способ дифференциальной диагностики хронических обструктивных заболеваний легких

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики хронических обструктивных заболеваний легких, включающий получение бронхиального смыва из бронхиального дерева с последующим исследованием функциональной активности фагоцитирующих клеток методом люминолзависимой хемилюминесценции, отличающийся тем, что 5-8 мл бронхиального смыва пациента фильтруют, суспензию клеток осаждают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в растворе Хенкса, вновь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, полученный осадок ресуспендируют в 1 мл раствора Хенкса, концентрацию фагоцитов в суспензии доводят до 2 млн/мл, для регистрации люминолзависимой хемилюминесценции в реакционную смесь вводят клеточную суспензию с концентрацией фагоцитов в пробе 1 млн, и при значениях максимума свечения спонтанной хемилюминесценции в диапазоне от 2731 до 6200 усл.ед. диагностируют бронхиальную астму, от 6201 усл.ед. и выше - хронический обструктивный бронхит при норме - до 2730 усл.ед.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано в клинической практике.

Известен способ дифференциальной диагностики хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы смешанного генеза путем исследования крови, где показатели крови оценивают по цитограмме гранулоцитосвязывающих лимфоцитов и при преимущественном выявлении в мазках эозинофильно-связывающих розеток диагностируют бронхиальную астму, а нейтрофильно-лимфоцитарных розеток - хронический обструктивный бронхит [1].

В способе оценивают активность клеток крови, то есть показатели системного иммунитета, что не позволяет учитывать особенности воспалительного процесса, протекающего в дыхательных путях.

В работе И.Г.Даниляк, А.X.Когана, С.Болевича и др. проводят сравнительное исследование функциональной активности лейкоцитов крови и альвеолярных макрофагов у 10 пациентов, страдающих бронхиальной астмой (основная группа), 10 - хроническим бронхитом (группа сравнения) и 5 практически здоровых человек. Оценку функциональной активности клеток проводят методом люминолзависимой хемилюминесценции. В результате проведенных исследований было установлено, что у больных бронхиальной астмой базальный и стимулированный показатели генерации активных форм кислорода альвеолярными макрофагами достоверно выше, чем в контроле. Таким образом, по количеству активных форм кислорода, продуцируемых альвеолярными макрофагами, предлагается судить о степени и характере воспалительного процесса, протекающего в бронхолегочной системе [2].

Этот метод включает процедуру выделения чистой фракции альвеолярных макрофагов, что является достаточно трудоемким и затратным процессом и ограничивает применение метода в повседневной клинической практике.

В клинической практике иногда весьма непросто провести диагностику между бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом. Задача предлагаемого способа - предложить простой в исполнении лабораторный тест, позволяющий точно дифференцировать эти заболевания.

Поставленную задачу решают за счет того, что 5-8 мл бронхиального смыва пациента фильтруют, суспензию клеток осаждают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 15 минут, ресуспендируют в растворе Хенкса, вновь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут, полученный осадок ресуспендируют в 1 мл раствора Хенкса, концентрацию фагоцитов в суспензии доводят до 2 млн/мл, для регистрации люминолзависимой хемилюминесценции в реакционную смесь вводят клеточную суспензию с концентрацией фагоцитов в пробе 1 млн и при значениях максимума свечения спонтанной хемилюминесценции в диапазоне от 2731 до 6200 усл.ед. диагностируют бронхиальную астму, от 6201 усл.ед. и выше - хронический обструктивный бронхит при норме - до 2730 усл.ед.

Способ осуществляют следующим образом. Функциональная активность фагоцитов: альвеолярных макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом, а также в группе контроля исследовалась в тесте люминолзависимой хемилюминесценции. Показатели люминолзависимой хемилюминесценции исследовались у клеток, выделенных из бронхиального дерева. Бронхиальный смыв получали в ходе диагностической (санирующей) фибробронхоскопии. Фибробронхоскопию проводили в утренние часы натощак под местной анестезией с использованием фибробронхоскопа фирмы "Olympus" (Япония). Местную анестезию проводили 2% раствором лидокаина. Через аспирационный канал фибробронхоскопа в сегментарный бронх инсталлировали 10 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида, подогретого до 37°С. При аспирации получали 5-8 мл жидкости (бронхиальный смыв). Забор бронхиального смыва осуществляли в сухую силиконированную стеклянную посуду. Для получения суспензии клеток проводили отмывание от слизи: фильтровали через два слоя марли, осаждали центрифугированием при 2500 об/мин в течение 15 минут на центрифуге ОС-6, ресуспендировали в растворе Хенкса, вновь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Полученный после второго центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Хенкса. Общее количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали по включению 0,1% трипанового синего. Количество окрашенных клеток не превышало 5%. Концентрацию фагоцитов в суспензии доводили до 2 млн./мл.

Поскольку амплитуда хемилюминесцентного ответа нефагоцитирующих клеток крайне мала, мы пренебрегли их вкладом в хемилюминесцентный ответ.

Реакционная смесь для хемилюминесцентной реакции состояла из 40 мкл пуловой донорской сыворотки группы AB_o (IV), 100 мкл люминола в концентрации 10^-5 М, 350 мкл раствора Хенкса и 500 мкл клеточной суспензии (концентрация фагоцитов в пробе 1 млн.). Оценка спонтанной хемилюминесценции производилась в течение 90 минут на аппаратурно-программном комплексе, включающем PC-управляемый 36-канальный "Chemiluminometer 3604" (СКТБ "Наука", г. Красноярск) [I]. Определяли макисмум интенсивности хемилюминесцентного свечения (I_max ).

Апробация способа проведена у 170 человек, у 117 из которых диагностирована бронхиальная астма и у 53 - хронический обструктивный бронхит, а также 16 практически здоровых человек контрольной группы. При исследовании функциональной активности фагоцитирующих клеток бронхиального смыва получены следующие результаты (таблица №1). Проверка гипотез о равенстве двух средних производилась с помощью Т-критерия Вилкоксона.

Таблица №1. Показатели спонтанного хемилюминесцентного ответа фагоцитирующих клеток бронхиального смыва у больных с хронической обструктивной патологией легких.
Группа	Интенсивность хемилюминесцетного ответа, усл.ед.	Диапазон свечения фагоцитирующих клеток, усл. ед.	Достоверность
Больные бронхиальной астмой, n=117.	3878±1147	2731-6200	*/**
Больные хроническим обструктивным бронхитом, n=53.	8886±2672	6201 и выше	*
Группа контроля, n=16.	530±96	До 2730
Примечание: * - р<0,01 при сравнении с группой контроля, ** - р<0,01 при сравнении группы больных бронхиальной астмой с группой больных хроническим обструктивным бронхитом.

На чертеже представлены хемилюминограммы, полученные при исследовании функциональной активности фагоцитирующих клеток бронхиального смыва у больных с хронической обструктивной патологией легких.

Пример 1. Больная Г., 48 лет, при поступлении в стационар установлен диагноз хронического обструктивного бронхита, стадия обострения средней степени тяжести. На вторые сутки пребывания в стационаре была проведена диагностическая санирующая фибробронхоскопия. При исследовании бронхиального смыва получены следующие данные: количество лейкоцитов - 8,5×10⁶/ мл, количество окрашенных клеток в тесте с трипановым синим - 3%, значение максимума свечения спонтанной хемилюминесценции фагоцитирующих клеток - 8760 усл.ед. (график I).

Пример 2. Больная А., 45 лет, при поступлении в стационар диагностирована экзогенная бронхиальная астма, средней степени тяжести, стадия обострения. После осмотра пульмонологом назначен курс бронхолитической терапии. На 3 сутки пребывания в стационаре проведена диагностическия фибробронхоскопия. При исследовании бронхиального смыва получены следующие данные: количество лейкоцитов - 3,75×10⁶/ мл, количество окрашенных клеток в тесте с трипановым синим - 4%, значение максимума свечения спонтанной хемилюминесценции фагоцитирующих клеток - 3759 усл.ед. (график II).

Пример 3. Пациент В., без признаков бронхолегочной патологии, что подтверждено при бронхоскопическом исследовании. При исследовании бронхиального смыва получены следующие данные: количество лейкоцитов - 0,5×10⁶/ мл, количество окрашенных клеток в тесте с трипановым синим - 2%, значение максимума свечения спонтанной хемилюминесценции фагоцитирующих клеток - 637 усл.ед. (график III).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет провести дополнительную дифференциальную диагностику и выявить у пациента бронхиальную астму или хронический обструктивный бронхит на основании различной степени хемилюминесцентной активности фагоцитирующих клеток бронхиального дерева, а в дальнейшем корректировать назначенную терапию в соответствии с установленным диагнозом.

Используемая литература

1. Патент РФ №2178176, кл. G 01 N 33/53, 10.01.2002 г.

2. Даниляк И.Г., Коган А.X., Болевич С., Степанян И.Э., Сидорова Н.Д. Генерация активных форм кислорода альвеолярными макрофагами у больных бронхиальной астмой // Проблемы туберкулеза. - 1993. - №4. - С.55-58.