среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина

Формула изобретения

1. Среда для выращивания кишечной палочки, содержащая лимонную кислоту, хлористый натрий, сернокислый магний, фосфорнокислый калий двузамещенный, сернокислое железо, аспарагин, глюкозу, глицерин, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит вышеприведенные компоненты при следующем содержании, г/л дистиллированной воды:

Лимонная кислота	4,9-5,0
Хлористый натрий	0,9-1,0
Сернокислый магний	1,9-2,0
Фосфорнокислый калий
двузамещенный	1,9-2,0
Сернокислое железо	0,04-0,05
Аспарагин	0,9-1,0
Глюкоза	2,9-3,0
Глицерин	10,0-11,0

2. Способ получения колибактериозного анатоксина кишечной палочки, включающий выращивание кишечной палочки на жидкой питательной среде, детоксикацию формалином, отделение полученной биомассы фильтрацией, сорбцию на геле гидрата окиси алюминия, отличающийся тем, что выращивание кишечной палочки ведут на жидкой питательной среде по п.1 формулы изобретения, а детоксикацию проводят 0,6%-ным формалином при температуре 49-50°С в течение 7-9 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и касается разработки жидкой синтетической среды для выращивания кишечной палочки и способов получения анатоксина кишечной палочки.

Известно использование бульона Хоттингера для выращивания кишечной палочки при получении вакцины против колибактериоза (Малахов Ю.А. Вакцина против колибактериоза поросят. А.С. №1149466 от 29.07.83 г.).

Недостатком является применение дорогой питательной среды, нестандартность ее состава, технологические трудности культивирования кишечной палочки, связанные с аэрацией.

За прототип взята синтетическая питательная среда для выращивания синегнойной палочки, также относящейся к кишечной инфекции (Среда для выращивания синегнойной палочки. Патент №22033943. Авторы: Евглевская Е.П., Лоторев А.Н., Евглевский А.А., Галкин В.В., Лапиков С.Н.).

Ее состав содержит следующие компоненты в граммах на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 4,9-5,0; хлористый натрий - 0,9-1,0; сернокислый магний - 4,9-5,0; аспарагин - 0,9-1,0; глицерин - 30-31,0 мл; глюкоза - 0,9-1,0; сернокислое железо - 0,04-0,05.

Пересеянная с мясопептонного бульона (МПБ) на данную питательную среду культура кишечной палочки позволяла обеспечить хороший рост и накопление биомассы в пределах 13-14 млрд. микробных тел в 1 мл, что свидетельствовало о ее потенциальной перспективности использования для получения вакцинных и антигенных препаратов.

Тем не менее, недостатком данной питательной среды являлось то, что ее состав был оптимизирован для выращивания синегнойной палочки, а в этой связи он в меньшей степени отвечал ростовым потребностям кишечной палочки.

Для устранения данного недостатка были проведены поисковые опыты по оптимизации известного состава питательной среды, в наибольшей степени отвечающей ростовым потребностям кишечной палочки, позволяющей обеспечить накопление биомассы в пределах 15-16 млрд. микробных тел на 1 мл. При этом важным условием являлось упрощение технологии культивирования кишечной палочки, в частности исключение процесса аэрации.

Результаты исследований показали, что уменьшение содержания в питательной среде калия фосфорнокислого двухзамещенного, магния сульфата, до 2 г/литр и глицерина до 10 мл/литр не отразилось на накоплении биомассы кишечной палочки.

Увеличение содержания глюкозы до 3 г/л в питательной среде оказало позитивное влияние на ускорение процесса роста и максимального накопления биомассы кишечной палочки до 14-15 млрд. микробных тел/мл. Последовательные пересевы кишечной палочки на модифицированной синтетической среде не вызвали ослабления или усиления роста микроорганизмов. Однако выяснилось, что последовательные 5-6 пересевов кишечной палочки на синтетической среде могли привести у отдельных культур к утере гемолитических свойств. Последнее необходимо учитывать при изготовлении вакцинных и антигенных препаратов из кишечной палочки.

Таким образом, использование нового варианта жидкой синтетической среды позволяет не менее 5 раз использовать последовательный пересев на ней культуры кишечной палочки, прежде чем она потеряет гемолитические свойства. В то же время добавление к синтетической среде 5% МПБ позволяло в наибольшей степени сохранять антигенные свойства исходной культуры без утери ее гемолитических свойств после 5 последовательных пересевов. Стабильное накопление биомассы до 15-16 млрд. микробных тел в 1 мл без необходимости стерильной подачи воздуха значительно облегчает технологический процесс производства антигенных и вакцинных препаратов. При этом для выращивания кишечной палочки не требуются дефицитные и дорогие продукты животного происхождения.

Разработанная среда содержит компоненты в следующем соотношении на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 1,9-2,0; хлористый натрий 0,9-1,0; сернокислый магний 1,9-2,0; аспарагин 0,9-1,0; глицерин 10,0-11,0 мл; глюкоза 2,9-3,0; сернокислое железо 0,04-0,05.

Среду готовят путем растворения предварительно смешанных компонентов в дистиллированной воде с последующей нейтрализацией 10% едким натрием до рН 7,2-7,3 перед автоклавированием.

Использование вышеуказанной синтетической питательной среды позволяет проводить выращивание кишечной палочки в стандартных 2-х литровых биобутылях с объемом среды 49-50% до конечной концентрации 15-16 млрд. микробных тел в 1 мл.

Контрольное пятикратное выращивание кишечной палочки на известной синтетической среде для выращивания синегнойной палочки во всех случаях обеспечивало на 2-3 млрд. меньшую концентрацию микроорганизмов. Предлагаемая среда может быть использована для получения колибактериозного анатоксина.

В качестве ближайшего аналога изобретения, касающегося получения колибактериозного анатоксина использовали известный способ получения анатоксина синегнойной палочки (RU 2002101629 А1, 20.08.2003), включающий выращивание микробов на жидкой питательной среде, стерилизацию биомассы, детоксикацию формалином, отделение полученной биомассы фильтрацией, сорбцию на геле гидрата окиси алюминия.

Отличается заявленный способ от известного тем, что выращивают кишечную палочку на жидкой питательной среде, содержащей: лимонную кислоту 4,9-5,0 г; хлористый натрий - 0,9-1,0; сернокислый магний - 1,9-2,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 1,9-2,0; сернокислое железо - 0,04-0,05; аспарагин 0,9-1,0, глюкозу 2,9-3,0; глицерин 10,0-11,0, дистиллированную воду 1,0 литр; детоксикацию проводят 0,6% формалином при температуре 49-50°С в течение 8-9 дней, исключая при этом процесс автоклавирования. Такие условия позволяют убить биомассу кишечной палочки, способствуют увеличению выхода токсина в культуральную жидкость, тем самым повышают ее биологическую активность и иммуногенные свойства конечного вакцинного препарата. После проведения детоксикации фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости, а последнюю используют в качестве анатоксина кишечной палочки.

Пример осуществления способа. Для получения колибактериозного анатоксина использовали свежевыделенные культуры кишечной палочки двух серотипов О₁₄₁ и О₁₄₉, выращенные на МПБ. Пересев маточных культур кишечной палочки провели в 2-х литровые биобутыли с объемом 50% синтетической среды: лимонная кислота - 5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 2,0; хлористый натрий - 1,0; сернокислый магний - 2,0; аспарагин - 1,0; глицерин - 10,0; глюкоза - 3,0; сернокислое железо - 0,05.

Плотность посева маточной культуры составила 90-100 млн. микробных тел на 1 мл среды. Выращивание кишечной палочки провели при 37-38°С в течение 24 часов. По окончании выращивания максимальная концентрация микробных тел в 1 мл составила 15-16 млрд. При этом разницы в интенсивности роста и накопления биомассы обеих культур не наблюдалось.

В дальнейшем в биобутыли добавили формалин с таким расчетом, чтобы его концентрация была на уровне 0,6%. Обезвреживание микроорганизмов провели при температуре 50°С в течение 7 дней. Фильтрацией отделили биомассу от культуральной жидкости. В культуральную жидкость добавили гель гидрата окиси алюминия из расчета 3 мг/мл, тщательно перемешали. Затем рН довели 10% едким натрием до 7,0. Препарат расфасовали в стерильные флаконы. Полученный анатоксин кишечной палочки провели на стерильность, безвредность, протективную активность.

При контрольных высевах анатоксина на мясопептонный агар (МПА), МПБ и МПБ под вазелиновое масло рост микрофлоры отсутствовал, что свидетельствовало о стерильности препарата.

При внутрибрюшинном введении анатоксина в дозе 0,5 мл белым мышам массой 20-22 г, состояния угнетения или их гибели в течение 10 дней не отмечали.

Испытание протективных свойств анатоксина кишечной палочки провели на белых мышах. Порядок применения анатоксина предусматривал двукратную с интервалом в 7 дней, в дозе 0,3+0,3 мл, подкожную иммунизацию белых мышей со средней массой 20-22 г. Для иммунизации применили в первых группах моноанатоксин, а в 3-й - ассоциированный анатоксин. Заражение опытных мышей провели спустя 7 дней после последнего введения анатоксина. Для заражения использовали моно- и гетерологичные культуры кишечной палочки в дозе 2 LD₅₀ . Результаты испытания анатоксина кишечной палочки отражены в таблице 1.

Таблица 1 Протективная эффективность анатоксина кишечной палочки при испытании на белых мышах (п=9).
№ п/п	Вид препарата	Защитный эффект при заражении 3 LD50 культурой E.coli в %
		O141		O142				O8
		Выжило	Пало	Выжило		Пало		Выжило	Пало
1.	Анатоксин E.coli серогруппы O141 в дозе 0,3 мл + 0,3 мл	77,7	22,2	55,5		44,4		55,5	44,4
2.	Анатоксин E.coli серогруппы O 142	66,6	33,3	77,7		22,2		66,6	33,3
3.	Анатоксин E.coli серогрупп O141, O142 в соотношении 1:1	77,7	22,2		77,7	22,2	77,7		22,2
4.	Контроль	0	9		0	9	0		9

Результаты испытания показали, что опытные серии анатоксинов имеют необходимое количество протективного антигена, обеспечивающего требуемый к вакцинным препаратам уровень иммунитета при заражении культурами кишечных палочек независимо от их серогрупповой принадлежности.