питательная среда для выращивания staphylococcus warneri - продуцента антибактериального пептидного фактора

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания Staphylococcus warneri - продуцента антибактериального пептидного фактора, содержащая казаминовые кислоты и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит дрожжевой экстракт, калий фосфорно-кислый двузамещенный, магний серно-кислый, натрий лимонно-кислый 2-водный, аммоний серно-кислый, глюкозу в следующем соотношении компонентов, г/л системы:

Казаминовые кислоты	10-12
Дрожжевой экстракт	3-5
Калий фосфорно-кислый
двузамещенный	7-8
Магний серно-кислый	0,1-0,2
Натрий лимонно-кислый
2-водный	0,5-0,6
Аммоний сернокислый	2-2,5
Глюкоза	1-2
Вода дистиллированная	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и предназначено для выращивания стафилококков с целью получения антибактериальных пептидных соединений.

Известна богатая питательная среда LB, предназначенная для выращивания широкого спектра микроорганизмов, в том числе бактерий рода Staphylococcus, содержащая следующие компоненты, г на 1 л дистиллированной воды: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, натрий хлористый - 10 г (Дж.Миллер Эксперименты в молекулярной генетике. Под ред. С.И.Алиханяна. М.: Мир, 1976, с.394-395).

При росте культуры-продуцента S.warneri на данной среде при достижении количества клеток 1,9-2·10 ⁹ КОЕ/мл накопление антибактериального пептидного фактора в среде прекращается. В результате данная среда, обеспечивая рост бактерий-продуцентов, не позволяет получить высоких количеств антибактериального пептидного фактора в культуральной жидкости (В.П.Коробов, Л.М.Лемкина, Т.В.Полюдова. Продукция антибактериального фактора широкого спектра действия клетками Staphylococcus warneri. Доклады Академии наук, 2003, том 390, №5, с.1-3).

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению является среда Muller-Hinton (MH), часто используемая для культивирования микроорганизмов, в том числе стафилококков, а также для постановки тестов на определение чувствительности бактерий к антибактериальным агентам, содержащая, г на 1 л дистиллированной воды: казаминовые кислоты - 17,5 г, экстракт мяса - 3 г, крахмал - 1,5 г, рН 7,0-7,2 (Atlas R.M., Parks L.C. Handbook of Microbiological media, 1993, p.629).

Использование среды МН для выращивания стафилококков для получения повышенного содержания антибактериального пептидного фактора в среде культивирования дало положительный результат. Через 10 часов роста достигается высокий выход биомассы клеток -4,5·10⁹ КОЕ/мл. Антибактериальная активность супернатанта культуры-продуцента к этому часу проявлялась в разведении 1/1024. Однако пересев стафилококков со среды LB на жидкую среду МН вызывал удлинение lag-фазы и более поздний переход в стационарную стадию роста, когда наблюдалась максимальная продукция антибактериального пептидного фактора. Другим недостатком данной среды является необходимость щадящего режима стерилизации (при 115°С в течение 10 мин), не обеспечивающего абсолютной стерильности растворов.

Техническим результатом изобретения является повышение ростовых свойств среды и увеличение продукции культурой S. warneri антибактериального пептидного фактора. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда содержит следующие компоненты, г на 1 л дистиллированной воды: казаминовые кислоты - 10-12, дрожжевой экстракт - 3-5, калий фосфорнокислый двузамещенный - 7-8, магний сернокислый - 0,1-0,2, натрий лимоннокислый 2-водный - 0,5-0,6, аммоний сернокислый - 2-2,5, глюкоза - 1-2, рН среды 7,0-7,2.

Для предотвращения осахаривания крахмала, наблюдающегося в процессе автоклавирования среды МН при 115°С, крахмал заменен стерильным раствором глюкозы.

Замена экстракта мяса в среде-прототипе на дрожжевой экстракт позволила значительно удешевить среду, но это привело к снижению показателей роста.

Для восстановления ростовых свойств полученной среды в ее состав был введены минеральные компоненты, что привело к восстановлению оптимальных параметров роста S.warneri и резкому увеличению продукции антибактериального пептидного фактора.

Все внесенные в состав среды изменения приводят к улучшению роста культуры S.warneri и увеличению антибактериальной активности супернатанта среды культивирования.

Среду готовят следующим образом:

Пример 1.

Для приготовления 1 л среды берут, г:

казаминовые кислоты	8
дрожжевой экстракт	2
калий фосфорнокислый двузамещенный	5
магний сернокислый	0,1
натрий лимоннокислый 2-водный	0,5
аммоний сернокислый	2
глюкоза	1
вода дистиллированная	Остальное

Готовят навески компонентов, растворяют их в 500-600 мл дистиллированной воды, доводя рН раствора до значения 7,0-7,2 при помощи фосфорной кислоты, а общий объем дистиллированной водой до 1 л. Среду разливают по 400 мл во флаконы емкостью 500 мл и стерилизуют при 120°С в течение 1 ч. Перед засевом микроорганизмов добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы до конечной концентрации 0,1%.

Антибактериальную активность в супернатантах культуры-продуцента, полученных при выращивании на среде-аналоге, среде-прототипе и предлагаемой среде, проверяли на жидкой среде МН с использованием планшетов для иммунологических реакций. В лунки планшета помещали по 100 мкл питательной среды МН, затем в первую лунку ряда вносили 100 мкл исследуемого стерильного супернатанта культуры-продуцента и готовили ряд последовательных двукратных разведений, после чего в каждую ячейку добавляли по 10 мкл суспензии чувствительных. клеток S.epidermidis, содержащей 1,5-2·10⁶ КОЕ/мл. Планшеты инкубировали в термостате в течение 16-18 ч при 37°С. За единицу активности (ЕА) антибактериального пептидного фактора принимали обратную величину максимального разведения, при котором наблюдалось торможение роста тест-бактерий.

Пример 2. Для приготовления 1 л среды, берут, г:

казаминовые кислоты	13
дрожжевой экстракт	5
калий фосфорнокислый двузамещенный	10
магний сернокислый	0,1
натрий лимоннокислый 2-водный	0,5
аммоний сернокислый	2,5
глюкоза	2
вода дистиллированная	Остальное

Процедура приготовления по примеру 1. Перед засевом микроорганизмов в среду добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы до конечной концентрации 0,2%.

Пример 3 (по заявленному изобретению). Для приготовления 1 л среды берут, г:

казаминовые кислоты	10
дрожжевой экстракт	3
калий фосфорнокислый двузамещенный	7
магний сернокислый	0,1
натрий лимоннокислый 2-водный	0,5
аммоний сернокислый	2
глюкоза	2
вода дистиллированная	Остальное

Процедура приготовления по примеру 2.

Рост культуры S.warneri на среде-аналоге, среде-прототипе и предлагаемой среде представлен на чертеже. Интенсивность продукции антибактериального пептидного фактора на разных средах показана в таблице 1.

Параметры роста S.warneri и уровень антибактериальной активности супернатантов на средах по примерам 1-3 приведены в таблице 2.

Как видно из чертежа и таблицы 1, скорость роста культуры S.warneri и продукция антибактериального пептидного фактора значительно интенсивнее на предлагаемой среде. Антибактериальная активность на предлагаемой среде выше в 16 раз по сравнению со средой-аналогом и в 4 раза по сравнению со средой-прототипом.

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что использование среды по примеру 1 увеличивает время культивирования бактерий, а антибактериальная активность супернатантов снижается в 4 раза.

Как указано в таблице 2, не наблюдается отличий в интенсивности роста и продукции антибактериального пептидного фактора на средах по примерам 2 и 3. Использование предлагаемой среды с соотношением компонентов, указанным в примере 3, является оптимальным для культивирования S.warneri и получения антибактериального пептидного фактора, а также значительно сокращает расход питательных компонентов.

Таким образом, применение разработанного варианта жидкой питательной среды обеспечивает интенсивный рост стафилококков с первых часов культивирования и позволяет достигнуть максимального выхода антибактериального пептидного фактора через 8 ч роста культуры. Стоимость 1 л предлагаемой среды 2,21 у.е., что ниже стоимости среды Muller-Hinton и среды LB в 2,2 и 1,6 раза соответственно.

Таблица 1
Среда	Среда-аналог		Среда-прототип		Предлагаемая среда
Антибактериальная активность (ЕА)	256		1024		4096
Таблица 2
Показатели роста		Пример 1		Пример 2	Пример 3
Длительность культивирования (часы)		9-10		7-8	7-8
Максимальное количество бактерий (КОЕ/мл)		2,8-3×109		3,5×10 9	3,5×10 9
Антибактериальная активность (ЕА)		1024		4096	4096