штамм alcaligenes sp. el 135 для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды

Формула изобретения

Штамм микроорганизма-деструктора Alcaligenes SP. EL 135 В-1023 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, водных стоков, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Микроорганизмы природных экосистем являются важным звеном в самоочищении почв и водоемов от загрязнений, а также основой для разработки высокоактивных биопрепаратов для интенсификации этого процесса.

Известен штамм Pseudomonas alcaligenes B-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов [1].

Недостатком данного штамма является относительно низкий процент биодеструкции нефти (51% за 5 суток инкубирования при температуре 28°С).

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является штамм Pseudomonas alcaligenes E 7 для биодеградации нефтезагрязнений [2, прототип]. Эффективность утилизации нефти у штамма Pseudomonas alcaligenes E 7 составляет 63% за 5 суток инкубирования при температуре 28°С.

Недостатком данного штамма является относительно низкий показатель утилизации углеводородов за данный промежуток времени при температуре 28°С.

Технической задачей изобретения являлось получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации углеводородов за короткий промежуток времени.

Поставленная задача решается применением Alcaligenes sp. EL 135 для утилизации углеводородов нефти. Штамм выделен из донных отложений реки Ельцовки-1 в черте города Новосибирска.

Предлагаемый штамм депонирован в НИИ "Коллекция Культур Микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" под номером №В1023. Справка о депонировании штамма прилагается.

Характеристика штамма Alcaligenes sp. EL 135.

Штамм на плотных питательных средах образует белесые, полупрозрачные, блестящие, гладкие колонии с ровным краем; клетки штамма представляют собою грамотрицательные укороченные коккобациллы, размером 0,9-1,0×1,5-1,8 мкм. Штамм El 135 является аэробом, растет в диапазоне температур от 4-6 до 35°С; не гидролизует крахмал, не разжижает желатин, не образует ацетоин, не утилизирует глюкозу, лактозу, галактозу, ксилозу, рамнозу, дульцит, маннит, мальтозу, арабинозу, сахарозу, сорбит, инозит. Обладает цитратной, оксидазной активностью, не обладает каталазной, казеинолитической на молочном агаре, лецитиназной, липазной, уреазной активностью, гемолитическими, фибринолитическими, плазмокоагулазными свойствами, восстанавливает нитраты в нитриты. Реакция с метиловым красным отрицательная. Штамм El 134 устойчив к карбенициллину, линкомицину; чувствителен к олеандомицину, рифампицину, мономицину, тетрациклину, эритромицину, левомицетину, неомицину, стрептомицину, канамицину, полимиксину, гентамицину, пенициллину, ампициллину, оксациллину, ристомицину.

Хранение штамма осуществляется периодическими пересевами на косячках агаризованной минеральной среды 8Е с глюкозой (1%) и при низкотемпературном замораживании в 15% растворе глицерина [3].

Посевной материал получают при выращивании штаммов на жидкой или агаризованной среде 8Е. Состав среды 8Е (г/л): (NH₄)₂ HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,7; MgSO ₄×7Н₂О - 0,8; NaCl - 0,5; рН 7,2.

Для наработки биомассы штамма в качестве источника углерода к среде 8Е добавляют глюкозу (1%); для определения способности штамма к деструкции - сырую нефть или нефтепродукт, добавленные по весу (до 0,5-2%).

Штамм Alcaligenes sp. EL 135 вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 4-25 суток на термостатированной качалке при комнатной температуре.

Преимуществами штамма являются высокая степень деструкции углеводородов (до 97% за 7 суток) и способность расти на обедненной минеральной питательной среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода.

Исследованный штамм-деструктор Alcaligenes sp. EL 135 предложен впервые, в связи с чем можно сделать вывод о его соответствии критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Описание графических изображений

Фиг.1. Газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов в течение 7 суток инкубирования при температуре 23°С.

Фиг.2. Газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти после биодеструкции штаммом Alcaligenes sp. EL 135 в течение 7 суток инкубирования при температуре 23°С.

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример 1. Минеральную среду 8Е разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть вносят из расчета 2% (2 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 7 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре 23°С. Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью без добавления штамма (Фиг.1 и 2, Таблица). Через 2-3 сут культивирования в опытных колбах наблюдают мощную биоэмульгацию. Для остаточной нефти, содержащейся в среде, проводят газохроматографический анализ на 7-ые сутки.

Пробу культуральной жидкости после биодеструкции (15 мл), содержащую первоначально 30 мг нефти, количественно переносят в делительную воронку объемом 250 мл, экстрагируют хлороформом (2×50 мл, 2×40 мл, 1×10 мл). Хлороформные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре 30°С, количественно переносят хлороформом в мерную колбу объемом 50 мл, содержимое колбы доводят до риски хлороформом. Полученный образец используют для анализа.

Количественное определение содержания предельных углеводородов проводят методом капиллярной газовой хроматографии на приборе Varian 3600, оснащенном колонкой J&W Scientific DB-5, 30 м×0,22 мм, инжектором с делением потока (темп. 320°С), пламенно-ионизационным детектором (темп. 335°С), системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, Broker). В ходе анализа программируют изменение температуры колонки: 50°С - 2 мин, 50°С-320°С - 15°С/мин, 320°С - 5 мин. Отнесение хроматографических пиков выполняют по времени удерживания с использованием калибровочного образца Boiling Point Calibration Sample #1, Hewlett Packard.

Для данного штамма Alcaligenes sp. EL 133 степень деструкции достигает 97% за 7 сут.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Патент РФ №2133770 "Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes B-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов", C 12 N 1/20, опубликован 27.07.1999.

2. Патент РФ №2134723 "Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes E7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов", В 09 С 1/10, опубликован 20.08.1999.

3. Методы общей бактериологии / под ред Ф.Герхарда и др. - М.: Мир, 1983. - С.528.

Таблица 1.
Утилизация углеводородов нефти в культуральной жидкости после биодеструкции штаммом Alcaligenes sp. EL 135.
Углеводород	Кол-во атомов углерода	Утилизация углеводородов нефти (%) в культуральной жидкости
н-Додекан	С12	88
н-Тридекан	С13	92
н-Тетрадекан	С14	98
н-Пентадекан	С15	98
н-Гексадекан	С16	99
н-Гептадекан	С17	99
н-Октадекан	С18	97
н-Нанодекан	С19	96
н-Эйкозан	С20	99
н-Генэйкозан	С21	98
н-Докозан	С22	93
н-Трикозан	С23	98
Н-Тетракозан	С24	97
Н-Пентакозан	С25	98
Н-Гексакозан	С26	96
Н-Гептакозан	С27	97
Н-Октакозан	С28	98
Н-Нанокозан	С29	98
Н-Триконтан	С30	95
н-Гентриконтан	С31	91
н-Дотриконтан	С32	98
н-Тритриконтан	С33	99
Среднее значение по найденным углеводородам		97