пептид, обладающий способностью ингибировать миграцию моноцитарных клеток, стимулированную белком мср-1

Формула изобретения

Пептид H-DHLDKQTQTPKT-OH и его фармацевтически приемлемые соли.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к биологически активным пептидам и белкам, способным ингибировать подвижность клеток, стимулированную хемокином МСР-1, а также к лекарственным средствам на их основе.

Известно, что при непосредственном участии хемотаксических цитокинов - хемокинов в организме осуществляется привлечение лейкоцитов в участки воспаления, их активация и дифференцировка. Кроме того, известно, что воспаление является неотъемлемым компонентом многих патологических состояний, таких как онкогенез, атеросклероз, аутоиммунные заболевания, болезнь Альцгеймера и др. [1]. Хемокины - это семейство небольших по массе основных белков (8-12 кДа), действие которых осуществляется через специальные хемокиновые рецепторы. Установлено, что в патогенезе атеросклероза ведущая роль принадлежит хемокину МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1), который экспрессируется макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками стенки сосуда [2]. Ниже представлена аминокислотная последовательность МСР-1 человека:

Присутствие в атеросклеротической бляшке моноцитов/макрофагов и Т-клеток свидетельствует о развитии локального воспалительного процесса в сосудистой стенке [3]. Значительная роль МСР-1 в развитии воспаления и, в частности, в атерогенезе [4] вызвала необходимость синтеза ингибиторов МСР-1.

Известны вещества непептидной (пиринидилимидазольной) природы, тормозящие миграцию моноцитарных клеток посредством блокирования некоторых звеньев внутриклеточной сигнализации [5], вследствие чего в отличие от пептидов препараты такого класса часто являются токсичными.

Известно [6], что пептид последовательности 51-62 МСР-1 (Н-EICADPKQKWVQ-OH) ингибирует миграцию моноцитов крови человека и клеток моноцитарной линии ТНР-1, стимулированных хемокинами, и не оказывает влияния на миграцию клеток, вызванную хемоаттрактантами нехимокиновой природы.

Известно, что аналог пептида последовательности 51-62 МСР-1 с заменой аланина на лейцин в положении 4 и валина на изолейцин в положении 11: H-EICLDPKQKWIQ-OH в 3-4 раза более активен, чем пептид 51-62 МСР-1, и согласно Reckless и Grainger [6] является лучшим кандидатом для проявления ингибирующей активности in vivo.

Известен также пептид следующей структуры [7]:

представляющий собой ретроэнантиоаналог пептида последовательности 51-62 МСР-1. Этот пептид в настоящее время является наиболее эффективным в качестве ингибитора миграции клеток in vitro и выбран в качестве прототипа заявляемого изобретения.

Недостатками прототипа являются сложность синтеза, обусловленная наличием дисульфидной связи в составе структуры пептида, что, как правило, приводит к уменьшению выхода целевого продукта за счет стадии циклизации, а также дороговизна синтеза (все аминокислоты, входящие в состав этого пептида D-конфигурации, что в несколько раз увеличивает стоимость исходных продуктов для синтеза этого пептида по сравнению с аналогичными пептидами, состоящими из остатков L-аминокислот).

Известно также, что С-концевая область хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции [8, 9] и пептиды из этой области не конкурируют с меченым МСР-1 при взамодействии с рецепторами ТНР-1 клеток [10].

Задачей, стоящей перед авторами настоящего изобретения, явился поиск и синтез пептидов, ингибирующих МСР-1-стимулированную миграцию моноцитарных клеток, причем синтез таких пептидов должен быть значительно проще и дешевле по сравнению с синтезом пептида-прототипа. Актуальность такого исследования связана, в частности, с поиском соединений для покрытия стентов, используемых при коронарной ангиопластике у больных с ишемической болезнью сердца для предупреждения развития рестенозов (повторного сужения сосудов).

Поставленная задача решается путем синтеза пептида формулы: Н-DHLDKQTQTPKT-OH или его фармацевтически приемлемых солей. В структуре заявляемого пептида по сравнению с прототипом отсутствует дисульфидная связь, что всегда упрощает синтез и очистку целевого продукта. Заявляемый пептид содержит одинаковое с прототипом количество аминокислотных остатков - 12, но все они - L-конфигурации, благодаря чему затраты на синтез уменьшаются в несколько раз, поскольку D-аминокислиты гораздо дороже L-аминокислот.

Неочевидность изобретения обусловлена тем, что поставленная задача решается путем синтеза пептида последовательности 66-76 МСР-1 из С-концевой части молекулы МСР-1, хотя из литературы известно, что С-концевая область хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции [8.9] и пептиды из этой области не конкурируют с меченым МСР-1 при взамодействии с рецепторами ТНР-1 клеток [10]. Таким образом, из литературных данных не следовало, что поиск пептидных ингибиторов МСР-1 стимулированной подвижности моноцитарых клеток из С-концевой части молекулы МСР-1 может привести к желаемым результатам. Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является фрагментом эндогенного белка МСР-1.

Следует отметить, что наряду с заявляемым пептидом подобной ингибирующей активностью могут обладать и его аналоги общей формулы: X₁-DHLDKQTQTPKT-X ₂, или их фармацевтически приемлемые соли, или их эфиры, или амиды, где X₁-H, низший ацил или X ₁ содержит один или несколько аминокислотных остатков, причем аминокислоты выбраны из алифатической, ароматической или гетероциклической групп, Х₂-ОН, либо - NH₂ , или содержит один или несколько аминокислотных остатков, причем аминокислоты выбраны из алифатической, ароматической или гетероциклической групп. Так, в литературе [10] имеются данные о том, что амидирование фрагментов МСР-1 усиливает их активность.

В структуре заявляемого пептида по сравнению с прототипом отсутствует дисульфидная связь, что всегда упрощает синтез и очистку целевого продукта. Заявляемый пептид содержит одинаковое с прототипом количество аминокислотных остатков - 12, но все они - L-конфигурации, благодаря чему затраты на синтез пептида уменьшаются в несколько раз, поскольку D-аминокислоты гораздо дороже L-аминокислот.

Синтез заявляемого пептида осуществляется по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе [11] с применением Fmoc-(9-флуоренилметоксикарбонил)-технологии. В качестве нерастворимого носителя использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с кислотолабильными якорными группами. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот и гидроксильных функций серина и треонина; трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - защиту для -аминогруппы лизина; 2, 2, 5, 7, 8-пентаметилхроман-6-сульфонильную (Pmc) - защиту для гуанидиновой функции аргинина; третильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции глутамина. Пептидную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная синтез с С-конца. Для создания амидных связей использовали N,N' - диизопропилкарбодиимид в присутствии 1- гидроксибензотриазола (DIC/HOBt-метод). Для заключительного деблокирования и отщепления пептидов от носителя применяли трифторуксусную кислоту со скэвенджерами. Сырой продукт твердофазного синтеза очищали с использованием препаративной ВЭЖХ.

Пример 1. Синтез пептида H-DHLDKQTQTPKT-OH. Пептид синтезировали по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. Согласно этой программе синтетический цикл включал 20-минутную активацию 1 ммоль присоединяемой аминокислоты в присутствии эквивалентных количеств DIC и НОВТ в NMP (N-метилпирролидоне), деблокирование -аминогрупп 20% раствором пиперидина в NMP в течение 20 мин, конденсацию с 1 ммоль (4-кратным избытком) ацилирующего агента в NMP в течение 37 мин и все необходимые промежуточные промывки пептидилполимера.

Для заключительного деблокирования и отщепления пептида от носителя пептидилполимеры суспендировали в 10 мл деблокирующей смеси: трифторуксусная кислота (TFA) - фенол - триизобутилсилан (TIBS) - тиоанизол - 1,2-этандитиол (EDT) (8.25: 0.5: 0.5: 0.5: 0.25) и перемешивали при 20°С 2 ч. Смолу отфильтровывали, промывали TFA (2×1 мл), фильтрат упаривали до объема 3-5 мл и прибавляли 100 мл сухого эфира или этилацетата. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром и этилацетатом, сушили.

Очистка пептида. Полученный сырой продукт растворяли в 5-10% уксусной кислоте (АсОН) и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом-130Т C₁₆, 10 мкм. Элюцию проводили градиентом концентрации (0.5% в минуту) СН₃CN в 0.01М ацетате аммония, рН 4.5 со скоростью потока 12 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Чистота полученного продукта - 96% по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Выход в расчете на стартовую аминокислоту составил 46%. Для C₅₉P₉₈N ₁₈O₂₂ найдено: MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией): m/z [М+Н]⁺ 1411,7, вычислено [М+Н]⁺ 1411,5. Структура полученного соединения подтверждена спектром ядерного магнитного резонанса (¹Н-ЯМР).

Тестирование синтезированного пептида проводилось по оценке его влияния на миграцию промоноцитарных клеток линии ТНР-1 и моноцитов периферической крови человека, стимулированную МСР-1.

Пример 2. Определение миграционной способности клеток. Миграционную способность клеток оценивали, используя камеру Бойдена [12]. В нижние ячейки камеры Бойдена помещали раствор МСР-1, 50-100 нг/мл, в верхние ячейки камеры вносили по 50 мкл суспензии клеток. Верхние и нижние ячейки разделяли поликарбонатной мембраной с размером пор 5 мкм (для оценки миграции моноцитов) и 8 мкм (для оценки миграции клеток ТНР-1). Камеру переносили в СО ₂-инкубатор на 1 час (при исследовании миграции моноцитов) или на 3 часа (при изучении миграции клеток ТНР-1). Непромигрировавшие клетки счищали, клетки, оставшиеся на фильтре, фиксировали в метаноле 5 мин и окрашивали красителем Гимза. Мембрану с прокрашенными клетками сканировали на сканере HP ScanJet 5300С и обсчитывали при помощи программы SigmaGel. Данные представляли в относительных единицах, представляющих отношение клеточной миграции в опыте к контрольной величине, полученной при оценке миграции клеток, прошедших сквозь фильтр в отсутствии хемоаттрактанта.

Пептид растворяли в бидистиллированной Н₂О в концентрации 10 мМ и добавляли как в клеточную суспензию перед внесением в микрокамеру, так и в нижние ячейки микрокамеры. Конечная концентрация пептидов составляла 100 мкМ. Достоверность различий в данных по миграции клеток оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Было показано, что заявляемый пептид ингибировал МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 на 30±5%, в то время как пептид-прототип ингибировал МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 на 15±5%. Было показано также, что заявляемый пептид ингибировал миграцию моноцитов в условиях модели in vitro на 21±5%, в то время как пептид-прототип ингибировал миграцию моноцитов в условиях модели in vitro на 32±7%. Эти данные свидетельствуют о сходном ингибирующем влиянии заявляемого пептида и прототипа. Полученные данные проиллюстрированы на приведенном чертеже.

Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является фрагментом эндогенного белка МСР-1.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Baggiolini M. //Nature. 1998. V.392. P. 565-568.

2. Libby P. //J. Intern. Med. 2000. V.247. P.349-358.

3. Ross R. // Am Heart J. 1999. V.138. P. 419-420.

4. Rollins B.L. // Blood. 1997. V.90. P.909-928.

5. Lee J.C. // Immunophatology. 2000. V. 47. P. 185-201.

6. Reckleess J., Grainger D. J. II Biochem. J. 1999. V. 340. P. 803-Gong J.-H., Clark-Levis I. // J Exp.Med. 1995. V 181. P. 631-640.

7. Reckleess J., Tatalick L. M., Grainger D. J. // Immunology. 2001. V. 103. P. 1-17.

8. Нап К.Н., Green S.R., Tangirala R.K., Tanaka S., Quenhenberger O. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 32055-32062.

9. Jarnagin К., Grunherger D., Mulkins M., Wong В., Hemmerich S., Paavola C; Bloom A., Bhakta S., Diehl F., Freedman R., McCarley D., Polsky I., Ping-Tsou A., Kosaka A., Handel T.M. // Biochemistry. 1999. V.38. P. 16167-16177.

10. Steitz S.A.. Hasegava K., Chiang S.-L., Coob R.R., Castro MA, Lobl T.J Yamada M., Lazarides E., Cardarelli HP.M. //FEBS Letters. 1998. V.430. P. 158-164.

11. Neimark J. and Brian J. P.// Peptide Research. 1993. V/6. P 216.

12. Valente A.J., Rozek M.M., Schwartz C.J., Graves D.T. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 309-314.

13. Falk W., Goodwin R. H. Jr., Leonard E.J. // J. Immunol. Methods. 1980. V. 33. P.239-247.