способ определения миграционной активности лейкоцитов у крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ определения миграционной активности лейкоцитов у крупного рогатого скота, включающий смешивание проб крови с раствором Хэнкса, помещение в термостат и центрифугирование, повторное помещение в термостат для инкубации и определение миграционной активности лейкоцитов по разнице замеров длины столба форменных элементов до повторной инкубации и после, отличающийся тем, что центрифугирование проводят в течение 1 мин при 8000 об/мин, инкубация длится 3 ч, а нормальную миграционную активность лейкоцитов диагностируют при величине разницы замеров от 8,5 до 12,7 мм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, а именно к способам определения миграционной активности лейкоцитов у крупного рогатого скота.

Лейкоциты крови способны к самостоятельной миграции в жидких средах организма. Эту способность они сохраняют в питательных средах вне организма. Их мигрирующая способность не является величиной постоянной и зависит от многих процессов, происходящих в организме. Измерив эту величину, можно судить о состоянии организма животных, о влиянии на него различных факторов, о возникновении и развитии патологических процессов, о стрессе.

Ученые Ю.И.Забудский и И.Г.Скутарь разработали и предложили методику определения миграционной активности у птиц [1].

Однако при работе с кровью крупного рогатого скота она не совсем подходит по следующим причинам:

1. Центрифугирование капилляров длительное.

2. Время пребывания капилляров с реактивной смесью в течение 16-18 часов для крупного рогатого скота неприемлемо, т.к. за это время лейкоциты погибают и обездвиживаются.

3. Нормативы скорости миграции лейкоцитов крупного рогатого скота до сих пор никем не определены.

4. Неизвестно было, сколько времени необходимо было хранить взятую кровь в холодильнике без заметного изменения конечных результатов.

Цель изобретения - разработка реакции миграционной активности лейкоцитов для оценки функционального состояния крупного рогатого скота, в том числе иммунитета.

Способ осуществляется следующим образом. Пробы крови у животных берут из яремной вены в обезжиренные пробирки, которые предварительно орошают любым антикоагулянтом (гепарин, лимоннокислый натрий). В небольшие пробирки типа Флоринского последовательно наливают 0,3 мл раствора питательной среды Хэнкса и такое же количество крови. Этих компонентов можно брать разное количество, лишь бы выдерживалась одинаковая пропорция. Полученную смесь тщательно и осторожно перемешивают и пипетируют. Затем пробирки ставят в термостат на 30 мин для подогрева до 37 градусов Цельсия, чтобы началась миграция и уменьшилась вязкость смеси. Пренебрежение этим приемом уменьшает степень уплотнения и показатели движение белых кровяных телец.

Пробирки извлекают из термостата и набирают реакционную смесь в подготовленные капилляры. В силу капиллярных сил при наклоне пробирки с реакционной смесью капилляры легко заполняются самотеком без принудительного засасывания. Капилляры заполняют на 2/3 их длины или на 50-70 мм. Нижний конец каждого капилляра закупоривают смесью пчелиного воска и пластилина в соотношении 1:1-2-3. При определенных навыках можно пользоваться одним пластилином. Кончик капилляра втыкают в пластилин на глубину 3-5 мм, одновременно вращая капилляр в разные стороны для лучшего вхождения закупоривающего вещества. В прохладных условиях лаборатории эти смеси желательно подогреть до температуры 37 градусов Цельсия, они становятся более пластичными и хорошо входят в капилляры. Для большей объективности, для каждой пробы крови необходимо делать по 2 капилляра.

Наполненные капилляры необходимо подвергнуть центрифугированию при 8000 об/мин, в течение 1 мин. Для этих целей есть специальные центрифуги, например МЦГ-8. В них капилляры для определения С-реактивного белка удобно ложатся в имеющиеся на дисках пронумерованные специальные пазы. Кладут капилляры закупоренной частью наружу, чтобы центрифужные силы не выдавили столбик смеси крови с питательной жидкостью. Степень уплотнения клеточной части крови при центрифугировании должна произойти в 3-5 раз. Дальнейшее уплотнение не производят, так как происходит повреждение лейкоцитов, и их миграция не происходит или будет очень слабой.

По прекращению центрифугирования капилляры располагают и закрепляют при помощи пластилина горизонтально на занумерованных предметных стеклах и быстро определяют длину спрессованных форменных элементов крови, используя линейку и лупу с двух- или пятикратным увеличением. Измерения производят с точностью до десятых мм и записывают в журнал. Капилляры помещают в термостат при 37 градусов Цельсия на 3 часа. Это время выбрано экспериментальным путем. Миграция лейкоцитов продолжается и в последующее время, но первые 3 часа инкубации они движутся наиболее активно и этого времени достаточно для оценки реакции. Кроме того, важно такой чувствительный тест провести в день взятия крови.

После пребывания капилляра в термостате опять производят замеры длины форменных элементов. Вследствие миграции лейкоцитов, размеры последнего увеличиваются за счет хорошо различимого конуса мигрировавших клеток, который бывает красного или желтоватого цвета, в зависимости от того, мигрируют вместе с лейкоцитами эритроциты или нет.

Величина миграционной активности лейкоцитов соответствующего животного равняется разнице между результатами первого и второго измерения. У здоровых коров она колеблется от 8,5 до 12,7 мм.

Оптимальные нормативы показателей миграционной активности лейкоцитов выведены на основании исследований крови крупного рогатого скота различных возрастов и анализа этих результатов у 606 животных в 1999-2003 годах из хозяйств Воронежской области. В холодное и теплое время года гепаринизированную кровь от подопытных животных необходимо доставлять в термосе: зимой - чтобы не замерзла, а летом - чтобы не перегрелась, так как все это сказывается на активности лейкоцитов, которая от всех этих нарушений тормозится или не проявляется вовсе. Установлено, что хранение гепаринизированной крови 24 ч в условиях холодильника не сказывается на конечных результатах подвижности лейкоцитов, а после этого до 72 ч отмечено небольшое угнетение миграции. Всякие неблагоприятные факторы, различной степени стрессы воздействуют на животных, тормозят миграцию лейкоцитов и в конечном итоге сказываются негативно на состоянии иммунитета.

Сущность способа поясняется примером.

Пример.

В ходе опыта определяли величину миграционной лейкоцитов в зависимости от времени повторного пребывания в реактивной среде в термостате. Исследование проводилось 18 ноября 1999 г. Кровь свежая, от коровы опытной станции Воронежского государственного аграрного университета (г. Воронеж). Результаты опыта представлены в таблице.

Таблица.
Показатели миграционной активности лейкоцитов в зависимости от времени повторного пребывания в термостате.
	Величина столбца до центрифугирования, мм	Величина столбца после центрифугирования, мм	Величина столбца после 3-х часов пребывания в термостате, мм	Величина МАЛ после 3-х часов пребывания в термостате, мм	Величина столбца после 18 часов пребывания в термостате, мм	Величина МАЛ после 18 часов пребывания в термостате, мм
Проба 1.	57,1	13,0	17,8	4,8	18,6	5,6
Проба 2.	56,0	12,2	17,2	5,0	17,9	5,7

Данные таблицы позволяют сделать следующие выводы:

1. Пребывание реактогенной среды с кровью крупного рогатого скота в термостате в течение 3-х часов является для нее оптимальным и достаточным для учета реакции.

2. Пребывание реактогенной среды с кровью в термостате в течение 18 часов дает мало прибавки скорости миграции лейкоцитов и неприменимо для крови крупного рогатого скота из-за потери подвижности форменных элементов.

Источник информации

1. Авторское свидетельство СССР - SU 1663547 А1, Кл. 5 МПК G 01 N 33/48, опубл. 15.07.1991, Бюл. №26. [Прототип].