замещенные производные n-бензилиндол-3-ил-глиоксиловой кислоты, обладающие противоопухолевым действием (варианты), их кислотно-аддитивные соли (варианты), фармацевтический препарат, фармацевтическая форма

Формула изобретения

1. Замещенные производные N-бензилиндол-3-ил-глиоксиловой кислоты противоопухолевого действия общей формулы 1

где группы R, R₁, R₂, R₃ , R₄ и Z имеют следующие значения:

R означает нитро, амино, (С₁-С₆)ациламино, ароиламино, никотиноил или изоникотиноил, арилсульфониламино или сукцинимидо, причем остаток R по выбору может быть замещен C₁-С ₆алкильной группой по атому углерода в положении 2, 3 и 4 фенильного кольца;

R₁ означает водород или (С₁-С₆)алкил, который может быть замещен по меньшей мере одной фенильной группой;

R₂ означает пиридил;

R₃ и R₄ означают атомы водорода;

Z означает О или S.

2. Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты.

3. Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-нитробензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты.

4. Кислотно-аддитивные соли соединений по любому из пп.1-3, выбранные из группы, включающей в себя соли с неорганическими кислотами, в частности, соляной кислотой, серной кислотой или фосфорной кислотой.

5. Фармацевтический препарат противоопухолевого действия, отличающийся тем, что он содержит по крайней мере одно соединение по любому из пп.1-3 или его соль по п.4 и, при необходимости, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, и/или разбавитель, или вспомогательное вещество.

6. Фармацевтическая форма противоопухолевого действия, отличающаяся тем, что она содержит по крайней мере одно соединение по любому из пп.1-3 или его соль по п.4 и изготовлена в форме таблеток, драже, капсул, растворов для вливания или ампул, суппозиториев, пластырей, порошкообразных препаратов для ингаляций, суспензий, кремов и мазей.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицинской химии и, в частности, касается замещенных производных N-бензилиндол-3-ил-глиоксиловой кислоты, обладающих противоопухолевым действием, и их применения для получения лекарственного средства для лечения опухолевых заболеваний.

Уровень техники

Индол-3-глиоксиламид находит разнообразное применение в фармацевтической химии в качестве фармакодинамически активного соединения и в качестве исходного соединения в химическом синтезе.

В заявке на выдачу патента Нидерландов 6502481 описаны соединения, которые обладают противовоспалительным, жаропонижающим и аналгезирующим действием.

В заявке GB-PS 1028812 упоминается производное индолил-3-глиоксиловой кислоты и ее амида в качестве соединения, обладающего аналгезирующим, противосудорожным и -адренергическим действием.

G.Domschke и соавт. (Ber. (1961), т.94, с.2353) описывают амид 3-индолилглиоксиловой кислоты, не приводя его фармакологических свойств.

Е. Walton в J. Med. Chem. (1968), т.11, с.1252 описывает производное индолил-3-глиоксиловой кислоты, которое действует как ингибитор на глицерофосфат-дегидрогеназу и лактат-дегидрогеназу.

В заявке на выдачу европейского патента ЕР 675110 описан 1Н-индол-3-глиоксиламид, который является эффективным ингибитором sPLA2 и находит применение при лечении септического шока, панкреатита, при лечении аллергического ринита и ревматоидного артрита.

Кроме того, в заявке на выдачу патента Германии с регистрационным номером 19814838.0 уже предлагалось использовать в качестве противоопухолевого средства соединение, описанное в патенте DE-OS 19636150 А1.

Сущность изобретения

Объектами настоящего изобретения являются новые соединения из ряда индол-3-ил-глиоксиловой кислоты общей формулы 1, которые обладают сильным противоопухолевым действием и могут быть использованы для получения противоопухолевых лекарственных средств,

где группы R, R₁, R₂, R₃ , R₄ и Z имеют следующие значения:

R означает нитро, амино, (С₁-С₆)ациламино, ароиламино, гетероароиламино, в котором гетероатом представлен атомом азота, арилсульфониламино или фталимидо, причем остаток R по выбору может быть замещен С₁-С₆алкильной группой по атому углерода в положении 2, 3 и 4 фенильного кольца;

R₁ означает водород или (С₁-С₆ )алкил, который может быть замещен по меньшей мере одной фенильной группой;

R₂ означает азотсодержащую гетероарильную группу;

R₃ и R₄ означают атомы водорода;

Z означает атом О или S.

Изобретение также относится к кислотно-аддитивным солям соединений общей формулы 1, выбранным из группы, включающей соли с неорганическими кислотами, в частности соляной кислотой, серной кислотой или фосфорной кислотой.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлен график, иллюстрирующий результаты определения поглощательности клеток. Посредством активности митохондриальных дегидрогеназ ХТТ метаболизируется в водорастворимую соль формазана, что соответствует максимуму поглощения при длине волны 490 нм, как видно из данного графика.

На Фиг.2 представлена временная шкала, иллюстрирующая проведение этапов метода исследования клеточной пролиферации с использованием ХТТ.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы 1

где группы R, R₁, R₂, R₃ , R₄ и Z имеют следующие значения:

R означает нитро, амино, моно- или ди(С₁-С₆)алкиламино, моно- или ди-(С₁-С₆)циклоалкиламино, (С ₁-С₆)ациламино, фенил(С₁-С ₆)алкиламино, ароиламино, гетероароиламино, (С₁ -С₆)алкилсульфонамидо, арилсульфонамидо, малеинимидо, сукцинимидо, фталимидо, бензилоксикарбониламино (Z-амино), трет-бутоксикарбониламино (Вос-амино), 9-флуоренилметоксикарбониламино (Fmoc-амино), трифенилметиламино(Tr-амино), 2-(4'-пиридил)этоксикарбониламино(Руос-амино), дифенилметилсилиламино (DPMS-амино), причем остаток R по выбору может быть замещен по атому углерода в положении 2, 3 и 4 фенильного кольца,

R, кроме того, если R₁ означает водород, метил или фенилметил, а также представляет собой бензилоксикарбонил (Z), трет-бутоксикарбонил (Boc) и ацетилгруппу, может означать -NH-СН ₂-СООН, -NH-СН(СН₃)-СООН, (СН₃ )₂СН-СН₂-СН₂-СН(NH)-СООН, Н ₃С-СН₂-СН(СН₃)-СН(NH)-СООН, HOH ₂C-CH(NH)-СООН, фенил-СН₂-СН(NH)-СООН, (4-имидазолил)-CH ₂-CH(NH)-COOH, HN=C(NH₂)-NH-(CH₂ )₃-CH(NH)-COOH, H₂N-(CH₂) ₄-CH(NH)-COOH, H₂N-CO-CH₂-CH(NH)-COOH, HOOC-(CH₂)₂-CH(NH)-COOH,

R₁ означает водород, (С₁-С₆)алкил, причем алкильная группа может быть замещена по меньшей мере одной фенильной группой, причем фенильная группа, в свою очередь, может содержать по меньшей мере один заместитель, выбранный из следующего ряда: галоген, (С₁-С₆)алкил, (С₃-С ₇)циклоалкил, карбоксигруппой, карбоксигруппой, этерифицированной C₁-C₆-алканолами, трифторметильной группой, гидроксигруппой, метоксигруппой, этоксигруппой, бензилоксигруппой, а также бензильной группой, которая также может содержать в фенильном кольце по меньшей мере один заместитель, выбранный из следующего ряда: (С₁-С₆)алкил, атом галогена или трифторметил,

R₁, кроме того, может означать бензилоксикарбонил (Z), трет-бутоксикарбонил (Boc) и ацетильную группу,

R ₂ может означать фенильную группу, содержащую по меньшей мере один заместитель, выбранный из ряда: (С₁-С ₆)алкил, (С₁-С₆)алкокси, циано, галоген, трифторметил, гидрокси, бензилокси, нитро, амино, (С₁ -С₆)алкиламино, (С₁-С₆)алкоксикарбониламино, а также карбоксильная группа, этерифицированная (С₁ -С₆)алканолами карбоксильная группа, или означать остаток пиридина формулы 2

или его N-оксид, причем остаток пиридина по выбору может быть связан через атомы углерода в положении 2, 3 и 4, и может быть замещен группами R₅ и R₆,

R ₅ и R₆ могут быть одинаковыми или различными и могут означать (С₁-С₆)алкил, а также (С₃-С₇)циклоалкил, (С₁-С ₆)алкокси, нитро, амино, гидрокси, галоген и трифторметил и, кроме того, представлять собой остаток этоксикарбониламино, а также группу карбоксиалкокси, в которой алкил может содержать от 1 до 4 атомов углерода,

R₂, кроме того, может означать гетероциклическую группу 2- или 4-пиримидинил, причем 2-пиримидинильное кольцо может содержать по меньшей мере одну метильную группу в качестве заместителя и, кроме того, может означать 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- и 8-хинолильный остаток, замещенный следующими группами: (С₁-С₆)алкил, галоген, нитро, амино, а также может означать 2-, 3- и 4-хинолилметильную группу, причем атомы углерода в пиридилметильном остатке хинолилгруппы и хинолилметильном остатке могут быть замещены следующими группами: (С₁-С₆)алкил, (С₁-С₆ )алкокси, нитро, амино и (С₁-С₆)алкоксикарбониламино,

R₂, кроме того, если R₁ означает водород, метил- или бензилгруппу, а также представляет собой бензилоксикарбонил (Z), трет-бутоксикарбонил (Boc) и ацетилгруппу, может означать следующие группы: -СН₂СООН, -СН(СН ₃)-СООН, (СН₃)₂СН-(СН₂ )₂-СН(СООН)-, Н₃С-СН₂-СН(СН ₃)-СН(СООН)-, НОН₂С-СН(СООН)-, фенил-СН ₂-СН(СООН)-, (4-имидазолил)-СН₂-СН(СООН)-, HN=C(NH ₂)-NH-(CH₂)₃-CH(COOH)-, H ₂N-(CH₂)₄-CH(COOH)-, H₂ N-CO-CH₂-CH(COOH)-, НООС-(СН₂)₂ -СН(СООН)-,

R₂, кроме того, если R₁ означает водород, Z-группу, Вос-группу, ацетил- или бензилгруппу, может представлять собой остаток природной или неприродной аминокислоты, например, -глицил, -саркозил, -аланил, -лейцил, -изолейцил, -серил, -фенилаланил, -гистидил, -пролил, -аргинил, -лизил, -аспарагил и -глутамил, причем аминогруппы в каждой из аминокислот могут быть незащищенными или защищенными. В качестве аминозащитных групп используют карбобезокси-(Z) и трет-бутилоксикарбонильные (Boc), а также ацетильные группы. В случае остатков аспарагил- и глутамил-, заявленных для группы R₂, вторая (боковая) карбоксильная группа может присутствовать в виде свободной карбоксильной группы, или в виде сложного эфира с (С₁-C₆)алканолами, например, в виде метилового, этилового, соответственно, трет-бутилового эфира. Кроме того, R₂ может означать аллиламинокарбонил-2-метилпроп-1-ил-группу. Кроме того, R₁ и R₂ могут быть объединены с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием пиперазинового кольца формулы 3 или гомопиперазинового кольца, поскольку R ₂ представляет собой аминоалкиленовую группу, в которой

алкильный остаток R₇ означает фенильный цикл, который может содержать по меньшей мере один заместитель, выбранный из ряда: (С₁-С₆)алкил, (С₁-С ₆)алкокси, галоген, нитрогруппа, амино- и (С₁ -С₆)алкиламиногруппа;

кроме того, R ₇ означает бензгидрильную группу и бис-п-фторбензгидрильную группу;

R₃ и R₄ могут быть одинаковыми или различными и означают водород, (С₁-С₆ )алкил, (С₃-С₇)циклоалкил, (С₁ -С₆)алканоил, (С₁-С₆)алкокси, галоген и бензилокси;

R₃ и R₄, кроме того, могут означать нитрогруппу, аминогруппу, (С₁ -С₄)моно- или диалкилзамещенную аминогруппу, (С ₁-С₆)алкоксикарбониламино- или (С₁ -С₆)алкоксикарбониламино-(С₁-С₆ )алкильную группу.

Z означает О или S.

Термины "алкил-", "алканоил-", "алкокси-" или алкиламиногруппа" для остатков R, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ означают алкильную группу с прямой, а также разветвленной цепью, причем алкильная группа с прямой цепью может означать, например, такой остаток, как метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, а алкильная группа с разветвленной цепью означает такой остаток, как, например, изопропил или трет-бутил. Термин "циклоалкил" означает, например, такой остаток, как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. Термин "галоген" означает фтор, хлор, бром или иод. Термин "алкоксигруппа" означает такой остаток, как, например, метокси, этокси, пропокси, бутокси, изопропокси, изобутокси или пентокси. Термин "ацил" в остатке ациламино означает группы формил, ацетил, пропионил, бутирил, валерил и изовалерил. Термин "ароил" в ароиламиногруппе означает бензоил, нафтоил, толуоил, фталоил, а группа гетероароил в остатке гетероароиламино означает никотиноил, изоникотиноил, теноил и фуроил. Термин "арил" в арилсульфонамидогруппе означает фенил, толил и нафтил.

Соединения по изобретению могут быть также использованы в форме кислотно-аддитивных солей, например солей неорганических кислот, таких, как соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, солей органических кислот, таких, как уксусная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, глюкуроновая кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, эмбоновая кислота, метансульфоновая кислота, трифторуксусная кислота, янтарная кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, никотиновая кислота и п-толуолсульфокислота.

Соединения формулы 1, а также их соли обладают биологической активностью. Соединения формулы 1 можно вводить в свободной форме или в форме солей с физиологически переносимыми кислотами.

Введение можно осуществлять пероральным, парентеральным, внутривенным, чрескожным способами или ингаляцией.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по крайней мере одно соединение формулы 1 или его соль с физиологически переносимыми неорганическими или органическими кислотами и при необходимости фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители или вспомогательные вещества.

В качестве готовых форм для введения пригодны, например, таблетки, драже, капсулы, растворы для вливания или ампулы, суппозитории, пластырь, порошкообразные композиции для ингаляции, суспензии, кремы и мази.

Способы получения соединений по изобретению приведены на следующих схемах синтеза 1 и 2 (стадии 1-3), а также в общем описании заявки. Все соединения могут быть получены по описанным методикам или аналогичными способами. Соединения общей формулы 1, где Z означает О, R означает NO₂ и NH₂, и R₂ означает арил, аралкил и гетероарил, могут быть получены по схеме синтеза 1.

Синтез 1

Стадия 1

Производное индола, которое может быть незамещенным или содержать по меньшей мере один заместитель по С-2 в фенильном кольце, растворяют в протонном, диполярном апротонном или неполярном органическом растворителе, например, таком как изопропанол, тетрагидрофуран, диметилсульфоксид, диметилформамид, диметилацетамид, N-метилпирролидон, диоксан, толуол или хлористый метилен, и добавляют по каплям в трехгорлую колбу в атмосфере азота к предварительно приготовленной суспензии эквимолярного или избыточного количества основания, например, такого как гидрид натрия, порошкообразный гидроксид калия, трет-бутилат калия, диметиламинопиридин или амид натрия, в пригодном растворителе. Затем добавляют, например, необходимый алкил-, аралкил- или гетероаралкилгалогенид, при необходимости в присутствии катализатора, например, меди, и после взаимодействия в течение некоторого времени, например, в течение от 30 мин до 12 ч, поддерживают температуру в диапазоне от 0°С до 120°С, предпочтительно в диапазоне от 30°С до 80°С, в особенности, в диапазоне от 50°С до 65°С. После завершения реакции реакционную смесь выливают в воду, полученный раствор экстрагируют, например, диэтиловым эфиром, дихлорметаном, хлороформом, метилтретбутиловым эфиром или тетрагидрофураном, и полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия. Органическую фазу концентрируют в вакууме, полученный остаток кристаллизуют при растирании или остаток в виде масла очищают перекристаллизацией, дистилляцией или хроматографией на колонке или экспресс-хроматографией на силикагеле или оксиде алюминия. В качестве элюента используют, например, смесь дихлорметана и диэтилового эфира в соотношении 8:2 (об./об.) или смесь дихлорметана и этанола в соотношении 9:1 (об./об.).

Стадия 2

N-замещенный индол, полученный, как описано выше, на стадии 1, в атмосфере азота растворяют в апротонном или неполярном органическом растворителе, например, таком как диэтиловый эфир, метилтретбутиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, толуол, ксилол, хлористый метилен или хлороформ, и добавляют к предварительно приготовленному в атмосфере азота раствору эквимолярного или избыточного (60%-ный избыток) количества оксалилхлорида в апротонном или неполярном органическом растворителе, например, таком как диэтиловый эфир, метилтретбутиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, толуол, ксилол, хлористый метилен, при температуре в диапазоне от -5°С до 20°С. Затем реакционную смесь нагревают до температуры в диапазоне от 10°С до 130°С, предпочтительно в диапазоне от 20°С до 80°С, особенно, в диапазоне от 30°С до 50°С, в течение интервала времени от 30 мин до 5 ч. Растворитель упаривают, остаток полученного "хлорангидрида индолил-3-глиоксиловой кислоты" растворяют в апротонном растворителе, таком кактетрагидрофуран, диоксан, диэтиловый эфир, толуол или также в диполярном апротонном растворителе, например, в диметилформамиде, диметилацетамиде или диметилсульфоксиде, охлаждают до температуры в диапазоне от 10°С до -15°С, предпочтительно от -5°С до 0°С, и в присутствии акцептора кислоты смешивают с раствором первичного или вторичного амина в разбавителе. В качестве разбавителя применяют вышеупомянутые растворители, использованные для растворения "хлорангидридов индолил-3-глиоксиловой кислоты". В качестве акцепторов кислот используют триэтиламин, пиридин, диметиламинопиридин, основный ионообменник, карбонат натрия, карбонат калия, порошкообразный гидроксид калия, а также избыточный, использованный в качестве исходного соединения в реакции, первичный или вторичный амин. Реакцию проводят при температуре от 0°С до 120°С, предпочтительно от 20° до 80°С, в особенности, от 40°С до 60°С. После проведения реакции в течение 1-3 ч и выдерживания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 24 ч гидрохлорид акцептора кислоты отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме и остаток перекристаллизовывают в органическом растворителе или очищают колоночной хроматографией на кизельгеле или оксиде алюминия. В качестве элюента используют, например, смесь дихлорметана и этанола (95:5 об./об.).

Стадия 3

Полученный по описанной выше методике (стадия 2) N-нитробензилзамещенный "амид индолилглиоксиловой кислоты" растворяют в протонном растворителе, таком как, например, метанол, этанол, пропанол, изопропанол или бутанол, или в неполярном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, диоксан, или диметиловый эфир гликоля или в диполярном апротонном растворителе, таком как, например, диметилсульфоксид, диметилформамид, диметилацетамид или N-метилпирролидон, и раствор перемешивают в атмосфере азота в присутствии катализатора гидрирования, такого как, например, никель Ренея, палладий на угле или платина. В суспензию вводят умеренный ток водорода при давлении 100-1500 кПа (1-15 бар), предпочтительно 200-1000 кПа (2-10 бар), прежде всего, 400-600 кПа (4-6 бар) и температуру повышают приблизительно до 20°-80°С, предпочтительно 30°-60°С, особенно до 45°-55°С. При необходимости через 1 ч добавляют еще одну порцию катализатора и гидрирование продолжают. Через 4-10 ч гидрированиезавершают, катализатор отфильтровывают в атмосфере азота, растворитель удаляют в вакууме досуха и остаток от бесцветного до желтоватого цвета сушат в вакууме при 40°С.

Примеры получения соединений

Согласно общей методике (стадии 1-3), в основе которой использована схема синтеза 1, синтезируют следующие соединения, которые кратко представлены ниже в соответствии с современной химической номенклатурой.

Пример 1

Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-68838)

Стадия 1 1-(4-Нитробензил)индол

Смесь 5,28 г гидрида натрия (0,22 моль, суспензия в минеральном масле) в 200 мл диметилсульфоксида добавляют к раствору 23,4 г (0,2 моль) индола в 100 мл диметилсульфоксида. Смесь нагревают в течение 1 ч при 65°С, охлаждают и по каплям добавляют 37,7 г (0,22 моль) 4-нитробензилхлорида. Раствор нагревают до 60°С, выдерживают при комнатной температуре в течение 14 ч и при перемешивании выливают в 700 мл воды. Экстрагируют порциями хлористым метиленом (общее количество 300 мл), органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток очищают на колонке с кизельгелем (Кизельгель 60 производства фирмы Merck AG, Darmstadt, элюент хлористый метилен/этанол 9:1, об./об.).

Выход: 43,9 г (87% от теор.); МС: m/е 253 (М+Н)

Стадия 2 Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-нитробензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-68836)

Раствор 4,50 мл оксалилхлорида в 50 мл эфира при 0°С и в атмосфере азота по каплям добавляют к раствору 10,09 г (0,04 моль) 1-(4-нитробензил)индола в 50 мл эфира. Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 2 ч и затем растворитель упаривают. К остатку добавляют 100 мл тетрагидрофурана, охлаждают до -5°С и по каплям добавляют раствор 9,32 г (0,099 моль) 4-аминопиридина в 400 мл тетрагидрофурана. Нагревают с обратным холодильником в течение 3 ч и выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. Гидрохлорид 4-аминопиридина отсасывают, осадок промывают тетрагидрофураном, фильтрат концентрируют в вакууме и остаток перекристаллизовывают из этилацетата.

Выход: 13,5 г (84% от теор.); МС: m/е 401 (М+Н)

Стадия 3 Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-68838)

Смесь 200 мг никеля Ренея в 50 мл диоксана добавляют к суспензии 320 мг (0,8 ммоль) амида N-(пиридин-4-ил)[1-(4-нитробензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты в смеси растворителей, содержащей 150 мл диоксана и 20 мл изопропанола. В эту суспензию вводят интенсивный ток водорода при давлении 500 кПа (5 бар) и нагревают при 30-35°С. Через 3 ч добавляют еще 400 мг никеля Ренея и проводят гидрирование в интенсивном токе водорода в течение еще 8 ч при 35°С и 500 кПа (5 бар). Катализатор отфильтровывают в токе азота, фильтрат концентрируют в вакууме досуха и остаток сушат в вакууме при 40°С.

Выход: 273 мг (92% от теор.); МС: m/е 371 (М+Н).

Кроме того, соединения общей формулы 1, где Z означает О, R означает NO₂ и NH₂, a R₂ означает арил, аралкил, гетероарил, гетероаралкил и аллиламинокарбонил-2-метилпроп-1-ил-группу, синтезируют согласносхеме 2 синтеза:

Синтез 2

Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты

Стадия 1

Амид N-(Пиридин-4-ил)(индол-3-ил)глиоксиловой кислоты

К раствору 9 мл оксалилхлорида в 100 мл безводного эфира по каплям при 0°С добавляют раствор 10 г (85,3 ммоль) индола в 100 мл эфира. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем по каплям при -5°С добавляют суспензию 12 г (127,9 ммоль) 4-аминопиридина в 500 мл тетрагидрофурана, реакционную смесь нагревают с обратным холодильником при перемешивании в течение 3 ч и выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь фильтруют, осадок обрабатывают водой и высушенное соединение очищают на колонке с кизельгелем (Кизельгель 60 производства фирмы Merck AG, Darmstadt) с использованием в качестве элюента смеси хлористый метилен/этанол 10:1, об./об.).

Выход: 9,8 г (43,3% от теор.)

МС: m/е 266 (М+Н).

Стадия 2

Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-нитробензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-68836)

Полученный на стадии 1 (схема 2) амид N-(пиридин-4-ил)индол-3-ил))глиоксиловой кислоты обрабатывают 4-нитробензилхлоридом согласно методике "бензилирования" и выделяют полученный амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-нитробензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты.

Выход: 64% от теор.

МС: m/е 401 (М+Н).

Стадия 3

Амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-68838)

Полученный на стадии 2 (схема 2) амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-нитробензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты гидрируют в присутствии катализатора согласно методике "гидрирования" и выделяют полученный амид N-(пиридин-4-ил)[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты.

Выход: 94% от теор.

МС: m/е 371 (М+Н).

Основная методика получения соединений общей Формулы 1 согласно схеме синтеза 2

Стадия 1

К полученному в атмосфере азота раствору оксалилхлорида с концентрацией от 1 М до 60%-ного избытка в апротонном или неполярном растворителе, таком как, например, диэтиловый эфир, метилтретбутиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан или дихлорметан, при температуре от -5°С до +5°С по каплям добавляют растворенное в растворителе, таком как, например, использованный для вышеупомянутого оксалилхлорида, производное индола, которое может быть незамещенным или содержать заместитель в положении С-2 фенильного кольца. Затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение от 1 до 5 ч при температуре от 10°С до 120°С, предпочтительно от 20°С до 80°С, особенно, от 30°С до 60°С. В завершение растворитель упаривают и остаток, хлорангидрид(индол-3-ил)глиоксиловой кислоты, растворяют или суспендируют в апротонном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, диоксан, диэтиловый эфир, толуол или также в диполярном апротонном растворителе, таком как, например, диметилформамид, диметилацетамид или диметилсульфоксид, охлаждают до температуры в диапазоне от -10°С до +10°С, предпочтительно от -5°С до 0°С, и обрабатывают в присутствии акцептора кислот в растворе первичного или вторичного амина в разбавителе. В качестве разбавителя применяют растворитель, использованный для растворения "хлорангидридов индолил-3-глиоксиловой кислоты". В качестве акцептора кислот используют триэтиламин, пиридин, диметиламинопиридин, основный ионообменник, карбонат натрия, карбонат калия, порошкообразный гидроксид калия, а также избыточный, использованный в качестве исходного соединения в реакции, первичный или вторичный амин. Реакцию проводят при температуре от 0°С до 120°С, предпочтительно от 20° до 80°С, в особенности, от 40°С до 60°С. После проведения реакции в течение 1-4 ч и выдерживания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 24 ч, ее фильтруют, осадок выдерживают в воде, воду отсасывают и остаток сушат в вакууме. Требуемое соединение очищают перекристаллизацией в органическом растворителе или колоночной хроматографией на кизельгеле или оксиде алюминия. В качестве элюента используют, например, смесь дихлорметана и этанола (10:1 об./об.).

Стадия 2

Полученный по описанной выше методике на стадии 1 "амид индол-3-ил-глиоксиловой кислоты" растворяют в протонном, диполярном апротонном или неполярном органическом расворителе, таком как, например, изопропанол, тетрагидрофуран, диметилсульфоксид, диметилформамид, диметилацетамид, N-метилпирролидон, диоксан, толуол или хлористый метилен, и по каплям добавляют к приготовленной в трехгорлой колбе в атмосфере азота молярной или использованной в избытке суспензии основания, такого как, например, гидрид натрия, порошкообразный гидроксид калия, третбутилат калия, диметиламинопиридин или амид натрия, в подходящем растворителе. Затем добавляют необходимый алкил-, аралкил- или гетероаралкилгалогенид либо в неразбавленном виде, либо в разбавителе, например, использованном для растворения "амида индол-3-ил-глиоксиловой кислоты", при необходимости в присутствии катализатора, например меди, и реакцию проводят в течение периода времени, например, от 30 мин до 12 ч и при температуре в диапазоне от 0°С до 120°С, предпочтительно от 30°С до 80°С, в особенности, от 50°С до 70°С. После завершения реакции реакционную смесь переносят в воду, раствор экстрагируют, например, диэтиловым эфиром, дихлорметаном, хлороформом, метилтретбутиловым эфиром, тетрагидрофураном или н-бутанолом, и полученную таким образом органическую фазу сушат безводным сульфатом натрия. Органическую фазу концентрируют в вакууме, кристаллизуют полученный остаток путем растирания или очищают масляный остаток путем дистилляции или колоночной, или экспресс-хроматографией на кизельгеле или оксиде алюминия. В качестве элюента используют, например, смесь хлористого метилена и диэтилового эфира в соотношении 8:2 (об./об.) или смесь хлористого метилена и этанола в соотношении 9:1 (об./об.).

Стадия 3

Полученный по описанной выше методике (стадия 2) N-нитробензилзамещенный "амид индолилглиоксиловой кислоты" растворяют в протонном растворителе, таком как, например, метанол, этанол, пропанол или бутанол, или в неполярном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран, диоксан, или диметиловый эфир гликоля или в диполярном апротонном растворителе, таком как, например, диметилсульфоксид, диметилформамид, диметилацетамид или N-метилпирролидон, и раствор перемешивают в атмосфере азота в присутствии катализатора гидрирования, такого как, например, никель Ренея, палладий на угле или платина. В суспензию вводят умеренный ток водорода при давлении 100-1500 кПа (1-15 бар), предпочтительно 200-1000 кПа (2-10 бар), особенно, 400-600 кПа (4-6 бар) и температуру повышают приблизительно до 20°-80°С, предпочтительно 30°-60°С, особенно, до 45°-55°С. При необходимости через 1 ч добавляют еще одну порцию катализатора и гидрирование продолжают. Через 4-6 ч гидрирование завершается и катализатор отфильтровывают в атмосфере азота, растворитель удаляют в вакууме досуха и остаток от бесцветного до желтоватого цвета сушат в вакууме при 40°С.

Соединения D-68836 и D-68838 синтезируют по общей методике с использованием стадий 1-3, в основе которых лежит схема синтеза 2, причем эти соединения получают также по схеме синтеза 1.

Пример 2

Амид N-(пиридин-4-ил)-[1-(4-ацетиламино-бензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-80793).

К раствору, содержащему 1 г (2,70 ммоль) амида N-(пиридин-4-ил)-[1-(4-аминобензил)индол-3-ил] глиоксиловой кислоты и 0,27 г (2,70 ммоль) триэтиламина в 30 мл диметилформамида, по каплям добавляют при 0°С раствор 0,21 г (2,70 ммоль) ацетилхлорида в 10 мл диметилформамида. Смесь затем перемешивают при 0°С в течение 2-х часов, затем выливают в 100 мл ледяной воды при перемешивании. Желтый осадок отфильтровывают путем отсасывания и очищают экспресс-хроматографией на колонке с силикагелем (элюент: хлористый метилен/метанол/аммиак (25%) 90:10:1 (об./об.)).

Выход: 0,82 г (73,9% от теор.); Т.п.:>280°С; МС: m/е 253 (М+Н).

Пример 3

Амид N-(пиридин-4-ил)-[1-(4-бензоиламино-бензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-69938)

К раствору, содержащему 1,5 г (4,05 ммоль) амида N-(пиридин-4-ил)-[1-(4-аминобензил)индол-3-ил] глиоксиловой кислоты и 0,41 г (4,05 ммоль) триэтиламина в 25 мл диметилформамида, по каплям добавляют при 0°С в атмосфере азота раствор, содержащий 0,57 г (4,05 ммоль) бензоилхлорида в 8 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при 25°С в течение 30-и часов и нагревают при 40°С в течение 3-х часов. Небольшое количество желтого осадка отфильтровывают путем отсасывания и фильтрат затем выливают в 100 мл ледяной воды при перемешивании. Осадок отфильтровывают, отмывают водой и высушивают в вакууме при 40°С. Соединение кристаллизуют в смеси диметилформамида и изопропанола.

Выход: 1,58 г (82,3% от теор.); Т.п.: 212-214°С; МС: m/е 475 (М+Н).

Пример 4

Амид N-бензил-N-(пиридин-4-ил)-[1-(4-аминобензил)индол-3-ил]глиоксиловой кислоты (D-69937)

Смесь 0,11 г (2,70 ммоль, суспензия в минеральном масле) гидрида натрия в 20 мл диметилформамида обрабатывают в атмосфере азота при 0°С раствором, содержащим 1 г (2,70 ммоль) амида N-(пиридин-4-ил)-[1-(4-аминобензил)индол-3-ил] глиоксиловой кислоты. Температуру поддерживают на уровне 3-5°С в течение 30 мин. Затем добавляют по каплям раствор 0,34 г (2,70 ммоль) бензилхлорида в 10 мл диметилформамида. Смесь нагревают при 50°С в течение 6 часов, затем выливают в 100 мл ледяной воды при перемешивании. Через 30 мин смесь экстрагируют хлористым метиленом порциями в общем количестве 200 мл. Органическую фазу высушивают над безводным сульфатом натрия, отфильтровывают, и фильтрат подвергают концентрации в вакууме. Остаток очищают на колонке с силикагелем (силикагель 60, Merck AG, Darmstadt; элюент: хлористый метилен/метанол/аммиак (25%) 90:10:1 (об./об.).

Выход: 0,98 г (78% от теор.); Т.п.: 188-189°С; МС: m/е 461.

Пример 5

2-Оксо-N-пиридин-4-ил-2-{1-[4-(толуол-4-сульфониламино)бензил]-1Н-индол-3-ил}ацетамид (D-89830)

Исходные соединения:

D-68838 (30 мг, 0,08 ммоль),

триэтиламин (9 мг, 0,09 ммоль),

тозилхлорид (17 мг, 0,09 ммоль).

D-68838 (30 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 20 мл безводного диметилформамида при температуре 0°С. Затем добавляют триэтиламин (9 мг, 0,09 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 30 мин. После добавления тозилхлорида (17 мг, 0,09 ммоль) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем упаривают растворитель, а осадок растворяют в этилацетате, промывают водой и сушат над сульфатом магния. Последующее упаривание растворителя дает порошок желтого цвета, который очищают экспресс-хроматографией на силикагеле с н-гептаном/этилацетатом, получая соединение D-89830 в виде светло-желтого порошка (7,2 мг, 16,6%).

MS (ESI) m/z 525,2 (MH+). Рассч. 524,60.

¹H-ЯМР(ДМСО-d₆ ): =11,08(s, 1Н), 10,26 (bs, 1H), 8,91 (s, 1H), 8,52 (d, 1H, J=5,9 Hz), 8,28 (d, 1H, J=7,6 Hz), 7,86 (d, 2H, J=5,5 Hz), 7,55-7,62 (m, 3H), 7,24-7,35 (m, 4H), 7,17 (bs, 1H), 7,00 (bs, 1H), 5,47 (s, 2H), 2,30 (s, 3H) млн^-1.

Пример 6

N-{4-[3-(пиридин-4-иламинооксалил)индол-1-илметил]фенил}никотинамид (D-89852)

Исходные соединения:

D-68838 (30 мг, 0,08 ммоль),

гидрохлорид никотиноилхлорида (15,9 мг, 0,09 ммоль),

триэтиламин (18 мг, 0,08 ммоль).

Раствор, содержащий D-68838 (30 мг, 0,08 ммоль) в 5 мл безводного диметилформамида охлаждают на ледяной бане, затем добавляют триэтиламин (18 мг, 0,08 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при температуре 0°С, затем добавляют гидрохлорид никотиноилхлорида (15,9 мг, 0,09 ммоль) и перемешивают при температуре окружающей среды в течение ночи. После этого растворитель удаляют при пониженном давлении, а осадок растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Полученный продукт подвергают очистке колоночной экспресс-хроматографией на силикагеле (дихлорметан/МеОН) с выходом 3,5 мг (10%) соединения D-89852 в виде белого остатка.

MS (ESI) m/z 476,2 (МН+). Рассч. 475,51.

¹H-ЯМР (AMCO-d₆): =11,11 (s, 1H), 10,47 (s, 1Н), 9,08 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,75 (d, 1H, J=4,8 Hz), 8,53 (d, 2H, J=5,5 Hz), 8,31 (d, 2H, J=7,3 Hz), 8,26 (d, 1H, J=8,1 Hz), 7,87 (d, 2H, J=5,5 Hz), 7,75 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,65 (d, 1H, J=7,3 Hz), 7,56 (dd, 1H, J=4,8/z.7 Hz), 7,37 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,30-7,36 (m, 3H), 5,60 (s, 2H) млн ^-1.

Пример 7

2-{1-[4-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)бензил]-1Н-индол-3-ил}-2-оксо-N-пиридин-4-ил-ацетамид (D-89863)

Исходные соединения:

D-68838 (28 мг, 0,08 ммоль),

ангидрид янтарной кислоты (38 мг, 0,4 ммоль).

Раствор, содержащий D-68838 (28 мг, 0,08 ммоль) и ангидрид янтарной кислоты (38 мг, 0,4 ммоль) в 40 мл безводного толуола подвергают кипячению с обратным холодильником в течение 4 ч. Затем добавляют уксусный ангидрид и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч. После этого удаляют растворитель, а остаток растворяют в этилацетате, промывают 10%-ным водным раствором карбоната натрия и сушат над сульфатом магния. После удаления растворителя полученный продукт подвергают дальнейшей очистке колоночной экспресс-хроматографией на силикагеле (дихлорметан/метанол) с выходом 8,40 мг (24,6%) соединения D-89863 в виде желтого остатка.

MS (ESI) m/z 453,5 (МН+). Рассч. 452.42.

¹H-ЯМР (ДМСО-d ₆) =11,11 (s, 1Н), 9,06 (s, 1H), 8,52 (d, 2Н, J=5, Hz), 8,31 (d, 1H, J=7,3 Hz), 7,87 (d, 2H, J=5,9 Hz), 7,66 (d, 1H, J=7,3 Hz), 7,42 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,32-7,36 (m, 2H), 7,23 (d, 2H, J=8,5 Hz), 5,69 (s, 2H), 2,76 (s, 4H) млн^-1.

Пример 8

N-{4-[3-(пиридин-4-иламинооксалил)индол-1-илметил]фенил}бензамид (D-69938)

D-68838 (1,5 г, 4,05 ммоль),

бензоилхлорид (0,570 г, 4,05 ммоль),

триэтиламин (0,41 г, 4,05 ммоль)

Раствор, содержащий соединение D-68838 (1,5 г, 4,05 ммоль) в 40 мл безводного диметилформамида охлаждают на ледяной бане, с последующим добавлением триэтиламина (18 мг, 0,18 ммоль). Полученную смесь перемешивают при температуре 0°С в течение 30 мин, затем добавляют раствор бензоилхлорида (0,570 г, 4,05 ммоль) в 8 мл безводного диметилформамида. Полученную смесь перемешивают при температуре окружающей среды на протяжении ночи и дополнительно - при 40°С в течение 4 ч. Осадок отфильтровывают, полученный фильтрат добавляют к 100 мл воды и перемешивают в течение 15 мин. Неочищенный продукт накапливают фильтрацией и перекристаллизовывают из диметилформамида/2-пропанола с получением 0,45 г (23,4%) соединения D-69938 в виде желтого остатка.

MS (ESI) m/z 475,20 (МН+). Рассч. 474,52

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) =11,10(s, 1Н), 10,28 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,52 (d, 2H, J=5,8 Hz), 8,29-8,33 (m, 1H), 7,92 (d, 2H, J=7,8 Hz), 7,87 (d, 2H, J=5,8 Hz), 7,75 (d, 2H, J=8,3 Hz), 7,64-7,67 (m, 1H), 7,59 (t, 1H, J=7,4 Hz), 7,52 (t, 2H, J=7,6 Hz), 7,31-7,38 (m, 4H), 5,59 (s, 2H) млн ^-1.

Пример 9

Гидрохлорид N-{4-[3-(пиридин-4-иламинооксалил)индол-1-илметил]фенил}бензамида (D-89834)

Исходные соединения D-69938 (90 мг, 0,19 ммоль),

1 N хлористоводородная кислота (0,19 мл, 0,19 ммоль).

К раствору, содержащему соединение D-69938 (90 мг, 0,19 ммоль) в 20 мл раствора дихлорметана в метаноле (в соотношении 1:1), добавляют 1 N хлористоводородная кислота (0,19 мл, 0,19 ммоль). После этого смесь перемешивают в течение 30 мин и удаляют растворитель. Полученный порошок желтого цвета высушивают под вакуумом с получением 93 мг (96%) целевого соединения D-89834.

MS (ESI): не определяли, так как молекулярная масса равна ожидаемой.

¹ H-ЯМР (ДМСО-d₆) =11,80 (s, 1Н), 10,29 (s, 1Н), 9,00 (s, 1H), 8,76 (d, 2H, J=5,5 Hz), 8,25-8,34 (m, 3Н), 7,92 (d, 2H, J=7,8 Hz), 7,76 (d, 2H, J=8,6 Hz), 7,69 (d, 1H, J=7,8 Hz), 7,59 (t, 1H, J=7,2 Hz), 7,52 (t, 2H, J=7,3 Hz), 7,33-7,39 (m, 4H), 5,61 (s, 2H) млн^-1 .

Сведения, подтверждающие противоопухолевое действие соединений.

Активность данных соединений может быть определена с использованием анализа полимеризации тубулина. Прежде всего, доказано, что соединение D-68838 подавляет полимеризацию тубулина и в связи с этим проявляет дестабилизирующее действие на микротрубочки или митотическое веретено.

Автоматизированный скрининг цитотоксических агентов произведен робототехнической системой Biomek^® 2000. Проведен стандартный анализ на основе пяти опухолевых клеточных линий, а именно SKOV3 (АТСС НТВ-77, человеческая овариальная карцинома), SF-268 (NCI 503138, CNS злокачественная глиома), KB/HeLa (ATCC CCL17, человеческая цервикальная карцинома), NCl-H460 (NCl 503473, немелкоклеточный рак легкого) и RKOp27 (человеческая аденокарцинома толстой кишки).

С помощью метода на основе ХТТ определили метаболическую активность клеток, которая коррелирует с жизниспособностью клеток и их количеством [Scudiero, D.A., Shoemaker, R.H., Paull, K.D., Monks, A., Tierney, S., Nofziger, Т.Н., Currens, M.J., Seniff, D., Boyd, M.R., (1988), "Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay "for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines" (Оценка с помощью растворимого тетразолия/формазана клеточного роста и чувствительности к лекарствам в культуре с использованием человеческих и других линий опухолевых клеток), Canc. Res., 48, 4827-4833].

Исследуемые соединения растворяли в ДМСО в концентрации 1 мг/мл и добавляли к опухолевым клеткам. Метаболическую активность клеток через 48 часов определяли измерением поглощательности (ОД) при 490 нм. Посредством клеточной дегидрогеназной активности, из ХТТ, используемого в качестве субстрата, образовывалась желтая соль формазана. Начальный автоматизированный скрининг проводился в отношении всех тестируемых соединений в концентрации 3,16 мкг/мл. Те соединения, которые вызывали ингибирование пролиферации >50%, исследовались повторно для определения ИК₅₀ , и соединения с ИК₅₀<1 мкг/мл были отобраны для дальнейших исследований in vivo, т.е. определения токсичности на мышах, анализа полых волокон и/или эксперименты на ксенотрансплантатах у голых мышей. Метод на основе ХТТ был выбран, поскольку он прост, легко воспроизводим и точен, имея приемлемую пропускную способность в отношении соединений.

Таблица 3 Анализ ингибирования пролиферации опухолевых клеток с использованием ХТТ
Соединение	KB	SKOV3	SF268	NCI-H460	RKOp27
% ингибирования при конц. 3,16 мкг/мл
D-89834	45,74	82,15	66,23	73,82	68,61