способ криоконсервирования пуповинной крови

Формула изобретения

Способ криоконсервирования пуповинной крови, заключающийся в том, что к свежесобранной пуповинной крови добавляют равный объем полиглюкина, перемешивают, смесь выдерживают в течение 50-60 мин до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его, отделяют осадок, к полученному осадку добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании, смесь помещают в термостатируемый объем, снижая температуру со скоростью 1-2°С в минуту в течение 1-2 ч, после чего ее хранят при ультранизких температурах.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области криобиологии, а именно к способам криоконсервации пуповинной крови, и может быть использовано при ауто- и аллотрансплантации в онкологии и гематологии. В последние годы широкое развитие получила трансплантация периферических ядросодержащих клеток (ЯСК), извлеченных из пуповинной крови (ПК) человека.

Многочисленные исследования показали, что ПК является богатым источником гемопоэтических ЯСК, и что лимфоидные клетки ПК менее иммунореактивны, поэтому частичная несовместимость по антигенам HLA-системы при трансплантации гемопоэтических клеток допустима, а частота тяжелой реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) встречается реже, чем при аллогенных трансплантациях периферических стволовых клеток и костного мозга.

Использование пуповинной крови для пересадок имеет ряд преимуществ по сравнению с другими источниками гемопоэтических клеток:

Отсутствует риск здоровью матери и ребенка (донора) и не требуется общая анестезия при сборе ПК.

Появляется возможность длительного хранения гемопоэтических клеток в замороженном состоянии как аллогенного трансплантата.

Выявлена большая возможность использования не полностью совместимых по HLA-системе (от 1 до 3 антигенов) трансплантатов.

Увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов, что имеет большую значимость для этнических меньшинств.

Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем.

Требуются меньшие затраты времени для поиска необходимого HLA-типа трансплантата.

Появляется недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.

В связи с малым объемом ПК, получаемым при разовом сборе, и невозможностью повторного сбора основной задачей при заготовке ПК является максимальный забор ПК, максимальное выделение ядросодержащих клеток из ПК и оптимальный способ замораживания их. Известны способы криоконсервирования ПК, описанные в работах К.М.Абдулкадырова и др. [1, 2, 3]. Как следует из упомянутых работ, в мировой современной практике криоконсервирования для выделения ЯСК и удаления эритроцитов используют как различные седиментирующие средства, например фиккол, метилцеллюлозу, желатин, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) и т.д., так и центрифугирование, а также сочетание указанных приемов.

На этапе замораживания используются различные криопротекторы: ДМСО или ДМСО в сочетании с ГЭК, человеческим альбумином и другие. Однако известные способы криоконсервирования пуповинной крови длительны, трудоемки, требуют отмывания седиментирующих средств, дорогостоящи и ненадежны за счет использования программных замораживателей (возможный отказ электронных микросхем). Задачей настоящего изобретения является создание способа криоконсервирования пуповинной крови, лишенного указанных недостатков, позволяющего обеспечить максимальное сохранение жизнеспособности ядросодержащих клеток при одновременном ускорении и упрощении способа, и абсолютной надежности процесса криоконсервации.

Сущность способа заключается в том, что к свежесобранной пуповинной крови добавляют равный объем полиглюкина, перемешивают, смесь выдерживают в течение 50-60 минут до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его, отделяют осадок, к полученному осадку добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании, смесь помещают в термостатируемый объем, где температура биоматериала понижается со скоростью 1-2°С в минуту в течение 1-2 часов, после чего его хранят при ультранизких температурах.

Способ осуществляется следующим образом: свежесобранную пуповинную кровь разделяют на фракции путем добавления равного объема полиглюкина, тщательно перемешивают, вертикально подвешивают контейнер, содержащий полученную смесь. Смесь выдерживают в течение 50-60 минут до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, в течение 10 минут при +18°С, плазму удаляют, а к оставшемуся осадку, представляющему собой концентрат ядросодержащих клеток, добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании, затем смесь в запаянном криомешке помещают в контейнер для замораживания, выполненный из многослойной фанеры (общая толщина 10 мм) с плотно закрывающейся крышкой и соответствующий размеру криомешка. Контейнер с криомешком помещают в пары жидкого азота. Скорость охлаждения материала составляет 1-2°С в минуту, время охлаждения 1-2 часа. Затем криомешок из контейнера переносят в основное хранилище с жидким азотом, где он сохраняется до трансплантации.

По предложенному способу было произведено выделение ядросодержащих клеток в 50 образцах пуповинной крови. Процент выделенных ядросодержащих клеток в среднем составил 84,53±8,51% от исходного количества,% удаленных эритроцитов в среднем составил 97,27±2,43% от исходного (в известных способах 82,6%; 97,9% соответственно). Потерь ЯСК после размораживания не наблюдалось (оценивали количество ядросодержащих клеток до и после замораживания).

В РОНЦ РАМН в отделениях взрослой и детской трансплантации проведено около 200 пересадок ядросодержащих клеток, у всех больных было восстановлено кроветворение. Кроме того, криоконсервированный по предложенному способу биоматериал, успешно применялся для трансплантаций больным, находящимся на лечении в ГНЦ РАМН, ГНЦ-институте биофизики МЗ России, госпитале им.Бурденко МО РФ.

Технический результат

Предложенный способ позволяет максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток, что обеспечивает восстановление кроветворения реципиента при лечении заболеваний крови, в том числе после высокодозной полихимиотерапии, и в то же время достигается упрощение и ускорение способа за счет сокращения числа манипуляций. Используемый полиглюкин является доступным для любого медицинского учреждения. Благодаря физиологичности полиглюкина способ не требует отмывания клеточной взвеси. Кроме того, остающийся после седиментации эритроцитов осадок используется в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования пуповинной крови; в настоящее время для тестирования используют цельную пуповинную кровь.

Таким образом, предлагаемый способ криоконсервации пуповинной крови, позволяющий максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток, прост в исполнении, не требует дорогостоящей аппаратуры и может успешно применяться для трансплантаций при многих тяжелых заболеваниях крови, включая онкологические.

Литература

1) К.М.Абдулкадыров и др. "Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови", "Вопросы онкологии 2000". т.46, №4, с.513-536.

2) К.М.Абдулкадыров и др. "Плацентарная кровь: альтернативный источник кроветворных стволовых клеток для трансплантаций. Создание банков пуповинной крови", ж-л "Терапевтический архив", 2001 г., т.73, №7, с.76-78.

3) К.М.Абдулкадыров "Гематология. Новейший справочник". М., 2004 г, с.890-901.