способ экстракции жира морских млекопитающих, жир, полученный этим способом, пищевая добавка, включающая жир, способ экстракции белка морского млекопитающего и пищевая добавка, включающая белок

Формула изобретения

1. Способ экстракции жира, содержащего омега-3-жирные кислоты, из морского млекопитающего, включающий стадию экстракции липидов, которая включает обработку жировой ткани упомянутого морского млекопитающего холодным прессованием, причем упомянутая обработка холодным прессованием позволяет получить жир, содержащий омега-3 жирные кислоты, и уменьшает окисление полиненасыщенных жиров, а стадию экстракции липидов проводят в отсутствии органического растворителя.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутое морское млекопитающее выбирают из китовых, тюленей и моржей.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутым морским млекопитающим является тюлень.

4. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что упомянутой жировой тканью является ворвань.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что упомянутую ткань подвергают стадии измельчения.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что упомянутую стадию измельчения осуществляют одновременно с обработкой холодным прессованием.

7. Способ по любому одному из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный жир далее очищают центрофугированием и/или фильтрацией.

8. Жир морского млекопитающего, свободный от следов органического растворителя, содержащий омега-3 жирные кислоты, полученный по любому из пп.1-7.

9. Композиция пищевой добавки, включающая упомянутый жир морского млекопитающего по п.8 вместе с подходящим носителем.

10. Способ экстракции белка из нежировой ткани морского млекопитающего, включающий a) осаждение упомянутого белка с помощью, по меньшей мере, одного органического растворителя; b) выделение липидов, содержащихся в липидной фазе а), путем упаривания упомянутого, по меньшей мере, одного органического растворителя; c) выделение упомянутого белка из упомянутого преципитата, причем указанный выделенный белок является, по существу, чистым и свободен от значительных уровней тяжелых металлов или пестицидов.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что упомянутое морское млекопитающее выбирают из китовых, тюленей и моржей.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что упомянутое морское млекопитающее является тюленем.

13. Способ по любому одному из пп.10-12, отличающийся тем, что упомянутый, по меньшей мере, один растворитель выбран из ацетона, спирта, этанола и этилацетата.

14. Способ по любому одному из пп.10-13, отличающийся тем, что упомянутый органический растворитель представляет собой органический растворитель, не являющийся токсичным по отношению к животным.

15. Способ по любому одному из пп.10-14, отличающийся тем, что упомянутый выделенный белок сохраняет некоторую ферментативную активность.

16. Пищевая добавка, включающая упомянутый выделенный белок, по любому одному из пп.10-15.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу очистки жира морских млекопитающих, обогащенного омега-3 жирными кислотами, и к композициям, включающим такие жиры. Данное изобретение также относится к способу получения таких жиров из тюленей и других морских млекопитающих. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу трансформации подкожных и мышечных тканей из тюленей и других морских млекопитающих. Настоящее изобретение относится к способу получения липидных и белковых экстрактов из туш тюленей и других морских млекопитающих и к данным экстрактам. Кроме того, данное изобретение относится к фракциям, полученным по способам настоящего изобретения, и к содержащим их пищевым добавкам. В течение сотен лет на тюленей охотились из-за их меха и мяса. В последнее время на данных животных охотятся в основном из-за меха и ворвани, остатки туш часто выбрасывают в море. Таким образом, зачастую имеются значительные количества отходов в виде тканей тюленей.

Вся связанная с тюленями отрасль экономики надеется найти растущий рынок для мяса тюленей, жировых продуктов тюленей и, в случае азиатского рынка, продуктов, усиливающих половое чувство, полученных на основе гениталиев тюленей.

Благодаря свойствам экстрагированного из ворвани тюленьего жира, обогащенного омега-3 жирными кислотами, в последнее время появился новый интерес к тюленьему жиру. Жир тюленей является типичным морским продуктом, так как он обогащен омега-3 жирными кислотами. Более конкретно, он содержит докозагексаеновую кислоту (DHA) и эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), полезные свойства которых хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, данные жиры содержат значительные уровни сквалена и витамина Е. Данные соединения необходимы для улучшения здоровья и поддержания его в хорошем состоянии. Фактически, в течение последних двадцати лет эксперты по здоровью рекомендуют диеты с низким содержанием насыщенных жиров и высоким содержанием полиненасыщенных жиров. В то время, как многие потребители следуют данному совету, заболеваемость болезнью сердца, раком, диабетом и многими другими изнуряющими заболеваниями продолжает неуклонно возрастать. Ученые пришли к согласию в отношении того, что тип и источник полиненасыщенных жиров является таким же критическим параметром, как и общее количество жиров. Наиболее распространенные полиненасыщенные жиры получают из растительных источников, а длинноцепочечные жирные кислоты (например, омега-3) содержатся в них в недостаточном количестве. Кроме того, гидрирование полиненасыщенных жиров с целью получения синтетических жиров вносит вклад в увеличение некоторых расстройств здоровья и усиливает дефицит некоторых эссенциальных жирных кислот. В действительности, было установлено, что многие медицинские состояния улучшаются при добавлении омега-3 жирных кислот. Такие состояния включают угри, аллергию, болезнь Альцгеймера, артрит, атеросклероз, кисту молочной железы, рак, кистозный фиброз, диабет, экзему, гипертонию, гиперактивность, расстройства кишечника, дисфункцию почек, лейкемию и множественный склероз. Следует отметить, что Всемирная Организация Здравоохранения рекомендует обогащать детские смеси омега-3 жирными кислотами.

Обычно используются полиненасыщенные жиры, получаемые из растительных масел, которые содержат значительные количества омега-6 жирных кислот, но не содержат омега-3 жирные кислоты, или содержат их в небольших количествах. По мере того, что и омега-6, и омега-3 жирные кислоты необходимы для поддержания хорошего состояния здоровья, они должны потребляться в соотношении приблизительно 4:1. Существующий в настоящее время в западных странах режим питания создает серьезный дисбаланс при нынешнем потреблении омега-6, в среднем превышающем потребление омега-3 в 20 раз. Заинтересованные потребители начинают следить за диетическими пищевыми добавками для восстановления равновесия. Тремя основными источниками омега-3 являются льняное масло, рыбий жир и тюлений жир. В последнюю декаду наблюдается быстрый рост производства льняного масла и рыбьего жира. Оба типа жиров считаются хорошими пищевыми источниками полиненасыщенных жиров, но в отношении поставки омега-3 жирных кислот являются менее эффективными, чем тюлений жир. Льняное масло не содержит ЕРА, DHA или DPA, но содержит некоторое количество линоленовой кислоты строительного блока, из которого в организме синтезируется ЕРА. Однако существуют данные, что скорость метаболического превращения может быть медленной и неравномерной особенно у субъектов с ослабленным здоровьем. Разные типы рыбьего жира могут значительно различаться по типу и уровню жирно-кислотного состава в зависимости от конкретных видов и их режимов питания. Например, существует тенденция, что рыба, выращенная в условиях аквакультуры, имеет более низкий уровень омега-3 жирных кислот, чем рыба, выросшая в диких условиях. Исследование показало, что тюлений жир оказывает более благотворное действие на субъекты с риском заболевания сердца и диабета, чем рыбий жир. Ученые утверждают, что это происходит из-за относительного отсутствия DPA в рыбьем жире и из-за того, что экстракция и утилизация ЕРА и DHA, содержащихся в рыбьем жире, происходит с более низкой скоростью.

Наиболее богатый, прямой и полный источник омега-3 жиров обнаружен в ворвани некоторых морских млекопитающих и, в особенности, у гренландского тюленя. Кроме того, в организме более быстро и эффективно абсорбируются омега-3 кислоты из тюленьего жира, чем омега-3 кислоты из льняного масла и рыбьего жира. Это происходит, в частности, благодаря тому, что молекулярные конфигурации ЕРА и DHA из тюленьего жира слегка отличаются от молекулярных конфигураций кислот, обнаруженных в рыбьем жире.

Традиционно экстракцию тюленьего жира проводят с помощью способов, требующих высоких температур, которые способствуют окислению полиненасыщенных жиров.

Способы предыдущего уровня техники, которые описывают способы экстракции жира морских млекопитающих, требуют нагревания. Например, GB-A-711352 описывает способ экстракции жира из растительного и животного материала, включающего печень и мясо кита. Материал предпочтительно нагревают при температуре, находящейся в интервале приблизительно от 60°С до 80°С, с целью уменьшения вязкости смеси и для осуществления двух задач: 1) улучшения экстракции жира; 2) получения более тонкого измельчения белков в процессе гомогенизации. Подобным образом ХР-002164137 описывает способ экстракции жира китовой спермы, который требует нагревания образца при 45°С-55°С. Кроме того, в GB-A-470223 приводится способ экстракции жира из ворвани кита, который требует нагревания при 45°С-55°С.

Другие способы экстракции жира из морских млекопитающих требуют применения токсичных растворителей. Например, ХР-002164136 описывает способ экстракции жира из китов или тюленей, включающий применение токсичных растворителей, таких как хлороформ и метанол.

Таким образом, жир морских млекопитающих, таких как тюлени, обладает существенными преимуществами. К сожалению, простые и экономически эффективные способы очистки жира из таких морских млекопитающих не были известны. Также не были еще известны способы, позволяющие выделять жиры, содержащие значительные количества омега-3 жирных кислот, из жировых тканей, фракций активных белков и липидов из мышечной и висцеральной тканей. Кроме того, с точки зрения значительного уменьшения стоимости тюленьей шкуры (приблизительно на 50% за последний год) и очень низкой стоимости туш морских млекопитающих (от 1997 Newfoundland and Labrador Seafood Industry, Newfoundland Department of Fisheries and Aquaculture) существует потребность в увеличении ценности морских млекопитающих (в частности, тюленей), частей их тела и в особенности их туш.

Остается также потребность в нахождении применения белкам туш морских млекопитающих, таких как туши тюленей, и/или в пробуждении интереса к данным белкам.

С точки зрения опубликованных данных по благотворному действию на здоровье омега-3-содержащих жирных кислот остается потребность в предоставлении экстрактов, содержащих значительные количества данных кислот, простых и экономически эффективных способов их получения, а также в предоставлении пищевых добавок, включающих такие экстракты.

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение указанных и других потребностей.

В настоящем описании имеются ссылки на ряд документов, содержание которых включено здесь в качестве ссылки во всей их полноте.

Данное изобретение касается способа получения и очистки жира морских млекопитающих, обогащенного омега-3 жирными кислотами, с помощью которого удается преодолеть недостатки предыдущего уровня техники. Более конкретно, данное изобретение касается способа очистки жира из ткани тюленя, обогащенного омега-3 жирными кислотами, фракций, содержащих такой жир, и включающих его пищевых добавок. В особенно предпочтительном воплощении тканью тюленя является ворвань, которая дает значительное количество жира.

Далее, данное изобретение относится к способу экстракции омега-3-содержащих жирных кислот из морского млекопитающего, который позволяет выделять жир ворвани в условиях, сохраняющих его качество. Более конкретно, способ экстракции омега-3 жирных кислот уменьшает окисление полиненасыщенных жиров. Способ также позволяет выделять липиды из других тканей и получать белковый изолят из туши. Настоящий способ имеет большую ценность благодаря применению туш в качестве субстрата для экстракции и очистки, а также возможности более экологически чистой утилизации туш и невостребованных тканей из морских млекопитающих. Действительно, настоящее изобретение делает возможной утилизацию тканей морских млекопитающих, которые зачастую выбрасываются.

Более конкретно, в одном предпочтительном воплощении данное изобретение относится к способу обработки тюленей и родственных видов, в соответствии с которым их подкожные жировые ткани экстрагируют путем применения "холодного давления" в отсутствии растворителя.

В наиболее предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ дополнительно включает вторую стадию, которая позволяет выделять белки из мышечных и других тканей тюленя экстракцией растворителем. В особенно предпочтительном воплощении растворитель выбирают из ацетона, спирта, этанола, этилацетата или сочетания по меньшей мере двух таких органических растворителей. Липиды, экстрагированные растворителем или растворителями на второй стадии экстракции, выделяют путем упаривания растворителя или растворителей. Способ, включающий вторую стадию, позволяет выделять по существу чистую белковую фракцию, не содержащую значительных количеств тяжелых металлов или пестицидов (которые не осаждаются вместе с белками).

Неограничивающие примеры органических растворителей, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, хорошо известны в данной области и включают спирт (например, изопропанол, пропанол и т. п.). Конечно, предпочтительно использовать растворители, которые являются нетоксичными для животных (такие как, например, этанол).

Термин "животное" относится в широком смысле к царству животных и, следовательно, к млекопитающим, рыбам, птицам и т. п.

Способы настоящего изобретения позволяют получать из жировой ткани жиры, обогащенные омега-3 кислотами, по существу чистые белковые фракции, которые сохраняют ферментативную активность, и липиды из мышечных и висцеральных тканей (тканей, которые обычно выбрасываются).

В ряде предпочтительных воплощений настоящее изобретение относится к тюленям как морским млекопитающим, из которых получают экстракты фракций.

В одном воплощении настоящего изобретения при умерщвлении морского млекопитающего, имеющего жирные кислоты, обогащенные омега-3, млекопитающее немедленно обескровливают и удаляют кожу. Подкожный жир и другие жировые ткани вырезают и держат при очень низких температурах. Предпочтительно температура находится в интервале от 0°С до 10°С и более предпочтительно в интервале от 0°С до 4°С. Жир извлекают, оказывая физическое давление на жировую ткань. В отдельном воплощении жир извлекают путем перемалывания и приложения высокого давления к тканям (холодная экстракция). В таком способе жир плавят до состояния жидкого масла, которое затем выделяют путем фильтрации или центрифугирования.

В отдельном воплощении масло очищают традиционными способами, такими как, например, фильтрация и/или центрифугирование. Кроме того, как известно в обычной практике, содержащиеся в масле вода и летучие соединения могут быть вместе удалены нагреванием.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения другие ткани туши, включая висцеральные, измельчают и экстрагируют холодным ацетоном и/или этанолом. После промывания нерастворимого вещества растворитель удаляют из экстрактов при пониженном давлении, при этом остается белковый концентрат, сохраняющий некоторую ферментативную активность и не содержащий какого-либо значительного уровня бактериального загрязнения. Растворимое в растворителе вещество (липидную фазу) выделяют путем упаривания и отделения от тканевой воды.

Следовательно, в соответствии с одним воплощением настоящее изобретение относится к способу экстракции жира морских млекопитающих, обогащенного омега-3 жирными кислотами, включающий стадию экстракции липидов, которая включает обработку ткани морского млекопитающего холодным прессованием, которая позволяет получить жир, обогащенный омега-3 жирными кислотами, и которая уменьшает окисление полиненасыщенных жиров, и где стадия экстракции липидов проводится в отсутствии органического растворителя.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к жиру морского млекопитающего, обогащенного омега-3 жирными кислотами, полученному по способу настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к композиции пищевой добавки, включающей жир морского млекопитающего настоящего изобретения вместе с подходящим носителем. Подходящие носители хорошо известны в данной области.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к жиру морского млекопитающего, обогащенному омега-3 жирными кислотами, который не содержит следов органического растворителя.

Использующийся в данном описании термин "жир ворвани" или "ворвань", как известно специалисту в данной области, обозначает подкожную жировую ткань. Термин "холодное прессование" является хорошо известной в данной области терминологией, которая относится к приложению физического давления к жировой ткани при низкой температуре (см. выше).

В данном документе термин "по существу чистая белковая фракция" или т.п. относится к белковой фракции или к белковому препарату, который содержит по меньшей мере приблизительно 90% белка, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% белка. Подобным образом, термин "по существу чистая белковая фракция" или т.п. относится к белковой фракции, имеющей по меньшей мере 90% чистоты, предпочтительно, по меньшей мере, 95% чистоты и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99% чистоты.

Термин "не содержащий значительных количеств тяжелых металлов или пестицидов" относится к уровням пестицидов или тяжелых металлов, являющихся нижеутвержденными стандартами регламентирующих организаций (например, Health Canada [например, The Food and Drug Act and Regulations], the Food and Drug Administration [USA] и т.п.).

Хотя способы и экстракты настоящего изобретения описаны в связи с тканями тюленей, в способах настоящего изобретения могут использоваться вообще морские млекопитающие, имеющие жирные кислоты, обогащенные омега-3. Такие морские млекопитающие известны в данной области. Их неограничивающие примеры включают китовых (например, китов), морских слонов, тюленей, моржей и т.п. Следует понимать, что рядовой специалист в данной области способен адаптировать инструкции, приведенные в данном изобретении, к получению жиров, белков и липидов из таких морских млекопитающих.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения морским млекопитающим, имеющим жирные кислоты, обогащенные омега-3, является тюлень. Термин "тюлень" в данном документе применяется в широком смысле и относится к ряду видов. Неограничивающие примеры видов, обитающих в Атлантическом океане, включают гренландского тюленя, хохлача (Cystophora cristata), кольчатую нерпу (Pusa Hispida), обыкновенного тюленя (Phoca vitulina, также обитающего в Тихом океане), серого тюленя (Halichoerus grypus) и морского зайца (Erignathus barbatus).

Следует отметить, что эксперты по здоровью сделали вывод, что 80% всех американцев обладают дефицитом жизненно важных жирных кислот. Некоторыми характерными, но не исключающими признаками и симптомами дефицита эссенциальных жирных кислот являются усталость, депрессия, сухость кожи и волос, сухость слизистых оболочек, ломкие ногти, нарушение пищеварения, констипация и недостаточная сопротивляемость. Длительный дефицит связан с высоким риском хронических дегенеративных заболеваний. 60 Видов медицинских состояний связаны с данным дефицитом или альтернативно идентифицируются как улучшающиеся при добавлении омега-3 кислот. Данные состояния включают угри, аллергию, болезнь Альцгеймера, артрит, атеросклероз, кисту молочной железы, рак, кистозный фиброз, диабет, экзему, гипертонию, гиперактивность, расстройства кишечника, дисфункцию почек, лейкемию и множественный склероз, миопатию, ожирение, псориаз и сосудистые заболевания. Доказано, что тюлений жир снижает уровень сывороточного холестерина без побочных эффектов, связанных с рекомендуемыми лекарственными средствами, и его способность уменьшать количество тромбоцитов в крови может служить в качестве альтернативы аспирину при профилактике удара. Следовательно, способы настоящего изобретения и полученные с их помощью фракции находят применение при широком ряде дефицитов или нарушений. Тремя наиболее важными из длинноцепочечных жирных кислот являются ЕРА, DHA и DPA. Данные жирные кислоты после относительной безвестности в медицинском мире сегодня становятся на рынке одними из наиболее важных и быстро растущих пищевых добавок, улучшающих состояние здоровья.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к композициям, включающим одну или несколько фракций согласно настоящему изобретению, предназначенным для лечения и/или профилактики одного или нескольких дефицитов или состояний, при которых показаны добавки, содержащие омега-3 кислоты, и более конкретно дефицитов или состояний, описанных выше. Для введения людям или другим животным профессионал (профессионал в области медицины или эксперт по пищевым добавкам, улучшающим состояние здоровья) окончательно определяет подходящую форму и дозировку для данного субъекта, которые, как следует ожидать, могут варьировать в соответствии с выбранным терапевтическим или профилактическим средством, ответом и состоянием субъекта, а также тяжестью заболевания или состояний.

Композиция в объеме настоящего изобретения содержит активный агент (например, масло, обогащенное омега-3 жирными кислотами) в количестве, эффективном для достижения желательного терапевтического и/или профилактического эффекта при отсутствии неблагоприятных побочных эффектов. Так как масло согласно настоящему изобретению имеет от среднего до низкого уровня витамина А, оно может быть введено в высоких дозах (более 100 мл). Известно, что эскимосы едят огромные количества ворвани, эквивалентные 250-500 мл масла согласно настоящему изобретению. Следовательно, масло настоящего изобретения, как правило, может быть введено млекопитающим (например, людям) в дозах, варьирующих от 2 до 10 мл масла в день в соответствии с настоящим изобретением (среднему субъекту массой 150 фунтов). Фармацевтически приемлемые препараты входят в объем настоящего изобретения и хорошо известны в данной области (Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Ed.). Белковая фракция в соответствии с настоящим изобретением может применяться в качестве источника белка, например, для рыб, птиц или млекопитающих.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

После описания в общих чертах данного изобретения приводится ссылка на сопровождающие чертежи, демонстрирующие иллюстративно его предпочтительное воплощение, в которых

на фиг.1 показана тонкослойная хроматография нейтральных липидов и фосфолипидов жировых экстрактов ворвани, печени, мышц и поджелудочной железы;

на фиг.2 показана протеолитическая активность белковых экстрактов мышц и поджелудочной железы;

на фиг.3 показано протеолитическое действие белковых экстрактов поджелудочной железы на белковые экстракты мышечной ткани;

на фиг.4 показана протеолитическая активность белковых экстрактов печени.

Другие цели, преимущества и признаки настоящего изобретения станут более понятными после прочтения следующего, не ограничивающего описания предпочтительных воплощений со ссылками на сопровождающие чертежи, которое приводится в качестве примера и не должно интерпретироваться как ограничивающее объем настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВОПЛОЩЕНИЯ

Получают ткани тюленей и выбранные ткани держат замороженными по отдельности при -20°С. Получение образцов тканей и экстракцию липидов проводят при 4°С. Подходящие образцы тканей разрезают на кусочки и пропускают через мясорубку. Липиды экстрагируют из взвешенных измельченных образцов либо путем наложения механического давления, либо путем растворения в ацетоне в течение разных периодов времени в соответствии с типом ткани. Экстрагированные липиды отделяют от нелипидных веществ центрифугированием или фильтрацией в зависимости от вида ткани. Экстрагированные растворителем липиды извлекают упариванием растворителя в аппарате Rotavapor.

Общие методы экстракции, описанные выше, применяют к отдельным тканям тюленей, таким как ворвань, мышцы, поджелудочная железа и печень.

В таблице 1 показан выход липидных экстрактов из тканей мышц, поджелудочной железы и печени. Из поджелудочной железы и печени после экстракции в течение ночи и промывки в течение 30 минут получают липиды с выходом 2,6-3,0%. Наоборот, из ворвани в результате экстракции получают по меньшей мере 70% полупрозрачного жира. Тот факт, что жир является полупрозрачным, является другим преимуществом способа настоящего изобретения. Кроме того, жир, полученный из ворвани, не окрашен.

Таблица 1
Количество липидов, экстрагированных ацетоном в течение различных периодов экстракции
Ткань	Масса, г	Время экстракции, час	Время промывки, минуты	Количество липидов
				г	%
Мышцы	274	22,5	30	6,28	2,3
Мышцы	257	19	30	6,93	2,6
Мышцы	250	17	30	7,61	3,0
Мышцы	250	3,5	20	4,70	1,9
Поджелудочная железа	109	2	15	2,03	1,9
Печень	151	1	15	2,25	1,5
Мышцы	250	4	5	3,56	1,4

В таблице 2 приведен общий состав мышечной ткани, экстрагированной в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения. С помощью процедуры экстракции получают последовательно две липидные фракции и сухой остаток, обогащенный белками. Результаты, суммированные в таблицах 1 и 2, демонстрируют, что извлечение липидов составляет 2,6-3,0%. Чтобы проверить, можно ли извлечь больше липидов, остаток мышечной ткани промывают 100 мл чистого этилацетата. Дополнительно может быть извлечено 1,6-2,4%.

Таблица 2
Общий состав мышечных тканей
	#1	#2
Влага, %	70,8	70,5
Сухое вещество, %	29,2	29,5
Общие липиды, %	4,7	2,5
Липидная фракция 1,%	4,6	2,3
Липидная фракция 2,%	0,1	0,2
Остаток, %	24,5	27,0
Остаточные липиды, %	2,4	1,6

Сравнительная экстракция по методу Фолча (Folch) (1957) демонстрирует, что извлечение общих липидов из мышечной ткани по методу Фолча с точки зрения выхода является немного лучше, чем по способу настоящего изобретения. Однако метод Фолча не может применяться для извлечения липидов с коммерческими целями из-за его токсичности вследствие применения метанола. Токсичность метанола хорошо известна.

Фигура 1 и таблица 3 показывают, что 98% липидов ворвани представляют собой триглицериды. Основными видами, составляющими приблизительно половину липидов печени, являются нейтральные липиды со свободными жирными кислотами (32%), другую половину составляют в основном фосфатидилхолин (23%) и фосфатидилэтаноламин (17%). Приблизительно три четверти липидов мышечной ткани составляют нейтральные липиды и триглицериды (67%), составляющие их основную часть, тогда как другая четверть включает сфинголипиды/лизофосфатидилхолин (13%) и фосфатидилхолин (10%). В противоположность этому 44% липидов поджелудочной железы являются свободными жирными кислотами, а основными фосфолипидами являются фосфатидилхолин (21%) и фосфатидилэтаноламин (15%). В экстракте поджелудочной железы триглицериды не обнаружены.

Таблица 3
Соотношение классов липидов в жирах жировой ткани, печени, мышц и поджелудочной железы
Класс липидов	Жировая ткань	Печень	Мышцы	Поджелудочная железа
Общие нейтральные липиды	100,1	52,8	77,2	58,4
Эфир холестерина	0,4	5,7	1,0	5,3
Триглицериды	98,6	12,4	66,6	0
Свободные жирные кислоты	0,7	31,8	7,1	43,8
Моно- и диглицериды	0,4	2,8	2,7	9,3
Общие фосфолипиды	0	47,2	22,5	41,6
Фосфатидная кислота	0	1,3	0	0
Фосфатидилэтанол амин	0	16,7	0	14,6
Фосфатидилхолин	0	22,6	9,5	21,4
Сфинголипиды/лизофосфатидилхолин	0	4,6	12,9	5,7

В таблице 4 показаны выбранные физические и химические характеристики жиров ворвани и мышечной ткани. Значения числа омыления и йодного числа позволяют предположить, что липиды из обеих тканей содержат короткоцепочечные жирные кислоты и высокие уровни полиненасыщенных жирных кислот. Ненасыщенные жирные кислоты, полученные из ворвани, в меньшей степени способны образовывать перекиси, чем ненасыщенные жирные кислоты, экстрагированные из мышечной ткани. Мышечный жир содержит 0,84% летучих веществ и влаги. Наоборот, в жире ворвани влага и летучие вещества не определяются. Фактически, при воздействии температуры 125°С жир ворвани легко окисляется. Жирнокислотный состав обеих тканей приведен в таблице 5. Оба типа жира содержат высокие соотношения 20:5 и 22:6 жирных кислот (характерная черта морских жиров).

Таблица 4
Физические и химические особенности жиров ворвани и мышечной ткани
	Жир ворвани	Мышечный жир
Йодное число	164	122
Пероксидное число	2,6	14
Число омыления	191	199
Количество свободных жирных кислот	1%	6,6%
Влага и летучие вещества	<0,05%	0,84%
Коэффициент преломления (24°С)	1,4765	1,4789

Таблица 5
Содержание основных жирных кислот (мг/100 мг) в жире ворвани и мышц
Жирная кислота	Ворвань	Мышечная фракция 1	Мышечная фракция 2
14:0	5,5	5,2	0,7
16:0	12,7	19,5	27,2
18:0	1,1	3,3	8,1
НАСЫЩЕННЫЕ	21,9	29,1	36,1
16:1n-7	22,2	17,0	3,6
18:1n-9	13,1	16,7	23,4
МОНОНЕНАСЫЩЕННЫЕ	53,3	48,8	36,2
18:2n-6	0,9	1,2	2,0
20:4n-6	0,3	1,0	3,9
n-6 ПНЖК	1.5	2,5	6,1
18:3n-3	0,4	0,3	0,1
20:4n-3	0,2	0,3	1,5
20:5n-3	11,2	9,7	12,0
22:5n-3	3,3	2,6	1,5
22:6n-3	8,2	6,9	6,5
n-3 ПНЖК	23,2	19,7	21,7

Белковые остатки, полученные после экстракции липидов, могут использоваться в качестве источников белков и ферментов. Для подтверждения этого определяют аминокислотный состав мышечных белков и протеолитическую и амилолитическую активность белковых остатков. В таблице 6 показано, что в мышечных белках присутствуют все необходимые аминокислоты. Однако только 10% мышечных белков является водорастворимыми. На фигурах 1-4 показано, что белковые экстракты поджелудочной железы содержат некоторую протеолитическую активность, а белковые экстракты печени и мышечной ткани не обладают существенной ативностью.

Таблица 6а
Аминокислотный состав мышечных белков
Аланин	0,66			Изолейцин	8,25	Треонин	0,44
Аргинин	15,00			Лейцин	7,84	Триптофан	0,44
Аспартат	14,64			Лизин	1,18	Тирозин	6,23
Цистеин	3,61			Метионин	1,95	Валин	7,12
Глутамат	3,05			Фенилаланин	1,21	Глицин	0,62
Пролин	5,91			Гистидин	5,68	Серин	6,59
Таблица 6b
Состав белкового изолята
Белок			80,6% (94,5% от сухой массы)
Зола			5,2%
Вода			14,7%
Минеральные вещества, %
Кальций		4,4 мг
Натрий		116 мг
Калий		708 мг
Ртуть		<0,02 мг
Кадмий		<0,01 мг

В таблице 7 показано, что поджелудочная железа содержит только слабую амилолитическую активность и, таким образом, не является тканью, выбираемой для выделения амилазы. Тем не менее, показано, что ткань морского млекопитающего может использоваться в качестве источника белка (в добавление к жиру, обогащенному омега-3 кислотами), который сохраняет ферментативную активность. Конечно, рядовой специалист в данной области может использовать поджелудочную железу тюленя (или другой орган) в качестве источника белка, который, как известно, экспрессируется в данном органе.

Таблица 7
Амилолитическая активность белковых экстрактов поджелудочной железы
Ткань	Активность (мкмоль/мин/мг)
Белковый экстракт поджелудочной железы	1,2
Замороженная поджелудочная железа	1,2

Настоящее изобретение иллюстрируется более подробно с помощью нижеследующих неограничивающих примеров.

Пример 1

Экстракция из ворвани тюленя

Подкожную жировую ткань (ворвань) очищают от загрязняющих рассеченных тканей. Образцы ворвани, замороженные при -20°С, сразу размельчают в мясорубке при 4°С и жир выдавливают из жировых тканей, используя механическое давление. "Жир ворвани" выделяют после центрифугирования при 4000 об/мин в течение 15 минут и взвешивают вместе с остатком для того, чтобы оценить относительный процент выделения каждой фракции.

Пример 2

Экстракция из мышечных тканей тюленя

Мышечную ткань очищают от видимых немышечных тканей. Образцы мышечной ткани размельчают в мясорубке и смешивают в смесителе в течение двух минут при высокой скорости с холодным (˜20°С) ацетоном в соотношении 5 объемов ацетона на г ткани. После тщательного перемешивания липиды при помешивании экстрагируют в ацетон в течение различных периодов времени при 4°С. В определенные моменты времени растворитель отделяют от смеси путем фильтрации. Отфильтрованный растворитель собирают, а твердую фазу снова промывают в холодном ацетоне (-20°С), как описано выше. Две фракции растворителя объединяют и экстрагированные липиды получают после упаривания в аппарате Rotavapor. Липидные фракции солюбилизируют в 100 мл этилацетата и выделяют ("тканевые липиды") после декантации в течение ночи. Оставшееся вещество сушат на воздухе в течение ночи при комнатной температуре, взвешивают, растирают в порошок ("белковый изолят") и хранят в замороженном состоянии при -20°С для дальнейшего ферментного анализа.

Пример 3

Экстракция из тканей поджелудочной железы и печени тюленя

Образцы тканей измельчают и экстрагируют, как описано для мышечных тканей, за исключением того, что полученную липидную фракцию не солюбилизируют в этилацетате. Полученный экстракт сушат на воздухе в течение ночи, затем измельчают в порошок и хранят в замороженном состоянии при -20°С для дальнейшего ферментного анализа.

Пример 4

Сравнение эффективности экстракции метода Фолча и способа настоящего изобретения

Для сравнения эффективности экстракционного процесса классический метод (Folch et al., 1957) с использованием хлороформа и метанола был применен к мышечной ткани. Данный метод является стандартным методом для количественного измерения эффективности экстракционного процесса. Степень извлечения липидов определяют путем суспендирования липидных фракций в малых объемах их исходных растворителей и измерения путем гравиметрии малых аликвот после упаривания.

Пример 5

Анализ липидной композиции

Для анализа липидной композиции известные количества каждого экстракта наносят на пластинки с силикагелем и разделяют тонкослойной хроматографией, ТСХ (Bowyer et al., 1962) в системе следующих растворителей: нейтральные липиды: гексан, этиловый эфир, уксусная кислота (90:10:1, об./об.), и фосфолипиды: хлороформ, метанол, вода, уксусная кислота (80:25:2:2, об./об.). Жирнокислотный состав жиров ворвани и мышечной ткани анализируют газожидкостной хроматографией, ГЖХ (Bowyer et al., 1962) с некоторыми модификациями. Вкратце, проводят инкубацию в течение 2 часов при 65°С вместо 1 часа при 80°С и проводят три промывки гексаном вместо двух, а также не промывают водой (Beaudoin et al., 1970).

Для удаления следов органических растворителей и летучих веществ липидные фракции нагревают до 125°С в течение примерно 15 минут в инертной атмосфере.

Липидные экстракты ворвани и мышечной ткани характеризуют: (1) йодным числом по Nagendrappa et al. (1998); (2) пероксидным числом и числом омыления, жирнокислотным составом, влажностью и содержанием летучих веществ, в также показателем преломления в соответствии с рекомендациями Американского Жирового Химического Общества (AOCS); (3) содержанием свободных жирных кислот по Не et al. (1999) после отделения жирных кислот методом ТСХ.

Пример 6

Анализ белкового состава

Количество белка в мышечных тканях определяют по классическому методу Къельдаля. Содержание минеральных веществ определяют атомной спектрофотометрией по известным методам.

Протеолитические активности определяют по высвобождению аминогрупп путем спектрофотометрического анализа, используя о-фталевый альдегид в качестве реагента. Однопроцентные гомогенаты тканевых экстрактов в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0, инкубируют при 37°С в присутствии и отсутствии трипсина. В указанные промежутки времени добавляют трихлоруксусную кислоту и количество аминогрупп определяют в супернатанте по методу Church et al. (1983) (J Dairy Sci 66:1219-1227) за исключением того случая, когда тест проводят на микропластинках.

Амилолитические активности определяют по методу Bernfeld (1951).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее изобретение, следовательно, представляет собой простой и экономически эффективный способ получения жира морского млекопитающего, обогащенного омега-3 жирными кислотами, который затем может быть использован в многочисленных видах композиций, таких как пищевые добавки, для профилактики или лечения многочисленных видов состояний или расстройств. В качестве исходного материала для очистки жира могут быть использованы различные морские млекопитающие. В предпочтительном воплощении морское млекопитающее является тюленем. В дополнение к тому, что тюлени имеют высокое содержание омега-3 жирных кислот, преимущество состоит также в том, что тюлень является животным, на которое в настоящее время охотятся почти исключительно ради его меха. Следовательно, большинство тканей тюленя является отходами. Следовательно, настоящее изобретение позволяет утилизировать часто выбрасываемые ткани тюленя в продукты, имеющие дополнительную ценность, которые могут быть полезными, в частности, для человека. Предпочтительные ткани в соответствии с настоящим изобретением включают ворвань, мышцы и любой желательный орган, содержащий белки и более конкретно белки, которые обладают требуемой ферментативной активностью. Примеры таких органов включают, не ограничиваясь ими, печень и поджелудочную железу. В дальнейшем воплощении настоящее изобретение предоставляет вторую стадию, которая позволяет проводить выделение белковой фракции, являющейся по существу чистой, и которая может служить животной пищей для рыб, птиц, млекопитающих и т.п.

Хотя настоящее изобретение, описанное выше, является только одним из его предпочтительных воплощений, оно может быть модифицировано и не является ограничением.

Литература

Beaudoin, А.В., 1970, Metabolisme des lipids au cours du developpement du Tripolium confusum Duval (coleoptere, Tenebrionidae),

Ph.D. Thesis, Laval University.

Bernfeld P., 1951, Advances in Enzymol. 12:379.

Bowyer et al., 1962, BBA 70:423-431.

Church et at., 1983, J. Dairy Sci. 66.: 1219-1227.

Folch et al., 1957, J. Biol. Chem. 226:497-509.

Nagendrappa et al., 1998, JAOCS ^:1219-1221.