%м/м	фотосенсибилизирующий агент
этанол	50 мкл	5% о/м	сорастворитель	РЕ, 4-е изд. 1318, А2000
Cremophore ®EL	50 мг	5% м/м	поверхностно-активное вещество	РЕ, 4-е изд. 1082, 1997
0,007 М раствор NaOH	500 мкл	50% о/м	солеобразователь	РЕ, 4-е изд. 0677, 1977
0,01 М раствор лимонной кислоты	до рН 7,2±0,4	до рН 7,2±0,4	буферный агент	РЕ, 4-е изд. 0456, 1997
EPPI до	1 г	100	разбавитель	РЕ, 4-е изд. 0169, А2000
где м/м = масса/масса; о/м = объем/масса; EPPI = вода для инъецируемого препарата.

Эта композиция сравнения 2 выпадает хлопьями, что указывает именно на то, что в отсутствие бензилового спирта Pd-Bpheide-a не полностью солюбилизирован.