способ выявления вируса крымской геморрагической лихорадки (кгл) в биологическом и полевом материале

Формула изобретения

Способ выявления вируса Крымской геморрагической лихорадки в биологическом и полевом материале посредством ОТ-ПЦР, отличающийся тем, что предварительно проводят селективное концентрирование вируса из биологического или полевого материала на алюмосиликатном магноиммуносорбенте, на котором иммобилизованы иммуноглобулины класса G против вируса КГЛ, а детекцию вируса КГЛ проводят методами ИФА или ОТ-ПЦР, при этом ИФА проводят в пенициллиновых флаконах.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при выявлении патогенных вирусов при их низкой концентрации в биологическом и полевом материале.

Известны ИФА и ОТ-ПЦР для диагностики КГЛ и детекции ее возбудителя в биологическом и полевом материале (Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Марков В.И. и др. Лабораторная диагностика вспышки геморрагической лихорадки в станице Обливской Ростовской области: доказательства этиологической роли вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки // Журн. микрбиол. - 2000. - №2. - С.32-36. Платонов А.Е., Карань Л.С., Родионова Е.Н. и др. Дифференциальная ПЦР-диагностика арбовирусных инфекций //Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Материалы 4-й Межгосударственной науч.-практ. конф. государств - участников СНГ (30 сент. - 2 окт. 2003 г., Саратов). - Саратов, 2003. - С.144-146; Карань Л.С., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки методом полимеразной цепной реакции //Клин. лаб. диагностика. - 2003. - №10. - С.50-54).

Недостатком данных методов является то, что возникают трудности при обработке проб из объектов внешней среды (почвы, клещей, комаров и т.д.), так как в этом случае необходимо избавиться от посторонних примесей и максимально сконцентрировать искомый антиген и специфическую РНК вируса КГЛ.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ идентификации вируса Крымской геморрагической лихорадки в пробах при помощи полимерной цепной реакции с обратной транскрипцией (Патент РФ №2209830. Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, авторов Петрова B.C., Петровой И.Д., Тюнникова Г.И., Серегина С.В., Яшиной Л.Н., Кузиной И.И. - С 12 Р 19/30, опубл. 10.08.2003, Бюл. №22).

Одним из важнейших условий успешного применения данной реакции в диагностике инфекционных заболеваний является наличие эффективных способов подготовки проб, тестируемых в ПЦР. Наиболее перспективным для этой цели представляется использование селективного концентрирования клеток (или ДНК) с помощью магнитных сорбентов (Кутырев В.В. и соавт., 1998).

Таким образом, ни использование в качестве твердого носителя алюмосиликатных магносорбентов, на которых иммобилизованы иммуноглобулины класса G против вируса КГЛ, ни выявление вируса КГЛ иммуноферментным методом с применением МИС, ни выявление РНК вируса КГЛ методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с применением МИС в вирусологии на существующем уровне исследований нам не известны. Исходя из этого можно сделать вывод, что изобретение соответствует критерию изобретательского уровня.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что выявление вируса КГЛ осуществляют путем селективного концентрирования на алюмосиликатном магноиммуносорбенте с последующим проведением иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, что повышает достоверность полученных результатов.

Отличительные признаки заявляемого объекта: иммунологическую реакцию на твердом носителе осуществляют с использованием алюмосиликатных магносорбентов, на которых иммобилизованы иммуноглобулины класса G против вируса КГЛ; детекцию вируса КГЛ проводят сочетанными методами МИС+ИФА и МИС+ПЦР.

Когда незначительное количество вируса в биологическом или полевом материале не позволяет выявить его известными способами, то возникающая потребность селективно концентрировать вирус достигается при помощи совокупности признаков, включенных в формулу изобретения.

Способ выявления вируса Крымской геморрагической лихорадки осуществляют поэтапно следующим образом.

1. Получение мышиных иммунных асцитических жидкостей (ИАЖ)

Иммунизацию взрослых беспородных белых мышей проводят путем 5-ти кратного внутрибрюшинного введения 10%-ной суспензии мозговой ткани зараженных 1-2 -дневных мышей-сосунков. Мозговую ткань извлекают у зараженных сосунков на пике заболевания. Все операции проводят в асептических условиях. При первой иммунизации вводят по 0,1 мл мозговой суспензии, предварительно инактивированной бета-пропиолактоном в конечной концентрации 0,3% в течение 10-12 ч при 4°С. Через 2 недели вводят вторую дозу мозговой суспензии, соединенную в равном объеме с полным адъювантом Фрейнда (фирма ICN). Третью, четвертую и пятую иммунизации проводят по аналогии со второй с интервалом в одну неделю. Через три дня после пятой иммунизации каждой мыши внутрибрюшинно вводят по 2 млн клеток мышиной саркомы TG-180. Через 2-3 недели, по мере накопления, из брюшной полости мышей в асептических условиях извлекают асцитическую жидкость, которую тестируют в реакции связывания комплемента (РСК) для определения титров специфических антител против вируса КГЛ. Пробы ПАЖ с высокими титрами отбирают для получения специфических иммуноглобулинов.

2. Получение специфических иммуноглобулинов класса G (IgG) против вируса КГЛ

IgG выделяют, используя метод двойного высаливания сернокислым аммонием. Добавляют к ИАЖ равный объем дистиллированной воды, затем навеску сернокислого аммония до 40%-ного насыщения раствора добавляют медленно при перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин. Оставляют при 4°С на 18 ч для стабилизации белка и формирования осадка. Центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до двойного объема исходной ИАЖ. Вносят в раствор навеску сернокислого аммония до 40%-ного насыщения, инкубируют 30 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре, а затем 18 ч при 4°С. Центрифугируют вышеуказанным способом, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до первоначального объема взятой в работу ИАЖ.

Полученный раствор IgG диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до исчезновения ионов NH₄ ⁺, что проверяют с помощью реактива Несслера.

Определяют количество белка спектрофотометрическим способом и активность IgG в реакции связывания комплемента (РСК). Содержание белка при выделении таким способом составляет 25-30 мг/мл, а активность в РСК - 1:640.

Полученные иммуноглобулины используют для приготовления иммунопероксидазного конъюгата и магноиммуносорбента.

3. Получение иммунопероксидазного конъюгата для детекции вируса КГЛ

Иммунопероксидазный конъюгат получают методом перйодатного окисления по P.K.Nakane, A.Kawaoi (1974) в нашей модификации следующим образом.

Для конъюгации IgG с ферментом используют пероксидазу хрена тип VI, RZ-3 (Sigma, США), которую в количестве 5 мг растворяют в 1 мл свежеприготовленного раствора 0,3 М двууглекислого натрия.

Добавляют 0,25 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. Затем добавляют 1 мл 0,04 М периодата натрия, осторожно перемешивают на магнитной мешалке еще 30 мин. Цвет раствора приобретает зеленовато-желтый оттенок. Вносят в раствор 1 мл 0,16 М этиленгликоля, перемешивают 1 ч. Все перечисленные операции проводят при комнатной температуре. Раствор диализуют против 1 л 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) рН 9,5 при 4°С в течение 18 ч. Раствор переносят во флакон, добавляют IgG против вируса КГЛ в концентрации 5 мг/мл в 1 мл КББ, перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляют 5 мг боргидрида натрия, оставляют без перемешивания в течение 2 ч при 4°С. Затем диализуют против 1 л 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 в течение 18 ч при 4°С. После этого добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) из расчета 10 мг на 1 мл. Конъюгат разливают в ампулы, лиофилизируют и хранят при 4°С.

4. Получение алюмосиликатного магноиммуносорбента

Смешивают 1,5 г алюмосиликата и 3 г магнитного порошка, тщательно растирают в ступке. Смешивают 30 мл полиглюкина (декстрана) и 30 мл дистиллированной воды. Затем к полученной навеске порциями добавляют раствор, тщательно перемешивая. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре или 18 ч при 4°С. Полученный сорбент высушивают при температуре 100-110°С в течение 30 мин, измельчают и методом рассева через сито выделяют фракции с размером частиц 80-120 микрон. Далее проводят активацию сорбента вторичным алкилсульфатом натрия. Для этого к 0,4 г магносорбента добавляют 3 мл ФСБ рН 7,2-7,4 и 0,2 мл вторичного алкилсульфата натрия. Инкубируют 1-2 ч при температуре 37°С. Затем проводят иммобилизацию IgG против вируса КГЛ на магносорбент в объеме 2 мл и концентрацией белка 2,5 мг/мл. Инкубируют 2 ч при температуре 37°С. Отмывают пятью объемами дистиллированной воды и пятью объемами ФСБ, придерживая МИС постоянным магнитом.

5. Проведение сочетанного метода МИС+ИФА для детекции вируса КГЛ

Проведение иммуноферментного анализа с использованием алюмосиликатных магноиммуносорбентов (МИС) проводят в пенициллиновых флаконах следующим образом. В контрольные и опытные флаконы вносят по 50 мкл 10% взвеси МИС к вирусу КГЛ. Затем в опытные флаконы вносят 200 мкл антигена вируса КГЛ, в 2 флакона с отрицательным контролем - 200 мкл ФСБ с 0,05% твина-20. Инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 30 мин. После удаления из флаконов раствора МИС трижды промывают ФСБ с твином, придерживая постоянным магнитом флакон с сорбентом. Затем во все флаконы вносят по 200 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного конъюгата для выявления антигена вируса КГЛ, в который перед внесением добавляют 10 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 1 мл конъюгата, инкубируют при (37±1)°С в течение 30 мин, промывают, как описано выше, 5-6 раз. После чего во флаконы с отрицательным контролем вносят 200 мкл субстрат-индикаторного раствора и засекают время реакции. Как только содержимое флаконов с отрицательным контролем начинает слегка желтеть, его в количестве 100 мкл вносят в лунку микропланшета с помощью автоматического дозатора (осторожно, не захватывая сорбент) и останавливают реакцию внесением 50 мкл 2 М раствора серной кислоты (стоп-реагент). Аналогичную операцию проводят с опытными образцами. Время инкубации МИС с субстрат-индикаторным раствором в отрицательном контроле и опыте должно быть строго одинаковым. Время регистрации результатов - 1-5 мин. Учет результатов проводят на регистрирующем устройстве Мультискан при длине волны 492 нм. Положительными считают пробы, если их оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превышает ОП отрицательного контроля. При отсутствии регистрирующего устройства учет результатов проводят визуально, при этом положительными считают пробы, цвет которых достоверно (на 50%) отличается от цвета контроля.

6. Проведение сочетанного метода МИС+ПЦР для детекции вируса КГЛ

Для проведения ПЦР-анализа используют унифицированную диагностическую тест-систему "АмплиСенс® ККГЛ" для выявления РНК вируса Крымско-Конголезской геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (производства ЦНИИЭ, Москва).

Из клещей готовят суспензии согласно прилагаемой инструкции к тест-системе.

Для проведения сочетанного метода МИС+ПЦР в пенициллиновые флаконы вносят 50 мкл 10% взвеси МИС и полученную суспензию клещей в полном объеме. Инкубирут 30 мин при 37°С. МИС трижды промывают ФСБ, придерживая постоянным магнитом флакон с сорбентом, и ресуспендируют в 150 мкл 0,15 М раствора хлорида натрия. Полученную суспензию используют для выделения РНК.

При выделении РНК из проб, сконцентрированных на МИС, используют один этап выделения с помощью комплекта "Рибо-сорб", что исключает применение сильнодействующих веществ (фенол, хлороформ) и показывает преимущество сочетанного метода детекции МИС+ПЦР. Все манипуляции проводят, строго следуя указаниям инструкции по применению тест-системы.

Таким образом, сочетанным методом МИС+ИФА нами исследовано 1017 суспензий клещей, которые предварительно были исследованы в "сэндвич"-варианте ИФА.

Результаты исследований показали, что за счет селективного концентрирования специфического антигена на поверхности МИС те пробы клещей, которые показывали сомнительный результат в ИФА в полистироловых планшетах, в разработанном нами сочетанном методе МИС+ИФА были положительными. Наряду с этим выявлены положительные пробы среди тех пулов, которые давали отрицательный результат при исследовании в ИФА с помощью экспериментальных диагностических тест-систем. Применение магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем позволило повысить выявляемость инфекционного агента в среднем на 4%.

Сравнительный анализ результатов, полученных при исследовании суспензий клещей с применением селективного концентрирования проб на магноиммуносорбентах показал, что сочетанный метод МИС+ПЦР значительно повышает чувствительность ПЦР-анализа (Таблица 1).

Таблица 1
Результаты сравнительного исследования суспензий клещей с целью детекции вируса КГЛ
Метод исследования	Количество проведенных анализов	Количество положительных результатов
		Абс.	%
ИФА	1803	141	7,8
МИС+ИФА	1803	201	11,1
ОТ-ПЦР	179	28	15,6
МИС+ПЦР	179	67	37,4

Проведенные нами исследования показали, что применение магноиммуносорбентов при проведении полимеразной цепной реакции позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем вирусом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген.

При сопоставлении результатов, полученных в ИФА и ОТ-ПЦР, и результатов сочетанных методов экспресс-анализов МИС+ИФА и МИС+ПЦР установлена закономерность повышения чувствительности за счет селективного концентрирования вируса на МИС.