способ презентации вирусных антигенов иммунной системе хозяина, основанный на протеасомоопосредованной технологии, предназначенный для разработки методов биологической защиты

Формула изобретения

Способ презентации антигенов вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей иммунной системе хозяина, основанный на протеасомоопосредованной технологии, характеризующийся тем, что ДНК-вакцинацию осуществляют с использованием рекомбинантных плазмид, содержащих ген орнитиндекарбоксилазы и ген-эквивалент неструктурного белка nsP1, или ген-эквивалент фрагмента L, или ген-эквивалент фрагмента М гликопротеина оболочки Е2 вируса ВЭЛ, выбранных из группы: соответственно pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, имеющих номера №№02/1, 02/2, 02/3, зарегистрированных в коллекции Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации или сочетанием плазмид pCI-neo-ООС-Е2-L, pCI-neo-ODC-E2-М.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области иммунологии.

Изобретение может быть использовано в иммунологических, серологических и вирусологических исследованиях по изучению и оценке защитных свойств препаратов нового поколения против вирусных инфекционных заболеваний, а также для разработки методов биологической защиты.

Достижения молекулярной биологии, генетической инженерии, иммунологии и биотехнологии открыли принципиально новые перспективные подходы конструирования различных типов вакцин. Практическую реализацию получили два направления: создание искусственных вакцин путем химического синтеза пептидов, имитирующих протективные антигены патогенов, и путем генно-инженерной технологии. Причем последнее направление получило наибольшее развитие и практическую реализацию. К вакцинам, полученным с помощью генно-инженерных технологий, относятся: векторные рекомбинантные вакцины, ДНК-вакцины, химерные вакцины, трансгенные вакцины.

В начале 90-х годов был предложен принципиально новый подход конструирования вакцин, при котором в качестве вакцинного препарата используется плазмида, содержащая ген(ы), кодирующий чужеродный целевой белок (протективные антигены патогена), так называемая полинуклеотидная вакцина, или ДНК-вакцина [1]. При создании ДНК-вакцин чаще всего используются плазмиды E.coli pUC типа, поскольку последние обеспечивают высокий выход и чистоту ДНК. Для достижения максимальной экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих используются вирусные промоторы, чаще всего цитомегаловирусный.

В настоящее время сконструированы и апробированы на различных экспериментальных моделях полинуклеотидные вакцины против ряда вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций [2].

Интенсивная работа ведется по конструированию ДНК-вакцин против флавивирусных инфекций, включая лихорадку Денге и энцефалиты (клещевой, японский, Западного Нила, Сент Луис, долины Муррей) [3, 4].

В рамках международного сотрудничества по борьбе с малярией проводится работа по созданию ДНК-вакцины против малярии, вызываемой Plasmodium falciparum [5].

В ряде экспериментов доказана возможность успешного применения полинуклеотидных вакцин для лечения аллергических болезней [6].

Недавно обнаружено, что полинуклеотидные вакцины могут индуцировать толерантность к экспрессируемым аутоантигенам и, следовательно, использоваться для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности диабета [7, 8].

Полинуклеотидные вакцины могут оказаться весьма эффективными не только как средства профилактики, но и в качестве лечебных препаратов при терапии хронических персистентных инфекций, так как они индуцируют сильный клеточноопосредованный иммунный ответ (цитотоксические Т-лимфоциты, Th-1-клетки), который приводит к элиминации патогенов.

Параллельно развитию методов конструирования вакцинных препаратов появляются новые данные о механизмах презентации антигенов иммунной системе хозяина. Так, в настоящее время сформировалось мнение о том, что клеточные органеллы животных - протеасомы - участвуют в процессинге антигенов, представляемых молекулами первого класса главного комплекса гистосовместимости. Реализуется данный процесс в непосредственной связи с убиквитинконъюгирующей системой [9]. Совместно с убиквитином потенциальной специфичностью к протеасомному комплексу обладает и ряд других конститутивных пептидов млекопитающих, что связано с наличием в их последовательностях сочетаний некоторых аминокислотных остатков, являющихся сильными сигналами деградации. К числу последних относится фермент орнитиндекарбоксилаза (ODC).

К основным клеточным процессам, регулируемым протеасомной системой, относятся: клеточный цикл и деление, дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз, сигнальная трансдукция, репарация ДНК, трансмембранный и везикулярный транспорт, реакция на стрессовые воздействия, в том числе на патогены. Многообразие процессов, регулируемых протеасомной системой, позволяет сделать вывод о ее главенствующей роли в такой кооперативной реакции организма, как иммунный ответ [10]. Использование протеасомоузнающих сигналов, обуславливающих антигенный процессинг и ускоренную презентацию иммунокомпетентным клеткам при конструировании вакцин нового поколения, может позволить получать высокоэффективные защитные препараты с повышенной иммуногенностью.

На сегодняшний день в научной литературе имеются данные об экспериментальной оценке пептидных вакцин, полученных при использовании протеасомной деградации in vitro, против ряда инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии [11, 12]. Однако использование технологии ДНК-вакцинации при реализации механизма направленного протеасомоопосредованного процессинга антигенов не описано.

Способ ДНК-вакцинации при реализации механизма направленного протеасомоопосредованного процессинга антигенов не имеет аналогов в Российской Федерации.

В качестве модельного возбудителя инфекционного заболевания, против которого разрабатываются профилактические средства, выбирают хорошо изученный возбудитель.

Вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) является одним из наиболее полно изученных как структурно, так и с точки зрения иммуно- и патогенеза возбудителей вирусных инфекций. Структурно возбудитель содержит одну молекулу РНК, ковалентно связанную с белком капсида и окруженную димером гликопротеинов оболочки Е1 и Е2, однако в условиях высокой множественности заражения возможно формирование полиплоидных вирионов, содержащих под одним суперкапсидом несколько нуклеокапсидов.

Оба гликопротеина оболочки (Е1 и Е2) имеют значение для сохранения инфекционности и патогенности вируса, однако если Е1 в большей степени определяет этап связывания вируса с рецепторами клеточной оболочки и последующий виропексис, то Е2 преимущественно индуцирует иммунный ответ организма на вирусную инфекцию, что показано в исследованиях с сыворотками реконвалесцентов.

При клонировании фрагментов структурных пептидов вирусов, имеющих антигенные детерминанты, необходимым условием является сохранение наиболее актуальных эпитопов. К настоящему времени антигенная структура гликопротеина Е2 (фиг.1) достаточно хорошо изучена, а эпитопы на его поверхности картированы как американскими, так и отечественными специалистами [13]. Иммунодоминантное положение занимает высоко консервативный участок, в состав которого входят фрагменты гена белка Е2 - М вируса ВЭЛ (фиг.1), расположенный в центральной зоне белка Е2 на небольшом удалении от сайта гликозилирования.

Целью настоящего изобретения является разработка способа ДНК-вакцинации, основанного на протеасомоопосредованной технологии (на примере вируса ВЭЛ) с использованием рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате молекулярно-биологических и иммунологических исследований разработан способ ДНК-вакцинации, основанный на протеасомоопосредованной технологии, с использованием рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP I, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M. Рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M получены в результате последовательного клонирования ген-эквивалентов неструктурного белка nsP1, фрагментов L, М структурного белка Е2 вируса ВЭЛ соответственно в составе гена орнитиндекарбоксилазы сначала в прокариотический плазмидный вектор рЕТ-23b, а затем в эукариотический плазмидный вектор pCI-neo.

В качестве контроля используются плазмиды pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М, полученные в результате последовательного клонирования гена ODC и фрагмента М гена Е2 вируса ВЭЛ соответственно сначала в прокариотический плазмидный вектор рЕТ-23b, а затем в эукариотический плазмидный вектор pCI-neo. Рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М депонированы в Специализированную коллекцию рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №№02/1, 02/2, 02/3, 02/4 и 02/5 соответственно.

Характеристика и молекулярно-биологические свойства рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и рС1-neo-Е2-М представлены в таблицах 1, 2.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена диаграмма конформационных эпитопов белка Е2 вируса ВЭЛ, проецированных на клонируемые фрагменты пептида в составе векторных плазмид рЕТ-23b и pCI-neo.

На фиг.2 показана схема ДНК-иммунизации внутримышечно белых мышей-самцов линии BALB/c (8-10 г) рекомбинантными плазмидами pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M и их комбинацией.

Пример выполнения

Пробирки с культурами Е.coli, содержащими рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М, извлекают из холодильника, температура хранения минус (20,0±2,0)°С. Проводят культивирование на среде LB с добавлением 25 мкг/мл ампициллина. Продолжительность культивирования составляет от 12 до 18 часов при температуре (37,0±0,5)°С.

Лизис бактериальных клеток осуществляют лизоцимом (10 мг/мл в 0,25 М Трис-HCl, рН 8,0) в присутствии 10%-ного SDS. Хромосомную ДНК удаляют высокоскоростным центрифугированием с последующей двойной экстракцией смесью фенол/хлороформ и одной экстракцией хлороформом. Остатки РНК удаляют методом гель-фильтрации на колонках с сефарозой 2В и осаждают двойным объемом перегнанного холодного 70%-ного этилового спирта. Концентрацию выделенной плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически, учитывая тот факт, что одна оптическая единица при 260 нм соответствует 50 мкг ДНК в 1 мл [14]. После осаждения центрифугированием осадок плазмидной ДНК растворяют в буфере ТЕ до концентрации 1 мг/мл.

Выделенные и очищенные препараты оценивают затем электрофоретически в 0,8% агарозном геле. Электрофорез проводят при температуре (20,0±2,0)°С в течение 18 часов при напряженности электрического поля 1-2 В/см. Размер пластины 20×20 см².

Полученные препараты представляют собой очищенные препараты ДНК рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М, которые используются в качестве ДНК-вакцин против вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

Для иммунизации (фиг.2) используют белых мышей BALB/c массой 7-8 г. Водные растворы плазмидных ДНК (концентрация ДНК 1 мг/мл) вводят однократно в мышцу бедра задней лапы белой мыши (-100 мкг ДНК/мышь).

В качестве положительного контроля служат белые мыши, иммунизированные подкожно в холку суспензией желточных мешков, инфицированных вакцинным штаммом вируса ВЭЛ (иммунизирующая доза - 3,7 lg ED₅₀/мышь). Отрицательными контрольными группами при ДНК-вакцинации являются животные, иммунизированные плазмидами, содержащими ген-эквиваленты ODC и пептида М, а также интактные мыши. Использование этих плазмид необходимо для оценки возможного неспецифического действия орнитиндекарбоксилазы и специфического фрагмента белка Е2 на иммунитет лабораторных животных.

Иммунизацию животных проводят трехкратно. Бустерные иммунизации проводят через 4 и 3 недели соответственно. У 50% мышей на 14 сутки отбирают кровь для анализа методом ТФИФА. Остальных животных инфицируют смертельной дозой вирулентного штамма вируса ВЭЛ (100 LD₅₀/мышь). После заражения срок наблюдения за грызунами составляет 14 суток.

С целью изучения иммуногенного и протективного эффекта комбинированной вакцинации лабораторным животным одновременно вводят смесь изучаемых препаратов плазмидной ДНК с ген-эквивалентами фрагмента белка Е2-L и М (pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M).

Иммуногенную активность рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты генома вируса ВЭЛ, инъецированных как по отдельности, так и в комбинации, определяют по титру гуморальных антител в сыворотке крови иммунизированных белых мышей с помощью метода ТФИФА. Оцениваемые препараты, их комбинация, группы животных и титры антител представлены в таблице 3.

У всех животных, иммунизированных вакцинным штаммом вируса ВЭЛ (положительный контроль), выявляются специфические антитела к вирусу (в разведении не меньшем, чем 1:100). В то же время у большей части мышей, иммунизированных смесью плазмид pCI-neo-ODC-E2-L+pCI-neo-ODC-E2-M (83%) и плазмидой pCI-neo-ODC-nsP1 (78%) также отмечается положительная сероконверсия (таблица 4).

Протективную эффективность рекомбинантных плазмид рассчитывают, определяя разницу величины процента выживших (после заражения вирулентным вирусом ВЭЛ) мышей в группе, иммунизированной вакцинным штаммом вируса ВЭЛ, и в группе животных, инъецированных рекомбинантной плазмидой или смесью плазмид (при 100% гибели неиммунизированных мышей).

Комбинированная внутримышечная иммунизация плазмидной ДНК со встроенными ген-эквивалентами пептидов L и М белка Е2 вируса ВЭЛ индуцирует у большей части белых мышей выработку специфических антител и защиту от гибели при заражении летальной дозой вирулентного штамма возбудителя (таблица 4).

Таблица 3
Доля положительных антисывороток к вирусу ВЭЛ в группах белых мышей BALB/c, иммунизированных плазмидной ДНК со
встроенным геном ОДК и фрагментами генома вируса ВЭЛ, определенных с помощью ТФИФА
	Группа животных, иммунизированных
Показатель	Подкожно суспензией вакцинного штамма вируса ВЭЛ (3,7 ЕД 50/мл )	внутримышечно (100 мкг/мышь)						внутрикожно, методом "генного ружья" (1 мкг/мышь)
		pCI-neo-ODC	pCI-neo-E2-M	pCI-neo-ODC-E2-M	pCI-neo-ODC-E2-L	pCI-neo-ODC-E2-M+ pCI-neo-ODC-E2-L	pCI-neo-ODC-nsP1	pCI-neo-ODC	pCI-neo-E2-M	pCI-neo-ODC-E2-M	pCI-neo-ODC-E2-L	pCI-neo-ODC-nsP1
Количество мышей в группе	6	6	6	6	5	6	7	6	5	5	5	7
Отношение средней величины флуоресценции (ВФ) в сыворотке животного контрольной группы к средней ВФ в сыворотках интактных белых мышей	9,8	1,6	1,1	1,0	1,5	2,1	1,1	1,5	1,3	1,4	3,1	1,3
	9,4	1,4	2,1	1,6	2,2	3,3	1,4	1,5	1,5	1,6	1,0	1,9
	8,7	1,5	2,3	2,1	0,9	3,9	2,4	1,5	1,5	1,3	1,5	1,1
	6,6	0,9	0,8	1,6	1,4	1,5	1,6	0,9	1,0	1,8	1,0	2,2
	11,4	0,6	1,1	1,1	0,9	4,3	1,2	0,6	1,2	1,5	1,2	1,0
	9,1	1,4	1,2	1,2	-	2,7	1,0	1,4	-	-	-	1,0
	-	-	-	-	-	-	1,2	-	-	-	-	1,6
Процент животных с положительной сероконверсией (%)	100-17	0+17	33±21	17±17	20±20	83±17	14±14	0+17	0+20	0+20	20±20	14±14
Примечания: 1) белые мыши иммунизировались трехкратно. Бустерные иммунизации проводились через 4 и 3 недели
соответственно. Кровь отбирали через 14 дней после последней иммунизации;
2) ответ антител считается положительным, если отношение ВФ опыт/ВФконтроль равно или более величины 2,1;
3) Разведение сывороток 1:10; разведение сывороток мышей, иммунизированных антигеном вируса ВЭЛ - 1:100;
4) средняя ВФ и ее ошибка ( ± х) в сыворотках интактных животных равна 84,9±9,6;
5) "-" - нет данных.

Таблица 4
Доля белых мышей BALB/c с положительной сероконверсией и выживших после заражения вирусом ВЭЛ в результате иммунизации плазмидной ДНК со встроенным геном ODC и участками генома вируса ВЭЛ
Способ иммунизации	Доля животных (%)	Группа животных, иммунизированных							Интактные мыши
		плазмидой						суспензией вакцинного штамма 238 вируса ВЭЛ
		pCI-neo-ODC	pCI-neo-Е2-М	pCI-neo-ODC-Е2-М	pCI-neo-ODC-E2-L	pCI-neo-ODC-E2-L+pCI-neo-ODC-E2-M	pCI-neo-ODC-nsP1
внутримышечный	с положительной сероконверсией	0+17	33±21	17±17	20±20	83±17	14±14	-	-
	выживших	40±24	33±21	88±12	83±17	83±17	78±14	-	-
внутрикожный («генное ружье»)	с положительной сероконверсией	0+17	0+20	0+20	20±20	-	14±14	-	-
	выживших	43±20	33±21	40±24	38±18	-	71±18	-	-
подкожный	с положительной сероконверсией	-	-	-	-	-	-	100-17	-
	выживших	-	-	-	-	-	-	100-12	-
нет иммунизации	с положительной сероконверсией	-	-	-	-	-	-	-	0+17
	выживших	-	-	-	-	-	-	-	0+14
Примечания: 1) «-» - нет данных;
2) средняя величина показателя и ее ошибка ( ) определялись по таблице B.C.Генеса [15];
3) заражающая доза вирулентного штамма вируса ВЭЛ равна 100 LD50/мышь;
4) срок наблюдения за животными после заражения 14 суток.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines // Amer. J.Respir. Crit Care Med. - 2000. - Vol.162. - P.190-193.

2. Robinson H.L., Boyle C.A., Feltquate D.M. et al. DNA immunization for influenza virus: studies using hemagglutinin - and nucleoprotein - expressing DNAs vaccine // J. Inf. Dis. - 1997. - Vol.176. - P.50-55.

3. Chang G.J., Davis B.S., Hunt A.R. et al. Flavivirus DNA vaccines: current status and potential // Arm. N.-Y. Acad. Sci. - 2001. - Vol.951. - P.272-285.

4. Kinney R.M., Huang C.Y.H. Development of new vaccines against dengue fever and Japanese encephalitis // Intervirology. - 2001. - Vol.44, №2/3. -P.176-197.

5. Kumar S., Epstein J.E., Richie T.L. et al. A multilateral effort to develop DNA vaccines against falciparum malaria // Trends Parasitol. - 2002. - Vol.18, №3. - P.129-135.

6. Von Herrath M.G., Whitton J.L. DNA vaccination of treatment autoimmune diabetes // Ann. Med. - 2000. - Vol.32, №5. - P.285-292.

7. Hsu C.H., Chua K.Y., Tao M.N. et al. Immunoprophylaxis of allergen-induced immunoglobulin E and airway hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization // Nat. Med. - 1996. - Vol.2. - P.540-544.

8. Robinson W.H., Garren H., Utz P.J. et al. Proteomics for the development of DNA tolerising vaccines to treatment to immune disease // Clin. Immunol - 2002. - Vol.103, №1. - P.7-12.

9. Hochshtrasser M. Ubiquitin-dependent protein degradation // J. Annu. Rev. Genetics. - 1996. - Vol.30. - P.405-439.

10. Tanaka К. Molecular biology of proteasomes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol.247. - P.537-541.

11. Yang Y., Ahn К., Petrson P.A. In vivo assembly of the proteasomal complexes, implications for antigen processing // J.Biol. Chem. - 1995. - Vol.270. - P.27687-27694.

12. Salter R.D., Howell D.N., Cresswell P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B Lymphoblastoid hybrids // Immunogenetics. - 1995. - Vol.21. - P.235-246.

13. Fields Virology. Edited by B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley et al. - Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers. - 1996. - 480 p.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук ДЖ. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. под ред. А.А.Баева, К.Г.Скрябина. - М.: Мир, 1984. - 479 с.

15. Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1998. - 208 с.