антигенные менингококковые пептиды (варианты)

Классы МПК:C12N15/31 гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины
C07K2/00 Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные
C07K14/195 из бактерий
A61K38/02 пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные
A61K38/40 трансферрины, например лактоферрины, овотрансферрины
A61P31/04 антибактериальные средства
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):ЧИРОН С.Р.Л. (IT)
Приоритеты:
подача заявки:
2000-07-13
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, обусловленных Neisseria meningitidis. Белок по изобретению включает один или более фрагментов белков N. meningitidis с известными аминокислотными последовательностями, при этом данный фрагмент включает одну или более антигенных детерминант и имеет не более 1977 аминокислот SEQ ID NO:1 и/или не более 1531 аминокислот SEQ ID NO:2, которые приведены в тексте описания, при условии, что аминокислотная последовательность белка в целом не характеризуется аминокислотными последовательностями, представленными в NO:1 и NO:2. Каждый из белков по изобретению кодируется нуклеиновой кислотой (НК) с нуклеотидной последовательностью, в соответствии с генетическим кодом определяющей аминокислотную последовательность белка. Белки и нуклеиновые кислоты по изобретению используются для производства лекарственного средства для лечения и профилактики инфекции, вызываемой нейссериями, а также для производства диагностического реагента для обнаружения нейссерий или специфических антител. Описывается фармакологическая композиция на основе белка или НК в эффективном количестве с приемлемым носителем. Данная композиция предназначена для лечения инфекции, вызываемой N. meningitidis. В целях профилактики композицию используют в качестве вакцины. Использование изобретения позволяет в определенной степени преодолеть разнообразие антигенных свойств нейссерий, следствием чего является улучшение профилактики лечения и профилактики инфекции. 6 с. и 18 з.п. ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения

1. Белок, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка Neisseria meningitidis, характеризуемого аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, где указанный фрагмент включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и имеет не более 1977 аминокислот SEQ ID NO:1 и/или, по крайней мере, один фрагмент белка Neisseria meningitidis, характеризуемого аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, где указанный фрагмент включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и имеет не более 1531 аминокислот SEQ ID NO:2, при условии, что указанный белок не характеризуется ни аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, ни аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

2. Белок по п.1, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 76-85, 91-97, 102-140, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251-266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-415, 404-417, 413-416, 419-432, 440-456, 441-450, 450-452, 452-456, 464-468, 473-480, 477-487, 482-485, 482-488, 496-500, 496-511, 504-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-582, 565-567, 565-568, 570-579, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 696-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 807-809, 810-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-903, 896-899, 908-916, 919-932, 919-936, 941-947, 950-956, 951-956, 959-976, 962-975, 975-980, 979-989, 979-991, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1156-1178, 1157-1178, 1163-1167, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1217-1243, 1242-1245, 1246-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1355, 1357-1359, 1357-1360, 1362-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1395-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1421, 1425-1429, 1445-1449, 1468-1473, 1476-1485, 1491-1510, 1495-1515, 1518-1526, 1526-1529, 1532-1548, 1534-1540, 1546-1555, 1552-1556, 1557-1559, 1560-1562, 1573-1583, 1576-1583, 1580-1583, 1585-1597, 1594-1611, 1595-1607, 1604-1606, 1613-1624, 1626-1630, 1627-1635, 1629-1635, 1638-1644, 1643-1645, 1647-1665, 1649-1665, 1655-1660, 1662-1664, 1672-1674, 1677-1679, 1680-1686, 1682-1686, 1691-1694, 1700-1722, 1704-1722, 1713-1716, 1719-1729, 1724-1726, 1735-1738, 1739-1746, 1740-1746, 1752-1757, 1753-1757, 1772-1778, 1780-1783, 1790-1792, 1791-1795, 1804-1806, 1804-1808, 1817-1826, 1828-1832, 1829-1835, 1840-1851, 1841-1859, 1842-1855, 1854-1856, 1867-1886, 1871-1881, 1876-1879, 1883-1896, 1897-1903, 1898-1900, 1908-1912, 1910-1912, 1917-1922, 1920-1922, 1922-1927, 1926-1934, 1928-1930, 1934-1946, 1938-1940, 1938-1945, 1947-1957, 1948-1954, 1950-1955, 1957-1964, 1961-1968, 1962-1967 или 1974-1978 указанной SEQ ID NO:1.

3. Белок по п.1, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 91-97, 102-137, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251,266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312, 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 345-352, 348-350, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-417, 404-427, 414-416, 421-423, 425-427, 429-434, 440-456, 442-456, 465-468, 473-488, 473-494, 478-486, 496-510, 499-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-578, 565-567, 565-568, 570-578, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-665, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 697-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 806-809, 811-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-902, 896-899, 908-916, 923-932, 923-936, 941-947, 950-956, 951-959, 959-976, 961-975, 975-981, 979-989, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043, 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1157-1176, 1158-1171, 1163-1166, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1224-1243, 1247-1263, 1251-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1359, 1357-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1396-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1420, 1434-1436, 1449-1451, 1455-1460, 1468-1487, 1469-1482, 1472-1484, 1484-1486, 1497-1505, 1498-1503, 1507-1512, 1509-1515, 1510-1512, 1525-1532 или 1527-1532 указанной SEQ ID NO:2.

4. Белок по любому из пп.1-3, используемый для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

5. Белок по любому из пп.1-3, используемый для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

6. Белок по любому из пп.1-3, используемый для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

7. Белок, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 76-85, 91-97, 102-140, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251-266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312, 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-415, 404-417, 413-416, 419-432, 440-456, 441-450, 450-452, 452-456, 464-468, 473-480, 477-487, 482-485, 482-488, 496-500, 496-511, 504-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-582, 565-567, 565-568, 570-579, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 696-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 807-809, 810-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-903, 896-899, 908-916, 919-932, 919-936, 941-947, 950-956, 951-956, 959-976, 962-975, 975-980, 979-989, 979-991, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043, 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1156-1178, 1157-1178, 1163-1167, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1217-1243, 1242-1245, 1246-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1355, 1357-1359, 1357-1360, 1362-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1395-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1421, 1425-1429, 1445-1449, 1468-1473, 1476-1485, 1491-1510, 1495-1515, 1518-1526, 1526-1529, 1532-1548, 1534-1540, 1546-1555, 1552-1556, 1557-1559, 1560-1562, 1573-1583, 1576-1583, 1580-1583, 1585-1597, 1594-1611, 1595-1607, 1604-1606, 1613-1624, 1626-1630, 1627-1635, 1629-1635, 1638-1644, 1643-1645, 1647-1665, 1649-1665, 1655-1660, 1662-1664, 1672-1674, 1677-1679, 1680-1686, 1682-1686, 1691-1694, 1700-1722, 1704-1722, 1713-1716, 1719-1729, 1724-1726, 1735-1738, 1739-1746, 1740-1746, 1752-1757, 1753-1757, 1772-1778, 1780-1783, 1790-1792, 1791-1795, 1804-1806, 1804-1808, 1817-1826, 1828-1832, 1829-1835, 1840-1851, 1841-1859, 1842-1855, 1854-1856, 1867-1886, 1871-1881, 1876-1879, 1883-1896, 1897-1903, 1898-1900, 1908-1912, 1910-1912, 1917-1922, 1920-1922, 1922-1927, 1926-1934, 1928-1930, 1934-1946, 1938-1940, 1938-1945, 1947-1957, 1948-1954, 1950-1955, 1957-1964, 1961-1968, 1962-1967 или 1974-1978 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 белка Neisseria meningitidis при условии, что указанный белок не характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

8. Белок по п.7, используемый для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

9. Белок по п.7, используемый для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

10. Белок по п.7, используемый для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

11. Белок, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 91-97, 102-137, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251-266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312, 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 345-352, 348-350, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-417, 404-427, 414-416, 421-423, 425-427, 429-434, 440-456, 442-456, 465-468, 473-488, 473-494, 478-486, 496-510, 499-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-578, 565-567, 565-568, 570-578, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-665, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 697-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 806-809, 811-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-902, 896-899, 908-916, 923-932, 923-936, 941-947, 950-956, 951-959, 959-976, 961-975, 975-981, 979-989, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043, 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1157-1176, 1158-1171, 1163-1166, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1224-1243, 1247-1263, 1251-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1359, 1357-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1396-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1420, 1434-1436, 1449-1451, 1455-1460, 1468-1487, 1469-1482, 1472-1484, 1484-1486, 1497-1505, 1498-1503, 1507-1512, 1509-1515, 1510-1512, 1525-1532 или 1527-1532 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 белка Neisseria meningitidis, при условии, что указанный белок не характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

12. Белок по п.11, используемый для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

13. Белок по п.11, используемый для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

14. Белок по п.11, используемый для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

15. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-3, 7 и 11, которая характеризуется нуклеотидной последовательностью, в соответствии с генетическим кодом определяющей аминокислотную последовательность белка по любому из пп.1-3, 7 и 11.

16. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

17. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

18. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

19. Фармацевтическая композиция для лечения, профилактики или диагностики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria, включающая эффективное количество белка по любому из пп.1-3, 7 и 11 или нуклеиновой кислоты по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель.

20. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция является вакциной.

21. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция является диагностическим реагентом.

22. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция является иммуногенной композицией.

23. Композиция по п.19, используемая в качестве лекарственного средства.

24. Способ лечения инфекции, вызываемой бактериями Neisseria, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п.19.

Описание изобретения к патенту

Все цитируемые здесь документы включены в качестве ссылки во всей полноте. В частности, в данное описание включено в качестве ссылки содержимое международной заявки на патент W099/36544.

Область изобретения

Данное изобретение относится к антигенным пептидным последовательностям из бактерии Neisseria meningitidis.

На основе капсулярного полисахарида данного организма были идентифицированы 12 серологических групп N. meningitidis. Группа А является патогеном, наиболее часто причастным к эпидемическому заболеванию расположенной южнее Сахары части Африки. Серологические группы В и С являются ответственными за обширное большинство случаев в Соединенных Штатах и в большинстве развитых стран. Серологические группы W135 и Y являются ответственными за остальные случаи в Соединенных Штатах и развитых странах.

Менингококковая вакцина, используемая в настоящее время, является четырехвалентной полисахаридной вакциной, состоящей из серологических групп А, С, Y и W135. Однако менингококк В остается проблемой. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером антигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая присутствует также в ткани млекопитающих. Один подход к вакцине menB использует смеси белков наружной мембраны (ОМР). Для преодоления разнообразия антигенных свойств были сконструированы поливалентные вакцины, содержащие до девяти различных поринов [например, Poolman JT (1992) Infect. Agents Dis. 4:13-28]. Дополнительными белками для применения в вакцинах наружной мембраны были белки ора и орс, но ни один из этих подходов не смог преодолеть разнообразие антигенных свойств [например, Ala'Aldeen and Borriello (1996) Vaccine 14(1):49-53].

Изобретение

Данное изобретение относится к фрагментам белков, описанным в международной патентной заявке WO99/36544, причем данные фрагменты содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту.

Таким образом, если длина любой конкретной последовательности белка, описанной в WO99/36544, равна х аминокислотам (см. таблицу II), то данное изобретение относится к фрагментам самое большее х-1 аминокислот данного белка. Фрагмент может быть более коротким, чем эта длина (например, х-2, х-3, х-4,...) и содержит предпочтительно 100 аминокислот или менее (например, 90 аминокислот, 80 аминокислот и т.д.). Данный фрагмент может быть таким коротким, как 3 аминокислоты, но предпочтительно является более длинным (например, до 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот).

Предпочтительные фрагменты содержат менингококковые пептидные последовательности, приведенные в таблице I, или их субпоследовательности. Данные фрагменты могут быть более длинными, чем фрагменты, представленные в таблице I, например, если фрагмент в таблице I простирается от аминокислотного остатка р до остатка q белка, то данное изобретение относится также к фрагментам от остатка (р-1), (р-2) или (р-3) до остатка (q+1), (q+2) или (q+3).

Данное изобретение также относится к полипептидам, которые являются гомологичными (т.е. имеют идентичность последовательности) данным фрагментам. В зависимости от конкретного фрагмента степень идентичности является предпочтительно более высокой, чем 50% (например, 60, 70, 80, 90, 95, 99% или более). Эти гомологичные полипептиды включают мутанты и аллельные варианты данных фрагментов. Идентичность между двумя последовательностями предпочтительно определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, осуществленного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), использующего поиск аффинного пропуска с параметрами штраф за открытие пропуска = 12 и штраф за удлинение пропуска = 1.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим один или более описанных выше фрагментов.

Данное изобретение подчиняется условию, что оно не включает в его объем белки, содержащие какую-либо из 45 белковых последовательностей, описанных в WO99/36544 (т.е. четных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,..., 86, 88, 90 WO99/36544).

Белки данного изобретения могут быть, конечно, получены различными способами (например рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом и т.д.) и в различных формах (например, нативные, С-концевые и/или N-концевые слитые белки и т.д.). Их предпочтительно получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащие других белков Neisseria или белков клетки-хозяина). Короткие белки предпочтительно получают с использованием химического пептидного синтеза.

Согласно другому аспекту, данное изобретение относится к антителам, которые узнают фрагменты данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме антитела, которые узнают одну из 45 полных белковых последовательностей в WO99/36544. Данные антитела могут быть поликлональными или, предпочтительно, моноклональными и могут быть получены любыми подходящими способами.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим пептидные последовательности, распознаваемые данными антителами. Данные пептидные последовательности будут, конечно, включать фрагменты менингококковых белков в WO99/36544, но будут также включать пептиды, которые имитируют антигенную структуру менингококковых пептидов при связывании с иммуноглобулином.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей фрагменты и белки данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме нуклеиновую кислоту, кодирующую одну из 45 белковых последовательностей в WO99/36544.

Кроме того, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность последовательности) данным последовательностям. Далее, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с этими последовательностями, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, при 65°С в растворе 0,1xSSC, 0,5% ДСН).

Должно быть понятно, что данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для целей получения антисмысловых последовательностей или зондирования).

Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть, конечно, получена многочисленными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и может иметь различные формы (например, одноцепочечную форму, двухцепочечную форму, форму векторов, зондов и т.д.). Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные каркасные структуры, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности данного изобретения (например, экспрессирующие векторы), и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к композициям, содержащим белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту данного изобретения. Данные композиции могут быть применимы, например, в качестве вакцин, или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.

Данное изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, белку или антителу в соответствии с данным изобретением для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин или в качестве иммуногенных композиций) или в качестве диагностических реагентов. Оно также относится к применению нуклеиновой кислоты, белка или антитела в соответствии с данным изобретением в приготовлении: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут относиться к любому виду или штамму (например, N. gonorrhoeae), но предпочтительно являются N. meningitidis, в частности штаммом А или штаммом В.

Данное изобретение также относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела в соответствии с данным изобретением.

Согласно следующим аспектам, данное изобретение относится к различным способам.

Относится к способу получения белков данного изобретения, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с данным изобретением в условиях, обеспечивающих экспрессию белка.

Относится к способу получения белка или нуклеиновой кислоты данного изобретения, в котором белок или нуклеиновую кислоту синтезируют отчасти или полностью химическими средствами.

Относится к способу обнаружения полинуклеотидов данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования зонда нуклеиновой кислоты данного изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации для образования дуплексов и (b) детектирования указанных дуплексов.

Относится к способу обнаружения белков данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования антитела данного изобретения с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов антитело-антиген; и (b) детектирования указанных комплексов.

Краткое изложение стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (например, для использования описанных последовательностей для вакцинации или диагностических целей), следует далее. Это краткое изложение не является ограничением данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет предусматривать, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning. Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification; Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell eds 1986).

В данном описании используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патента, цитируемые здесь, включены в данное описание во всей полноте в качестве ссылки.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу общей суммы Х+Y в данной композиции составляет X. Предпочтительно, Х составляет по меньшей мере приблизительно 90% по весу общего Х+Y в данной композиции, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или даже 99% по весу.

Термин “содержащий” обозначает “включающий в себя”, а также “составляющий”, например, композиция, “содержащая” Х может состоять исключительно из Х или может включать что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин “антигенная детерминанта” включает в себя В-клеточные и Т-клеточные эпитопы.

Термин “гетерологичные” относится к двум биологическим компонентам, которые не обнаруживаются вместе в природе. Данные компоненты могут быть клетками-хозяевами, генами или регуляторными областями, такими как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, например, когда промотор, гетерологичный гену, функционально связан с данным геном. Другим примером является случай, когда менингококковая последовательность является гетерологичной мышиной клетке-хозяина. Следующим примером могли бы быть два эпитопа из одного и того же или из различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, неприродного происхождения.

“Сайт инициации репликации” является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Сайт инициации репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способная к репликации под ее собственным контролем. Сайт инициации репликации может нуждаться в векторе для репликации в конкретной клетке-хозяине. В случае некоторых сайтов инициации репликации экспрессирующий вектор может высокопродуктивно воспроизводиться в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами сайтов инициации репликации являются автономно реплицирующие последовательности, эффективные в дрожжах, и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Экспрессирующие системы

Менингококковые нуклеотидные последовательности могут экспрессироваться во многих различных экспрессирующих системах; например в системах, используемых с клетками млекопитающих, бакуловирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Экспрессирующие системы млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно помещена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, обычно расположенный на 25-30 пар оснований (п.н.) левее от сайта инициации транскрипции. Считают, что ТАТА-бокс управляет РНК-полимеразой II для начала синтеза РНК в правильном сайте. Промотор млекопитающих будет содержать также левый элемент промотора, обычно расположенный на 100-200 п.н. левее от ТАТА-бокса. Левый элемент промотора определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.].

Гены вирусов млекопитающих часто высокопродуктивно экспрессируются и имеют широкий круг хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мышей, большой поздний промотор аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, полученные не из вирусных генов, такие как мышиный ген металлотионеина, также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцибельной) в зависимости от промотора, который может индуцироваться глюкокортикоидом в гормон-чувствительных клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни экспрессии. Энхансер представляет собой регуляторную последовательность ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичными или гетерологичными промоторами, причем синтез начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены левее или правее от сайта инициации транскрипции, в нормальной или обратной ориентации, или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2nd ed.]. Энхансерные элементы, происходящие из вирусов, могут быть особенно применимы, так как они обычно имеют более широкий круг хозяев. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al (1985 EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, полученные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al.(1989b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть связана непосредственно с данной молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, N-конец может быть отщеплен от данного белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные промоторы могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством образования химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно, имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из клетки. Состоящий из трех частей лидер аденовируса является примером лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промоторными элементами фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой молекулы мРНК образуется сайт-специфическим посттранскриционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D.Hames and D.M.Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Такие последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может транслироваться в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают сигналы, полученные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным свитами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если желательно. Экспрессирующие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как в нехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Реплицирующие системы млекопитающих включают системы, произведенные из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазммды, содержащие реплицирующие системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175], или полиомавирусов, реплицируются чрезвычайно высокопродуктивно в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают репликоны, полученные из папилломавируса крупнорогатого скота и вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов млекопитающих-бактерий включают pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и рНЕВО [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от трансформируемого хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Клеточные линии млекопитающих, доступные для экспрессии, известны в данной области и включают многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS), клетки печеночно-клеточной карциномы человека (например, Нер G2), и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомых и функционально связан с регуляторными элементами в данном векторе. Конструирование вектора использует способы, которые известны в данной области. Обычно компоненты данной экспрессирующей системы включают вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, которая содержит как фрагмент генома бакуловируса, так и подходящий сайт рестрикции для инсерции гетерологичного гена или генов, которые должны экспрессироваться; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это делает возможной гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомых и среду для выращивания.

После встраивания последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, данный вектор и вирусный геном дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где данному вектору и вирусному геному дают рекомбинироваться. Экспрессируется упакованный рекомбинантный вирус и рекомбинантные стерильные пятна идентифицируют и очищают. Материалы и способы для экспрессирующих систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме наборов из, inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и во всей полноте описаны у Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (далее называемой "Summers and Smith").

Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в геном бакуловируса, описанные выше компоненты, включающие в себя промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно помещают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик, трансдуцирующий вектор). Такая конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый с его собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне (автономной единице репликации), таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время наиболее часто используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Были также сконструированы многие другие векторы, известные специалистам в данной области. Они включают, например, pVL985 (который изменяет стартовый кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI 32 п.н. правее от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Данная плазмида обычно также содержит сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (аmр) и сайт инициации репликации для отбора и размножения в Е. coii.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 5'антигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 22536783' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно находится проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Обычно эта область инициации транскрипции включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который в случае его присутствия обычно расположен дистально относительно структурного гена. Экспрессия может быть регулируемой или конститутивной.

Структурные гены, обильно транскрибируемые в последние периоды вирусного инфекционного цикла, обеспечивают особенно подходящие промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, полученные из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрин, Friesin et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression, " в: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 and 155476; и ген, кодирующий белок р10, Vlak et al. (1988), J.Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как бакуловирусный ген полиэдрина (Carbonell et al. (1988) Gene 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модификаций клеток млекопитающих (такие как сигнал расщепления пептидов, протеолитического расщепления и фосфорилирования), по-видимому, узнаются клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, сохраняются между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, лидерные последовательности (лидеры), не происходящие из насекомых, такие как лидеры, происходящие из генов, кодирующих антигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678-интерферон человека, Maeda et al. (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Labaeq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3, Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может секретироваться. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие стартовому сигналу ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут секретироваться из клетки насекомого посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в насекомых. Данный фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией данного белка в эндоплазматический ретикулум.

После инсерции ДНК-последовательности и/или гена, кодирующего продукт экспрессии, являющийся предшественником данного белка, клетку-хозяин насекомого котрансформируют гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно котрансфекцией. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно будут содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусном вирусе являются известными в данной области (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, встраивание может происходить в ген, например, ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; встраивание может происходить также в сайт рестрикционного фермента, сконструированного в желательном бакуловирусном гене. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в данном экспрессирующем векторе фланкирована как 5', так и 3'полиэдрин-специфическими последовательностями и расположена правее от промотора полиэдрина.

Новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают затем в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (между приблизительно 1% и приблизительно 5%); таким образом, большая часть данного вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, требуется способ для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимуществом данной экспрессирующей системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется чрезвычайно высокопродуктивно в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусной инфекции. Накопленный белок полиэдрин образует внутриклеточные тельца включения, которые содержат заключенные в них частицы. Тельца включения размером до 15 мкм сильно преломляют свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализировать под световом микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантным вирусом, не содержат телец включения. Чтобы отличить рекомбинантный вирус от вируса дикого типа, супернатант после трансфекции помещают для образования бляшек на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие телец включения (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие телец включения (являющееся признаком рекомбинантного вируса). "Current Protocols in Microbiology" Vol.2 (Ausubel et al. eds) d 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989).

Были разработаны рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы для инфицирования нескольких клеточных линий насекомых. Например, были сконструированы рекомбинантные бакуловирусы для, inter alia: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156 и см. в общем, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культивирования клеток являются комимерчески доступными как для прямой, так и для слитой экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток обычно известна среднему специалисту в данной области. См., например. Summers and Smith supra.

Затем модифицированные клетки насекомых могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая делает возможной стабильное сохранение плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может быть выращен до высокой плотности и экспрессия может быть индуцирована. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна непрерывно циркулировать при удалении представляющего интерес продукта и увеличении истощаемых питательных веществ. Данный продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. Соответствующим образом продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, для удаления по существу любых белков насекомых, которые также секретируются в среду или возникают вследствие лизиса клеток насекомых, чтобы обеспечить продукт, который является по меньшей мере по существу не содержащим дебриса хозяина, например белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые делают возможной экспрессию кодирующей последовательности рекомбинантного белка. Условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако данные условия могут быть легко определены средним специалистом в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существуют многочисленные системы экспрессии генов, использующие культуры растительных клеток и целые растения. Примеры систем экспрессии генов растительными клетками включают системы, описанные в таких патентах, как патент США 5693506; патент США 5659122 и патент США 5608143. Дополнительные примеры экспрессии генов в культуре клеток растений были описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме описанных выше ссылок, у Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al.. Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al.. Gene 55:353-356 (1087); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, может быть найдено у R.L.Jones and J.MacMiilin, Gibberellins: в: Advanced Plant Physiology, Malcolm B.Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессируюшую кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Данную экспрессирующую кассету встраивают в желательный экспрессирующий вектор с сопутствующими последовательностями левее и правее от экспрессирующей кассеты, подходящими для экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые свойства для вектора, чтобы данные векторы перемещали ДНК из первоначального клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательного хозяина-растение. Конструкция исходного бактериального/растительного вектора предпочтительно будет предусматривать прокариотический сайт инициации репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и для трансформации с использованием Agrobacterium Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Если гетерологичный ген не поддается простому определению, данная конструкция будет предпочтительно содержать также ген селектируемого маркера, подходящий для установления трансформации клетки растения. Общий обзор подходящих маркеров, например, для видов семейства злаковых, может быть найден у Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

Также рекомендуются последовательности, полезные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут включать транспозонные последовательности и тому подобные последовательности для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможной случайное встраивание гетерологичной экспрессирующей кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и тетрациклин. Другие последовательности ДНК, кодирующие дополнительные функции, могут также присутствовать в данном векторе, как известно в данной области.

Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть включены в экспрессирующую кассету для экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно это будет только одна экспрессирующая кассета, хотя возможны и две или большее количество экспрессирующих кассет. Рекомбинантная экспрессирующая кассета будет содержать кроме кодирующей последовательности гетерологичного белка следующие элементы: промоторную область, 5'-нетранслируемые последовательности растений, инициирующий кодон при наличии такового в данном структурном гене и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты ферментативной рестрикции на 5'- и 3'-концах данной кассеты делают возможным легкое встраивание в исходный вектор.

Гетерологичная последовательность может кодировать любой белок, относящийся к данному изобретению. Последовательность, кодирующая представляющий интерес белок, будет кодировать сигнальный пептид, который делает возможными процессинг и транслокацию данного белка при необходимости и обычно не будет содержать какой-либо последовательности, которая может приводить к связыванию желательного белка данного изобретения с мембраной. Поскольку в большинстве случаев область инициации транскрипции будет областью для гена, который экспрессируется и транслоцируется во время прорастания, посредством использования сигнального пептида, который относится к транслокации, можно также обеспечить транслокацию представляющего интерес белка. Таким путем представляющий интерес белок (белки) будут перемещаться из клеток, в которых они экспрессируются, и могут быть эффективно собраны. Обычно секреция в семенах происходит через алейроновый или щитковый слой в эндосперм семени. Хотя и не является обязательным, чтобы белок секретировался из клеток, в которых данный белок продуцируется, что облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку конечная экспрессия желательного генного продукта будет происходить в эукариотической клетке, желательно определить, содержит ли какая-либо часть клонированного гена последовательности, которые будут процессированы из последовательности в виде интронов аппаратом сплайсингосом хозяина. Если это так, может быть проведен сайт-направленный мутагенез “интронной” области для предотвращения потери части генетической матрицы в виде ложного интронного кода. Reed and Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.

Данный вектор может быть введен микроинъекцией непосредственно в клетки растений с использованием микропипеток для механического переноса рекомбинантной ДНК, Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. Генетический материал может быть также перенесен в клетку растения с использованием полиэтиленгликоля, Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Другим способом введения сегментов нуклеиновых кислот является баллистическое введение малых частиц с нуклеиновой кислотой на высокой скорости либо в матриксе небольших гранул или частиц, либо на их поверхности, Klein, et al.. Nature, 327, 70-73, 1987 и Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336, описывающие бомбардировку частицами эндоспрема ячменя для получения трансгенного ячменя. Еще одним способом введения является слияние протопластов с другими организмами или с мицеллами, клетками, лизосомами или другими сливаемыми имеющими липидную поверхность тельцами, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

Вектор может быть также введен в клетки растений электропорацией (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). В этом способе протопласты растений подвергают электропорации в присутствии плазмид, содержащих генную конструкцию. Электрические импульсы поля высокой напряженности обратимо делают мембрану проницаемой, делая возможным введение плазмид. Электропорированные растительные протопласты повторно образуют клеточную стенку, делятся и образуют растительный каллус.

Все растения, протопласты из которых могут быть выделены и культивированы с образованием целых регенерированных растений, могут быть трансформированы посредством данного изобретения таким образом, что получают целые растения, которые содержат перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, в том числе, но не только, основных видов сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощей. Некоторые подходящие растения включают, например, виды из родов Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Thifolium,

Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Средства для регенерации варьируются от вида к виду растений, но обычно получают сначала суспензию трансформированных протопластов, содержащих копии гетерологичного гена. Образуют каллусную ткань и побеги могут быть индуцированы из каллуса и затем укоренены. Альтернативно, из суспензии протопластов может быть индуцировано образование зародышей. Эти зародыши прорастают, как природные зародыши, с образованием растений. Культуральные среды обычно содержат различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокинины. Предпочтительно также добавлять к среде глутаминовую кислоту и пролин, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Побеги и корни обычно развиваются одновременно. Эффективная регенерация будет зависеть от среды, генотипа и истории культуры. Если данные три переменных контролируются, то регенерация является вполне воспроизводимой и повторяемой.

В некоторых системах культуры клеток растений желаемый белок данного изобретения может экскретироваться, или альтернативно, этот белок может быть экстрагирован из целого растения. Если желаемый белок данного изобретения секретируется в среду, он может быть собран. Альтернативно, зародыши и не содержащие зародышей половинки семян или другая ткань растения может быть механически измельчена для высвобождения любого секретируемого белка между клетками и тканями. Данная смесь может быть суспендирована в буферном растворе для извлечения растворимых белков. Затем могут быть использованы общепринятые способы выделения и очистки, применяемые для очистки рекомбинантного белка. Параметры времени, температуры, рН, кислорода и объемов должны корректироваться посредством рутинных способов для оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка.

iv. Бактериальные системы

Бактериальные способы экспрессии известны в данной области. Бактериальный промотор является любой последовательностью ДНК, способной связывать бактериальную РНК-полимераэу и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно расположена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор может также иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрываться с сайтом связывания РНК-полимеразы, в котором начинается синтез РНК. Оператор делает возможной негативно регулируемую (индуцируемую) транскрипцию, когда репрессорный белок гена может связывать оператор, и тем самым ингибировать транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута связывающей активаторный белок последовательностью гена, которая, если она присутствует, находится обычно проксимально (5') к последовательности, связывающей РНК-полимеразу. Примером активаторного белка гена является катаболитный активаторный белок (CAP), который помогает инициировать транскрипцию lac оперона у Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Таким образом, регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливающей, либо уменьшающей транскрипцию.

Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают промоторные последовательности, происходящие из ферментов, метаболизирующих сахара, такие как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] и мальтоза. Дополнительные примеры включают промоторные последовательности, происходящие из биосинтетических ферментов, таких как триптофан (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; Патент США 4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система g-лаотамазы (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes," In Interferon 3 (ed. I.Gresser)], промоторные системы бактериофага лямбда PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] и Т5 [Патент США 4689406] также обеспечивают применимые промоторные последовательности.

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного бактериального промотора или промотора бактериофага могут быть соединены с последовательностями оперона другого бактериального промотора или промотора бактериофага с образованием синтетического гибридного промотора [Патент США 4551433]. Например, промотор tac является гибридным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей как промотора trp, так и оперона lac, который регулируется репрессором lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Кроме того, бактериальный промотор может включать природные промоторы небактериального происхождения, которые способны связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Природный промотор небактериального происхождения может быть также сопряжен с совместимой РНК-полимеразой для продуцирования высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Система РНК-полимераза бактериофага Т7/промотор является примером сопряженной промоторной системы [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Кроме того, гибридный промотор может также состоять из промотора бактериофага и операторной области Е. coli (ЕР-А-0267851). Кроме функционирующей промоторной последовательности эффективный сайт связывания рибосом также применим для экспрессии чужеродных генов в прокариотах. В Е. coli сайт связывания рибосом называется последовательностью Шайна-Далгарно (3D) и он включает в себя инициирующий кодон (ATG) и последовательность длиной 3-9 нуклеотидов, расположенную на 3-11 нуклеотида левее от инициирующего кодона [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Считают, что последовательность 3D стимулирует связывание мРНК с рибосомой посредством спаривания оснований между последовательностью 3D и 3'-концом рРНК 163 Е. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and. Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)] для экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов со слабым сайтом связывания рибосом [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце будет всегда метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубированием in vitro цианогенбромидом или инкубированием in vivo или in vitro с бактериальной метионин-N-концевой пептидазой (ЕРО-А-0 219237).

Слитые белки обеспечивают альтернативу прямой экспрессии. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. Например, ген клетки бактериофага лямбда может быть присоединен на 5'-конце чужеродного гена и экспрессирован в бактериях. Полученный слитый белок предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (фактора X) для отщепления белка бактериофага от чужеродного гена [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. Слитые белки могут быть также получены с последовательностями из генов lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Alien et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Micribiol. 135:11] и Chey [EP-A-0 324 647]. Данная последовательность ДНК в месте соединения данных двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой слитый белок получают с областью убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, убиквитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Посредством этого способа может быть выделен чужеродный белок [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698].

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента последовательности сигнального пептида, который относится к секреции чужеродного белка в бактериях [Патент США 4336336]. Фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из данной клетки. Данный белок может секретироваться либо в среду для выращивания (грамположительные бактерии), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и наружной мембранами клетки (грамотрицательные бактерии). Предпочтительно, имеются сайты процессинга, которые могут расщепляться либо in vivo, либо in vitro, кодируемые между фрагментом сигнального пептида и чужеродным геном.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена из генов для секретируемых бактериальных белков, таких как ген белка наружной мембраны Е. coli (ompA) [Masui et al. (1982), в: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] и ген сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. В качестве дополнительного примера, сигнальная последовательность гена альфа-амилазы из различных штаммов Bacillus может быть использована для секреции гетерологичных белков из В. subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0244042].

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промотором фланкируют данную кодирующую последовательность. Эти последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК.

Последовательности терминации транскрипции часто включают последовательности ДНК из приблизительно 50 нуклеотидов, способные образовывать структуры петли со стеблем, которые способствуют терминации транскрипции. Примеры включают последовательности терминации транскрипции из генов с сильными промоторами, таких как ген trp в Е. coii, а также другие биосинтетические гены.

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнальную последовательность (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживают в репликоне, например, внехромосомном элементе (например, плазмидах), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерии. Репликон имеет систему репликации, позволяющую ему сохраняться в прокариотическом хозяине для экспрессии или клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть высоко- или низкопродуктивной плазмидой. Высокопродуктивная плазмида обычно будет иметь число копий в диапазоне между приблизительно 5 и приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий высокопродуктивную плазмиду, будет предпочтительно содержать по меньшей мере приблизительно 10 и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 плазмид. Может быть выбран либо высокопродуктивный вектор, либо низкопродуктивный в зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, что позволяет данному вектору интегрироваться. Интеграция, по-видимому, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичными ДНК в векторе и бактериальной хромосоме. Например, интегрирующие векторы, сконструированные с ДНК из различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (ЕР-А-0 127 328). Интегрирующие векторы могут состоять также из последовательности бактериофага или транспозона.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для отбора бактериальных штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут экспрессироваться в бактериальном хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии устойчивыми к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Селектируемые маркеры могут также включать биосинтетические гены, такие как гены в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующих векторах. Трансформирующие векторы обычно состоят из селектируемого маркера, который либо поддерживается в репликоне, либо разрабатывается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие бактерии. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы для, inter alia, следующих бактерий: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 94/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0036776, EP-A-0136829 и ЕР-А-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Патент США 4745056].

Способы введения экзогенной ДНК в бактериальных хозяев хорошо известны в данной области и обычно включают трансформацию бактерий, обработанных СаСl2 или другими агентами, такими как двухвалентные катионы и ДМСО. ДНК может быть также введена в бактериальные клетки электропорацией. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемого вида. См., например, [Masson et ai. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036 259 и EP-A-0063953; WO 94/04551, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:940, Campylobacter], [Cohen et al., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An imprived method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. В Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et ai. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173, Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, в: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et ai. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Экспрессия в дрожжах

Дрожжевые экспрессирующие системы также хорошо известны среднему специалисту в данной области. Дрожжевым промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно расположена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы ("ТАТА-бокс") и сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор может также иметь второй домен, называемый расположенной левее активаторной последовательностью (UAS), который, если он присутствует, обычно находится дистально относительно структурного гена. UAS делает возможной регулируемую (индуцируемую) экспрессию. Конститутивная экспрессия происходит в отсутствие UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливающей, либо уменьшающей транскрипцию.

Дрожжи представляют собой организм с активным метаболическим путем, таким образом, последовательности, кодирующие ферменты в данном метаболическом пути, обеспечивают особенно ценные промоторные последовательности. Примеры включают алкогольдегидрогеназу (ADH) (ЕР-А-0284044), глюкозо-6-фосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAP или GAPDH), енолазу, глюкокиназу, гексокиназу, фосфофруктокиназу, 3-фосфоглицератмутазу и пируваткиназу (РуК) (ЕР-А-0329203). Ген РНO5, кодирующий кислую фосфатазу, также относится к ценным промоторным последовательностям [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть соединены с областью активации транскрипции другого дрожжевого промотора с образованием синтетического гибридного промотора.. Примеры таких гибридных промоторов включают регуляторную последовательность ADH, присоединенную к области активации транскрипции GAP (Патенты США №4876197 и 4880734). Другие примеры гибридных промоторов включают промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, объединенных с областью активации транскрипции гена гликолитического фермента, такого как GAP или РуК (ЕР-А-0164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать природные промоторы недрожжевого происхождения, которые способны связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов включают, inter alia, промоторы, описанные [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," в: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в дрожжах. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка будет всегда метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубированием in vitro цианогенбромидом.

Слитые белки обеспечивают альтернативу экспрессирующимся системам дрожжей, а также системам млекопитающих, бакуловирусным и бактериальным экспрессирующимся системам. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии эта конструкция будет обеспечивать слияние данных двух аминокислотных последовательностей. Например, ген супероксиддисмутазы (SOD) дрожжей или человека может быть присоединен на 5'-конце чужеродного гена и экспрессирован в дрожжах. Последовательность ДНК в месте соединения данных двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. См., например, ЕР-А-0196056. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой белок получают с областью убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, убиквитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Посредством этого способа может быть выделен чужеродный белок (например, WO88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который относится к секреции чужеродного белка в дрожжах. Предпочтительно имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из данной клетки.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых дрожжевых белков, таких как ген дрожжевой инвертазы (ЕР-А-0012873; JPO, 62096086) и ген А-фактора (Патент США 4588684). Альтернативно, существуют лидеры недрожжевого происхождения, такие как лидер интерферона, которые также обеспечивают секрецию в дрожжах (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом лидеров секреции являются лидеры, которые используют ген альфа-фактора дрожжей, который содержит как “пре”-сигнальную последовательность, так и “про”-область. Типы фрагментов альфа-фактора, которые могут быть применены, включают полноразмерный пре-про-альфа-фактор (приблизительно 83 аминокислотных остатка), а также укороченные (процессированные) лидеры альфа-фактора (обычно приблизительно 25 - приблизительно 50 аминокислотных остатков) (Патенты США 4546083 и 4870008, ЕР-А-0324274). Дополнительные лидеры, использующие лидерный фрагмент альфа-фактора, который относится к секреции, включают гибридные лидеры альфа-фактора, изготовленные из пре-последовательности первых дрожжей, но про-области из альфа-фактора вторых дрожжей (например, см. WO 89/02463).

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промотором фланкируют данную кодирующую последовательность. Эти последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами последовательностей терминации являются последовательности, кодирующие гликолитические ферменты.

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживают в репликоне, например, внехромосомном элементе (например, плазмидах), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как дрожжи или бактерии. Репликон может иметь две системы репликации, позволяющие ему сохраняться, например, в дрожжах для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов дрожжи-бактерии включают YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646] и YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Кроме того, репликон может быть высоко- или низкопродуктивной плазмидой. Высокопродуктивная плазмида обычно будет иметь число копий в диапазоне между приблизительно 5 и приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий высокопродуктивную плазмиду, будет предпочтительно содержать по меньшей мере приблизительно 10 и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 плазмид. Может быть выбран либо высокопродуктивный вектор, либо низкопродуктивный в зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина. См., например. Brake et al., supra.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в дрожжевой геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную дрожжевой хромосоме, что позволяет данному вектору интегрироваться, и предпочтительно содержат две гомологичные последовательности, фланкирующие данную экспрессирующую конструкцию. Интеграция, по-видимому, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичными ДНК в векторе и дрожжевой хромосоме [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Интегрирующий вектор может быть направлен в специфический локус в дрожжах посредством выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в данный вектор. См. Orr-Weaver et al., supra. Одна или несколько экспрессирующих конструкций могут интегрироваться, возможно, влияя на уровни продуцируемого рекомбинантного белка [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Хромосомные последовательности, включенные в данный вектор, могут встречаться либо в виде единственного сегмента в векторе, что приводит к интеграции целого вектора, либо в виде двух сегментов, гомологичных соседним сегментам в хромосоме и фланкирующим экспрессирующую конструкцию в векторе, что может приводить к стабильной интеграции только экспрессирующей конструкции.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для отбора дрожжевых штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут включать биосинтетические гены, которые могут экспрессироваться в дрожжевом хозяине, такие как ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, и ALG7 и ген устойчивости G418, который придает устойчивость в дрожжевых клетках к туникамицину и G418 соответственно. Кроме того, подходящий селектируемый маркер может также обеспечивать дрожжи способностью расти в присутствии токсичных соединений, таких как металл. Например, присутствие CUP1 позволяет дрожжам расти в присутствии ионов меди [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно состоят из селектируемого маркера, который либо поддерживается в репликоне, либо разрабатывается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессируюшие и трансформирующие векторы либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие дрожжи. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы для, inter alia, следующих дрожжей: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J.Bacterial. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacterial. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Патент США No.4837148 и 4929555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J.Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach и Nurse (1981) Nature 300:706], и Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:38047] Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Способы введения экзогенной ДНК в дрожжевые хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают трансформацию либо сферопластов, либо интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемых видов дрожжей. См., например, [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Blol. 6:142; Kunze et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) No2. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J.Bacterial. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 754:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Патент США Nos. 4837148 and 4929555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153-163 Saccharomyces]; [Beach и Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Антитела

В применении здесь термин “антитело” относится к полипептиду или группе полипептидов, состоящих из по меньшей мере одного антигенсвязывающего (активного) центра. “Антигенсвязывающий сайт” представляет собой трехмерное связывающее пространство с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарными свойствам эпитопа антигена, что позволяет связывание данного антитела с данным антигеном. “Антитело” включает в себя, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, измененные антитела, одновалентные антитела, Fab-белки и антитела с единственным доменом.

Антитела против белков данного изобретения применимы для аффинной хроматографии, иммуноанализов и различения / идентификации менингококковых белков.

Антитела к белкам данного изобретения, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены общепринятыми способами. Обычно белок используют сначала для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными для получения поликлональных сывороток вследствие получаемого объема сыворотки и доступности меченых антител против иммуноглобулинов кролика и козы. Иммунизацию обычно выполняют смешиванием или эмульгированием белка в солевом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фройнда, и инъекцией данной смеси или эмульсии парентерально (обычно подкожно или внутримышечно). Доза 50-200 мкг/инъекция является обычно достаточной. Иммунизацию обычно повторяют (бустер-иммунизация) спустя 2-6 недель посредством одной или нескольких инъекций данного белка в солевом растворе, предпочтительно с использованием неполного адъюванта Фройнда. Альтернативно можно генерировать антитела иммунизацией in vitro с использованием известных в данной области способов, что для целей данного изобретения считается эквивалентным иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают отбором крови у иммунизированного животного в стеклянный или пластиковый резервуар, инкубированием крови при 25°С в течение одного часа с последующим инкубированием при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку извлекают центрифугированием (например, при 1000 g в течение 10 минут). Из кроликов может быть получено 20-50 мл за один отбор крови.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартного способа Kohler and Milstein [Nature (1975) 256:495-96] или его модификации. Обычно мышь или кролика иммунизируют, как описано выше. Однако другим, отличным от отбора крови у животного для экстракции сыворотки, является извлечение селезенки (и необязательно несколько больших лимфатических узлов) и диссоциирование ее на отдельные клетки. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифически прилипших клеток) нанесением клеточной суспензии в чашку или лунку, покрытую белковым антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуноглобулин, специфический для данного антигена, связываются с данной чашкой и не вымываются с остатком суспензии. Затем полученные В-клетки или все диссоциированные клетки селезенки индуцируют для слияния с миеломными клетками с получением гибридом и культивируют в селективной среде (например, среде с гипоксантином, аминоптерином, тимидином, “HAT”). Полученные гибридомы высевают с использованием лимитирующего разведения и анализируют на продуцирование антител, которые связываются специфически с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Затем отобранные mAb-секретирующие гибридомы культивируют либо in vitro (например, во флаконах для культуры ткани или в реакторах с полыми волокнами) или in vivo (в виде асцитов мышей).

Если желательно, антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены с использованием общепринятых способов. Подходящие метки включают флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, 32P и 125I), электроноплотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие партнеров специфического связывания. Ферменты обычно детектируют по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно детектируют по ее способности превращать 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно определяемый при помощи спектрофотометра. Термин "партнер специфического связывания" относится к белку, способному связывать молекулу лиганда с высокой специфичностью, как, например, в случае антигена и специфического для него моноклонального антитела. Другие партнеры специфического связывания включают биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не предназначено для распределения различных меток по категориям на отличающиеся классы, так как одна и та же метка может служить меткой в нескольких различных режимах. Например, 125I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электроноплотного реагента. HRP может служить в качестве фермента или в качестве антигена для mAb. Далее, можно комбинировать различные метки для желаемого эффекта. Например, mAb и авидин также необходим для метки при практическом использовании данного изобретения: таким образом, один может метить mAb биотином и детектировать его присутствие авидином, меченным 125I, или использовать mAb анти-авидином, меченным HRP. Другие перестановки и возможности будут вполне очевидными для среднего специалиста в данной области и рассматриваться как эквивалентные объему данного изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут содержать либо полипептиды, антитела, либо нуклеиновые кислоты данного изобретения. Фармацевтические композиции будут содержать терапевтически эффективное количество либо полипептидов, антител, либо полинуклеотидов заявляемого изобретения.

Термин "терапевтически эффективное количество" в применении здесь относится к количеству терапевтического агента, достаточного для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния или для выявления поддающегося обнаружению терапевтического или профилактического действия. Это действие может быть обнаружено, например, с использованием химических маркеров или уровней антигена. Терапевтические эффекты включают также ослабление физических симптомов, например понижение температуры тела. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и состояния здоровья субъекта, природы и степени тяжести состояния и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Таким образом, не имеет смысла указывать заранее точное эффективное количество. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено в ходе рутинных экспериментов и определяется лечащим врачом.

Для целей данного изобретения эффективная доза будет составлять от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг или от 0,05 до приблизительно 10 мг/кг ДНК-конструкции для индивидуума, которому ее вводят.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю для введения терапевтического агента, такого как антитела или полипептид, гены и другие терапевтические агенты. Этот термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не индуцирует продуцирование антител, вредных для индивидуума, получающего данную композицию, и который может вводиться без чрезмерной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны среднему специалисту в данной области.

Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., N.J. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющее средства или эмульгирующие агенты, буферные вещества и т.п. Обычно терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или для суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемый носитель включены также липосомы.

Способы доставки

После приготовления, композиции данного изобретения могут быть непосредственно введены субъекту. Данными субъектами, подвергающимися лечению, могут быть животные; в частности человек.

Прямая доставка данных композиций обычно выполняется инъекцией, подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в очаг. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальное, или чрескожное, введение (например, см. WO98/20734), иглы и генные пушки или гипоспреи. Схема введения доз может быть схемой применения лекарственного средства с одноразовой дозой или схемой применения лекарственного средства со множественными дозами.

Вакцины

Рассматриваемые в данном изобретении вакцины могут быть либо профилактическими (т.е. для предупрежедния инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфицирования).

Такие вакцины содержат иммунизирующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с “фармацевтически приемлемыми носителями”, которые включают любой носитель, который сам не индуцирует продуцирование антител, вредных для индивидуума, принимающего данную композицию. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны среднему специалисту в данной области. Кроме того, эти носители могут функционировать как иммуностимулирующие агенты ("адъюванты"). Далее, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид из дифтерийного, столбнячного, холерного, Н. pylori и др. патогенов.

Предпочтительные адъюванты для стимуляции эффективности композиции включают, но не ограничиваются ими: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) композиции эмульсии типа масло-в-воде (с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки, или без них), такие как, например, (a) MF59антигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678 (WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell and Newman, Plenum Press 1995), содержащий 5% сквален, 0,5% Твин 80 и 0,5% Span 85 (иногда содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя и необязательно), приготовленный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Твин 80, 5% блокированный плуроником полимер L121 и thr-MDP (см. ниже), либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный на вортексе для генерирования эмульсии частиц большего размера, и (с) система адъюванта Ribiантигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678 (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 3% сквален, 0,2% Твин 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), трегалозодимиколата (ТDМ) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detoxантигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678); (3) могут быть использованы сапониновые адъюванты, такие как Стимуловантигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678 (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), или генерируемые из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и т.д.; и (6) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для усиления эффективности композиции. Предпочтительными являются квасцы и MF59антигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678.

Указанные выше мурамилпептиды включают, но не ограничиваются ими, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1’-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

Иммуногенные композиции (например, иммунизирующий антиген/иммуноген/полипептид/белок/нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно содержат разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.д. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющее средства или эмульгирующие агенты, рН-буферящие вещества и т.п.

Обычно, терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или для суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомы для усиленного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше при рассмотрении приемлемых носителей.

Иммуногенные композиции, применяемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигенного или иммуногенного полипептидов, а также любой другой из вышеуказанных компонентов по необходимости. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества индивидууму в одноразовой дозе или в виде части дозы несколько раз является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьируется в зависимости от здоровья и физического состояния проходящего лечение индивидуума (например, примата не человека, примата и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки лечащего врача медицинской ситуации и других имеющих отношение факторов. Ожидается, что это количество будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен рутинными испытаниями.

Иммуногенные композиции обычно вводят парентерально, например, инъекцией, либо подкожно, внутримышечно, либо трансдермально/чрескожно (например, WO98/20734). Другие композиции, пригодные для других способов введения, включают пероральные и легочные композиции, суппозитории и трансдермальные применения. Схема введения лекарственного средства может быть схемой введения с одноразовой дозой или схемой введения со множественными дозами. Вакцина может вводиться в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами.

В качестве альтернативы вакцинам на основе белков, может быть использована ДНК-вакцинация [Robinson and Torres (1977) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; см. здесь ниже].

Векторы доставки генов

Векторы генной терапии для доставки конструкций, включающих в себя кодирующую последовательность терапевтического агента данного изобретения, подлежащих доставке млекопитающему для экспрессии в данном млекопитающем, могут вводиться локально (местно) или системно. Эти конструкции могут использовать вирусные или невирусные подходы в схемах введения in vivo или ex vivo. Экспрессия такой кодирующей последовательности может быть индуцирована при помощи эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может быть конститутивной или регулируемой.

Данное изобретение включает в себя векторы доставки генов, способные экспрессировать рассматриваемые последовательности нуклеиновых кислот. Вектор доставки генов является предпочтительно вирусным вектором и, более предпочтительно, ретровирусным, аденовирусным вектором, вектором на основе аденоассоциированного вируса (AAV), вируса герпеса или на основе альфа-вируса. Вирусный вектор может быть выступающим в качестве вектора астровирусом, коронавирусом, ортомиксовирусом, паповавирусом, парамиксовирусом, парвовирусом, пикорнавирусом, поксвирусом или тогавирусом. См., в общем. Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193 и Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области, и ожидается, что любой ретровирусный вектор генной терапии является применимым в данном изобретении, в том числе ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O'Neiil (1985) J. Virol. 53:160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly (1983) J. Virol. 45:291), спумавирусы и лентивирусы. См. RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Части ретровирусного вектора для генной терапии могут происходить из различных ретровирусов. Например, LTR ретровектора могут происходить из вируса мышиной саркомы, сайт связывания тРНК из вируса саркомы Рауса, сигнал упаковки из вируса мышиного лейкоза и сайт инициации синтеза второй цепи из вируса птичьего лейкоза.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для генерирования компетентных в трансдукции частиц ретровирусного вектора посредством введения их в подходящие пакующие клеточные линии (см. патент США 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы для сайт-специфической интеграции в ДНК клетки-хозяина посредством включения химерного фермента интегразы в ретровирусную частицу (см. WO96/37626). Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является дефектным по репликации рекомбинантным вирусом.

Пакующие клеточные линии, пригодные для применения с описанными выше ретровирусными векторами, хорошо известны в данной области, их легко получить (см. WO95/30763 и WO92/05266), и они могут быть использованы для создания клеточных линий-продуцентов (также называемых векторными клеточными линиями или "VCL") для получения рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно, пакующие клеточные линии получают из исходных клеток человека (например, клеток НТ1080) или исходных клеток норки, что исключает инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительные ретровирусы для конструирования ретровирусных векторов для генной терапии включают вирус птичьего лейкоза, вирус бычьего лейкоза, вирус мышиного лейкоза, индуцирующий клеточный центр (фокус) инфекции вирус норки, вирус мышиной саркомы, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы мышиного лейкоза включают 4070А и 1504 (Hartley and Rowe (1976) J. Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), Kirsten,

Harvey вирус саркомы и Rauscher (ATCC No. VR-998) и вирус мышиного лейкоза Молони (ATCC No. VR-190). Такие ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция Типовых культур ("ATCC") в Rockville, Maryland, или выделены из известных источников с использованием обычных доступных способов.

Примеры известных ретровирусных векторов генной терапии, применимые в данном изобретении, включают векторы, описанные в патентных заявках GB2200651, ЕР0415731, ЕР0345242, ЕР0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5219740, US 4405712, US 4861719, US 4980289, US 4777127, US 5591624. См. также Vile (1993) Cancer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg - 79:729-735; Mann (1983) Cel-Z 33:153; Cane (1984) Proc Naki Acad Sci 81:6349; и Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Аденовирусные векторы генной терапии человека также известны в данной области и применимы в данном изобретении. См., например, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 и Rosenfeid (1991) Science 252:431 и WO93/07283, WO93/06223 и WO93/07282. Примеры известных аденовирусных векторов генной терапии, применимые в данном изобретении, включают векторы, которые описаны в цитируемых выше ссылках и в WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO94/28938, WO95/11984, WO/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 и WO95/09654. Альтернативно, может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано у Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Векторы доставки генов данного изобретения включают также векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Основными и предпочтительными примерами таких векторов для применения в данном изобретении являются векторы на основе AAV-2, описанные у Srivastava, WO93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы содержат два инвертированных концевых повтора AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы заменой нуклеотидов, так что по меньшей мере 5 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 10 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, наиболее предпочтительно 10 нативных нуклеотидов сохраняются, а остальные нуклеотиды D-последовательности делегированы или заменены ненативными нуклеотидами. Нативные D-последовательности инвертированных концевых повторов AAV являются последовательностями из 20 последовательных нуклеотидов в каждом инвертированном концевом повторе AAV (т.е. имеется одна последовательность на каждом конце), которые не участвуют в образовании HP. Ненативный замененный нуклеотид может быть любым нуклеотидом, иным, чем нуклеотид, обнаруживаемый в нативной D-последовательности в том же положении. Другими примерами используемых векторов AAV являются pWP-19, pWN-1, оба из которых описаны у Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Другим примером такого вектора AAV является psub201 (см. Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Следующим примером вектора AAV является двойной-D ITR-вектор. Конструирование двойного-D ITR-вектора описано в патенте США 5478745. Другими векторами являются векторы, описанные Carter в Патенте США 4797368 и Muzyczka в Патенте США 5139941, Chartejee в Патенте США 5474935 и Kotin WO94/288157. Еще одним примером вектора AAV, применимого в данном изобретении, является SSV9AFABTKneo, который содержит энхансер AFP и промотор альбумина и управляет экспрессией преимущественно в печени. Его структура и конструкция описаны у Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Дополнительные векторы AAV генной терапии описаны в патенте США 5354678, патенте США 5173414, патенте США 5139941 и патенте США 5252479.

Векторы генной терапии данного изобретения включают также герпес-векторы. Основными и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, содержащие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, такой как полипептиды, описанные в патенте США 5288641 и в патенте ЕР0176170 (Roizman). Следующие примеры векторов на основе вируса простого герпеса включают HFEM/ICP6-LacZ, описанный в WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный у Geller (1988) Science 241:1667-1669 и в WO90/09441 и WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ, описанный у Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 и HSV 7134, 2 RH 105 и GAL4, описанные в ЕР 0453242 (Breakefield.), и векторы, депонированные АТСС в виде номеров доступа АТСС VR-977 и АТСС VR-260. Рассматриваются также векторы генной терапии на основе альфа-вируса, которые могут быть применены в данном изобретении. Предпочтительными векторами на основе альфа-вируса являются векторы, являющиеся вирусами Синдбиса (возбудителями лихорадки Синдбис), тогавирусы, вирусы лесов Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Миддельбурга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус Венесуэльского лошадиного энцефалита (АТСС VR923); АТСС VR-1250; АТСС VR1249; АТСС VR-532) и вирусы, описанные в патентах США 5091309, 5217879 и WO92/10578. Более конкретно, применимыми являются векторы на основе альфа-вирусов, описанные в заявке США с регистрационным номером 08/405627, поданной 15 марта 1995 года, WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, патенте США 5091309 и патенте США 5217879. Такие альфа-вирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как АТСС в Rockville, Maryland, или выделены из известных источников с использованием обычных доступных способов. Предпочтительно используют альфа-вирусы с пониженной токсичностью (см. USSN 08/679640).

Системы ДНК-векторов, такие как эукариотические слоистые экспрессирующие системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот данного изобретения. См. WO95/07994 в отношении подробного описания эукариотических слоистых экспрессирующих систем. Предпочтительно эукариотические слоистые экспрессирующие системы данного изобретения произведены из векторов на основе альфа-вируса и наиболее предпочтительно из векторов на основе вируса Синдбис.

Другие вирусные векторы для применения в данном изобретении включают векторы, произведенные из полиовируса, например, АТСС VR-58 и вирусов, описанных у Evans, Nature 339 (1989) 385 и Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; риновируса, например, АТСС VR-1110 и вирусов, описанных у Arnold (1990) J. Ceil Biochem L401; поксвирусов, таких как поксвирус канареек или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010 и вирусов, описанных у Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; в патенте США 4603112 и патенте США 4769330 и WO89/01973; вируса SV40, например, АТСС VR-305 и вирусов, описанных у Mulligan (1979) Nature 277:109 и Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; вируса гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, полученных с использованием способов обратной генетики, как описано в патенте США 5166057 и у Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802-3805; Enami and Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 и Luytjes (1989) Cell 59:110, (см. также McMichael (1963) NEJ Med 309:13 и Yap (1978) Nature 273:238 и Nature (1979) 277:108); вируса иммунодефицита человека, как описано в ЕР-0386882 и у Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; вируса кори, например, АТСС VR-67 и АТСС VR-1247 и вирусов, описанных в ЕР-0440219; вируса Aura, например, АТСС VR-368; вируса Bebaru, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; вируса Cabassou, например, например, АТСС VR-922; вируса Chikungunya, например АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; вируса форта Morgan, например, АТСС VR-924; вируса Getah, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; вируса Kyzylagach, например, АТСС VR-927; вируса Мауаго, например, АТСС VR-66; вируса Mucambo, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; вируса Ndumu, например, АТСС VR-371; вируса Pixuna, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; вируса Tonate, например, АТСС VR-925; вируса Triniti, например, АТСС VR-469; вируса Una, например, АТСС VR-374; вируса Whataroa, например, АТСС VR-926; вируса Y-62-33, например, АТСС VR-375; вируса O'Nyong, Eastern encephalitis, например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; вируса Weastern encephalitis, например, АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и коронавируса, например, АТСС VR-740, и вирусов, описанных у Нагпге (1966) Proc Soc Exp Biol Med. 121:190.

Доставка композиций данного изобретения в клетки не ограничивается указанными выше вирусными векторами. Могут применяться другие способы и среды доставки, такие как, например, экспрессирующие векторы нуклеиновых кислот, поликатионная конденсированная ДНК, связанная или не связанная только с убитым аденовирусом, например, см. заявку на патент США с регистрационным номером 08/366787, поданную 30 декабря 1994 года, и Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, связанная с лигандом ДНК, например, см. Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, клетки-носители для доставки эукариотических клеток, например, см. заявку на патент США с регистрационным номером 08/240030, поданную 9 мая 1994 года, и заявку на патент США с номером 08/404796, депонирование фотополимеризованных материалов гидрогелей, ручной пистолет для переноса генов на частицах, как описано в патенте США 5149655, ионизирующая радиация, как описано в патенте США 5206152 и в WO92/11033, нейтрализация заряда нуклеиновых кислот или слияние с клеточными мембранами. Дополнительные подходы описаны у Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 и в Woffendin (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585.

Может быть использован опосредованный частицами перенос генов, например, см. заявку США с регистрационным номером 60/023867. Кратко, последовательность может быть встроена в общепринятые векторы, которые содержат общепринятые регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубируют с молекулами переноса синтетических генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, как описано у Wu and Wu (1987) J. Biol. CHem. 262:4429-4432, инсулин, как описано у Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, галактоза, как описано у Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, лактоза или трансферрин.

Может быть также использована депротеинизированная ДНК. Примеры способов введения депротеинизированной ДНК описаны в WO 90/11092 и патенте США 5580859. Эффективность поглощения может быть улучшена с использованием биодеградируемых гранул из латекса. Покрытые ДНК гранулы из латекса эффективно транспортируются в клетки после инициации эндоцитоза данными гранулами. Данный способ может быть улучшен дополнительно обработкой гранул для увеличения гидрофобности и тем самым облегчения разрушения эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут действовать в качестве векторов доставки генов, описаны в патенте США 5422120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 и ЕР-524968. Как описано в USSN.60/023867, при невирусной доставке последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, могут быть встроены в общепринятые векторы, которые содержат общепринятые регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубированы с молекулами переноса синтетических генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. Другие системы доставки включают применение липосом для инкапсулирования ДНК, содержащей ген под контролем различных тканеспецифических или повсеместно активных промоторов. Кроме того, невирусная доставка, пригодная для использования, включает в себя механические системы доставки, такие как подход, описанный у Woffendin et al., (1944) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24):11581-11585. Кроме того, кодирующая последовательность и ее продукт экспрессии могут быть доставлены через депонирование фотополимеризованных материалов-гидрогелей. Другие общепринятые способы доставки генов, которые могут быть использованы для доставки кодирующей последовательности, включают, например, применение ручного пистолета для переноса генов на частицах, описанного в патенте США 5149655; применение ионизирующей радиации для активации перенесенного гена, как описано в патенте США 5206152 и WO92/11033.

Примерами липосомных и поликатионных векторов доставки генов являются векторы, описанные в патенте США 5422120 и 4162915; в WO 95/13796; WO94/23697 и WO91/14445; в ЕР-0524968; и в Stryer, Biochemistry, pages 236-240 (1975) W.H.Freeman, Sab Francisko; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Полинуклеотидная композиция может содержать терапевтически эффективное количество вектора генной терапии согласно определенному выше термину. Для целей данного изобретения эффективная доза будет от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг или 0,05 мг/кг - приблизительно 10 мг/кг ДНК-конструкций для индивидуума, которому их вводят.

Способы доставки

После приготовления полинуклеотидные композиции данного изобретения могут быть введены (1) непосредственно субъекту; (2) доставлены ex vivo к клеткам, полученным от данного субъекта; или (3) in vitro для экспрессии рекомбинантных белков. Субъектами для лечения могут быть млекопитающие или птицы. Субъектом для лечения может быть также человек.

Прямая доставка данных композиций обычно выполняется инъекцией, подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в повреждение. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные применения (например, см. WO98/20734), иглы и генные пистолеты или гипоспреи. Режим введения доз может быть схемой применения лекарственного средства с одноразовой дозой или схемой применения лекарственного средства со множественными дозами.

Способы для доставки ex vivo и повторной имплантации трансформированных клеток субъекту известны в данной области и описаны, например, в WO93/14778. Примеры клеток, используемых в применениях ех vivo, включают, например, стволовые клетки, в частности гемопоэтические клетки, клетки лимфы, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

Обычно доставка нуклеиновых кислот как для ех vivo, так и для in vitro применений может выполняться посредством следующих процедур, например, опосредованной декстраном трансфекции, осаждения фосфатом кальция, опосредованной полибреном трансфекции, слияния протопластов, электропорации, инкапсулирования полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямой микроинъекции ДНК в ядра, как хорошо известно в данной области.

Полинуклеотидные и полипептидные фармацевтические композиции

Кроме фармацевтически приемлемых носителей и солей, описанных выше, следующие дополнительные агенты могут быть использованы с полинуклеотидными и/или полипептидными композициями.

А. Полипептиды

Одним примером являются полипептиды, которые включают, без ограничения: асиалооромукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеиды; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Вирусные антигены, такие как белки оболочки, также могут быть использованы, а также белки из других инвазивных организмов, такие как пептид из 17 аминокислот из циркумспорозоитного белка Plasmodium falciparum, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.д.

Другими группами, которые могут быть включены, являются, например: гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тиреоидный гормон или витамины, фолиевая кислота.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.д.

Полиалкиленгликоль может также включаться с желательными полинуклеотидами/полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, могут быть включены моно-, ди- и полисахариды. В предпочтительном варианте полисахаридом является декстран или DEAE-декстран, а также хитозан и поли(сополимер лактида и гликолида).

D. Липиды и липосомы

Желательные полинуклеотиды/полипептиды могут быть также инкапсулированы в липиды или упакованы в липсомы перед доставкой субъекту или к клеткам, полученным из него.

Инкапсулирование в липиды обычно выполняют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или улавливать и удерживать нуклеиновую кислоту. Отношение конденсированного полинуклеотида к препарату липида может варьироваться, но обычно будет около 1:1 (мг ДНК:микромоль липида) или липида может быть больше. В отношении обзора применения липосом в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот см. Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Липосомные препараты для применения в данном изобретении включают катионогенные (положительно заряженные), анионогенные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Было показано, что катионогенные липосомы опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); мРНК (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); и очищенные факторы транскрипции (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), в функциональной форме.

Катионогенные липосомы являются легкодоступными. Например, содержащие N-[1-2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмоний (DOTMA) липосомы доступны под товарным названием Липофектин от Gibco BRL, Grand Island, NY. (См. также Felgner supra). Другие коммерчески доступные липосомы включают трансфектасу (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boehringer). Другие катионогенные липосомы могут быть получены из легкодоступных материалов с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; WO90/11092, в отношении описания синтеза содержащих DOTAP (1,2-бис(олеилокси)-3-триметиламмонио)пропан)липосом.

Подобным образом, анионогенные и нейтральные липосомы являются легкодоступными, например, из Avani Polar Lipids (Birmingham, AL), или могут быть легко получены с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают среди прочих фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Указанные материалы также могут быть смешаны с DOTMA и DOTAP в качестве исходных материалов в подходящих соотношениях. Способы получения липосом с использованием этих материалов хорошо известны в данной области.

Липосомы могут содержать мультиламеллярные везикулы (MLV), небольшие одноламеллярные везикулы (SUV) или большие одноламеллярные везикулы (LUV). Различные комплексы липосома-нуклеиновая кислота получают с использованием известных в данной области способов. См., например, Straubinger (1983) Meth. Iinmunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer and Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochim. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraiey (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348; Enoch and Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; и Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.

E. Липопротеиды

Кроме того, липопротеиды могут включаться с доставляемым полинуклеотидом/полипептидом. Примеры используемых липопротеидов включают: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Могут быть также использованы мутанты, фрагменты или слияния этих белков. Могут быть также использованы модификации природных липопротеидов, такие как ацетилированный LDL. Данные липопротеиды могут нацеливать доставку полинуклеотидов в клетки, экспрессирующие рецепторы липопротеидов. Предпочтительно, если липопротеиды включаются с доставляемым полинуклеотидом, то другой нацеливающий лиганд не включают в эту композицию.

Природные липопротеиды содержат липидную и белковую часть. Белковую часть называют апопротеином. В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и E. По меньшей мере два из них содержат несколько белков, обозначенных римскими цифрами AI, AII, AIV; CI, СII, CIII.

Липопротеид может содержать более одного апопротеина. Например, природные хиломикроны содержат А, В, С и E, на протяжении времени эти липопротеиды теряют А и приобретают С и Е апопротеины. VLDL содержит апопротеины А, В, С и E, LDL содержит апопротеин В; HDL содержит апопротеины А, С и Е. Аминокислотный состав этих апопротеинов известен и описан, например, у Breslow (1985) Annu Rev. Biochem. 54:699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J. Biol. Chem. 261:12918; Kane (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2465 и Utermann (1984) Hum Genet 65:232.

Липопротеиды содержат различные липиды, в том числе триглицериды, холестерин (свободный и в виде сложных эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов варьируется в природных липопротеидах. Например, хиломикроны содержат в основном триглицериды. Более подробное описание липидного содержимого природных липопротеидов может быть найдено, например, в Meth. Enzymol. 128 (1986). Состав липидов выбирают для придания апопротеину конформации, удобной для рецептор-связывающей активности. Состав липидов может быть также выбран для облегчения гидрофобного взаимодействия и ассоциации с полинуклеотид-связывающей молекулой.

Природные липопротеиды могут быть выделены из сыворотки, например, ультрацентрифугированием. Такие способы описаны в Meth. Enzymol. (supra); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 и Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Липопротеиды могут быть также получены in vitro или рекомбинантными способами экспрессией генов апопротеинов в желательной клетке-хозяине. См, например, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 и Radding (1958) Biochim. Biophys. Acta 30:443. Липопротеиды могут быть также приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Дополнительное описание липопротеидов можно найти у Zuckermann et al. WO98/06437.

F. Подикатионные агенты

Поликатионные агенты могут включаться с или без липопротеида в композицию с доставляемым полинуклеотидом/ полипептидом.

Поликатионные агенты обычно проявляют положительный заряд при физиологическом рН и способны нейтрализовать электрический заряд нуклеиновых кислот для облегчения доставки в желаемое местоположение. Эти агенты находят применение как in vitro, ex vivo, так и in vivo. Поликатионные агенты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в живой субъект внутримышечно, подкожно и т.д.

Далее приводятся примеры применимых в качестве поликатионных агентов полипептидов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другие примеры включают гистоны, протамины, человеческий сывороточный альбумин, ДНК-связывающие белки, негистоновые белки хромосом, белки оболочки из ДНК-вирусов, таких как Х174, факторы транскрипции также содержат домены, которые связывают ДНК и, следовательно, могут быть использованы в качестве конденсирующих нуклеиновые кислоты агентов. Кратко, факторы транскрипции, такие как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-i, Sp-i, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID, содержат основные домены, которые связывают ДНК-последовательности.

Органические поликатионные агенты включают: спермин, спермидин и путресцин.

Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы из перечисленного выше для конструирования других полипептидных поликатионных агентов для получения синтетических поликатионных агентов.

Синтетические поликатионные агенты, которые являются применимыми, например, DEAE-декстран, полибрен, Липофектинантигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678 и липофектАМИНантигенные менингококковые пептиды (варианты), патент № 2253678, являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы при объединении с полинуклеотидами/полипептидами.

Иммунодиагностические анализы

Менингококковые антигены данного изобретения могут быть использованы в иммуноанализах для обнаружения уровней антител (или, наооборот, анти-менингококковые антитела могут быть использованы для обнаружения уровней антигена). Иммуноанализы на основе хорошо определенных рекомбинантных антигенов могут быть разработаны для замены инвазивных диагностических способов. Антитела к менингококковым белкам могут быть обнаружены в биологических образцах, в том числе, например, образцах крови или сыворотки. Построение иммуноанализов является предметом огромного числа вариаций, и многие из них известны в данной области. Протоколы для иммуноанализа могут быть основаны, например, на конкуренции или на прямой реакции или на анализах типа сэндвич-анализов. Протоколы могут также использовать, например, твердые носители или могут выполняться с использованием иммунопреципитации. Большинство анализов включают применение меченого антитела или полипептида; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными молекулами или молекулами-красителя. Известны также анализы, которые усиливают сигналы из образца; примерами являются анализы, которые используют биотин и авидин, и меченые и опосредованные ферментами иммуноанализы, такие как анализы ELISA.

Наборы, пригодные для иммунодиагностики и содержащие подходящие меченые реагенты, созданы упаковкой подходящих материалов, в том числе композиций данного изобретения, в подходящие контейнеры вместе с остальными реагентами и материалами (например, подходящими буферами, солевыми растворами и т.д.), необходимыми для проведения анализа, а также с соответствующим набором инструкцией по проведению анализа.

Гибридизация нуклеиновых кислот

"Гибридизация" обозначает ассоциацию двух последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом посредством образования водородных связей. Обычно, одну последовательность фиксируют на твердом носителе, а другая находится в свободном виде в растворе. Затем две данные последовательности помещают для связывания друг с другом в условия, благоприятствующие образованию водородной связи. Факторы, которые влияют на образование водородных связей, включают: тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание; агенты для блокирования неспецифического присоединения последовательности жидкой фазы к твердому носителю (реагент Denhardt или BLOTTO); концентрацию последовательностей; применение соединений для увеличения скорости ассоциации последовательностей (декстрансульфат или полиэтиленгликоль); и жесткость условий промывок после гибридизации. См. Sambrook et al. [supra] Volume 2, chapter 9, pages 9.47-9.57.

“Жесткость” обозначает условия в реакции гибридизаци, которые будут способствовать связи очень сходных последовательностей в сравнении с последовательностями, которые отличаются. Например, должна быть выбрана комбинация температуры и концентрации солей, которая является на приблизительно 120-200°С ниже рассчитанной Тm исследуемого гибрида. Температура и солевые условия часто могут быть определены эмпирически в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованные на фильтрах, гибридизуют с представляющей интерес последовательностью и затем промывают в условиях различной жесткости. См. Sambrook et al. на странице 9.50.

Переменными, которые должны учитываться при проведении, например, блоттинга по Саузерну, являются (1) сложность подвергаемой блоттингу ДНК и (2) гомология между зондом и детектируемыми последовательностями. Общее количество исследуемых фрагментов может варьироваться с размахом в 10 раз, от 0,1-1 мкг для плазмиды или продукта расщепления фага до 10-9 -10-8 г на однокопийный ген в высокосложном эукариотическом геноме. Для полинуклеотидов меньшей сложности могут быть использованы существенно более короткие периоды блоттинга, гибридизации и экспозиции, меньшее количество исходных полинуклеотидов и меньшая удельная активность зондов. Например, однокопийный дрожжевой ген может быть детектирован со временем экспозиции всего лишь 1 час с 1 мкг дрожжевой ДНК в качестве исходного материала, блоттингом в течение 2 часов и гибридизацией в течение 4-8 часов с зондом 108 имп/мин/мкг. Для однокопийного гена млекопитающего консервативный подход начинался бы с 10 мкг ДНК, блоттинга в течение ночи и гибридизации в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда более 108 имп/мин/мкг при времени экспозиции ~24 часа.

Несколько факторов могут влиять на температуру плавления (Тm) ДНК-ДНК-гибрида между зондом и представляющим интерес фрагментом и вследствие этого на подходящие условия для гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд не является на 100% гомологичным фрагменту. Другие обычно встречающиеся переменные включают длину и общее содержание G+C гибридизующихся последовательностей и ионную силу и содержание формамида в буфере для гибридизации. Действия всех этих факторов могут быть тождественны одному уравнению:

Тm=81+16,6(log 10Сi)+0,4[%(G+С)]-0,6(%формамида)-600/n-1,5(%ошибочных спаривании),

где Ci обозначает концентрацию соли (одновалентных ионов), а п обозначает длину гибрида в п.н. (слегка модифицировано в сравнении с Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284).

В построении эксперимента гибридизации некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот, могут быть изменены подходящим образом. Проще всего корректировать температуру гибридизации и промывок и концентрацию соли во время промывок. Когда температура гибридизации увеличивается (т.е. увеличивается жесткость), становится менее вероятной гибридизация между цепями, которые являются негомологичными, и в результате снижается фон. Если радиоактивно меченный зонд является не полностью гомологичным иммобилизованному фрагменту (как это часто имеет место в экспериментах с семейством генов и экспериментах с межвидовой гибридизацией), то температура гибридизации должна быть уменьшена, и фон будет увеличиваться. Температура промывок влияет на интенсивность полосы гибридизации и уровень фона таким же образом. Жесткость промывок также увеличивается с уменьшением концентраций соли.

Обычно подходящими температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, который на 95-100% гомологичен фрагменту-мишени, 37°С для гомологии 90-95% и 32°С для гомологии 85-90%. Для более низких гомологий содержание формамида должно быть снижено и температура должна быть скорректирована соответственно с использованием приведенного выше уравнения. Если гомология между зондом и фрагментом-мишенью является неизвестной, то самый простой подход состоит в том, чтобы начать с гибридизации и условий промывки, которые не являются жесткими. Если после авторадиографии наблюдаются неспецифические полосы или высокий фон, фильтр можно промыть при высокой жесткости и повторно экспонировать. Если время, требуемое для экспонирования, делает этот подход непрактичным, несколько жесткостей гибридизации и/или промывки должны испытываться параллельно.

Анализы с зондами нуклеиновых кислот

Способы, такие как ПЦР, анализы с разветвленным ДНК-зондом или способы блоттинга, использующие зонды нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, могут определять присутствие кДНК или мРНК. Говорят, что зонд “гибридизуется” с последовательностью данного изобретения, если он может образовать дуплекс или двухцепочечный комплекс, который является достаточно стабильным для детектирования.

Зонды нуклеиновых кислот будут гибридизоваться с менингококковыми нуклеотидными последовательностями данного изобретения (в том числе как со смысловыми, так и с антисмысловыми цепями). Хотя многие различные нуклеотидные последовательности будут кодировать конкретную аминокислотную последовательность, нативная менингококковая последовательность является предпочтительной, так как она является истинной последовательностью, присутствующей в клетках. мРНК представляет кодирующую последовательность, и таким образом, зонд должен быть комплементарным данной кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК является комплементарной мРНК, и таким образом, кДНК-зонд должен быть комплементарным данной некодирующей последовательности.

Последовательность зонда не должна быть обязательно идентичной менингококковой последовательности (или ее комплементу) - некоторая вариация в данной последовательности и длине может приводить к повышенной чувствительности анализа, если зонд нуклеиновой кислоты может образовывать дуплекс с нуклеотидами мишени, который может быть детектирован. Зонд нуклеиновой кислоты может также включать дополнительные нуклеотиды для стабилизации образовавшегося дуплекса. Дополнительная менингококковая последовательность может быть также полезной в качестве метки для детектирования образованного комплекса. Например, некомплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена к 5'-концу зонда, причем остальная последовательность данного зонда является комплементарной менингококковой последовательности. Альтернативно, в зонд могут быть вставлены в разных местах некомплементарные основания или более длинные последовательности, при условии, что последовательность зонда является достаточно комплементарной менингококковой последовательности, чтобы гибридизоваться с ней и посредством этого образовывать дуплекс, который может быть детектирован.

Точная длина и последовательность зонда будет зависеть от условий гибридизации, таких как температура, солевые условия и т.п. Например, для диагностических применений в зависимости от сложности анализируемой последовательности зонд нуклеиновой кислоты обычно содержит по меньшей мере 10-20 нуклеотидов, предпочтительно 15-25 и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, хотя он может быть короче, чем здесь указано. Короткие праймеры обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей.

Зонды могут быть получены синтетическими процедурами, такими как триэфирный способ Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185], или согласно Urdea et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:7461], или с использованием коммерчески доступных автоматических олигонуклеотидных синтезаторов.

Химическая природа зонда может быть выбрана согласно предпочтению. Для некоторых целей удобны ДНК или РНК. Для других целей могут быть включены модификации, например, модификации скелета, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения периода полужизни in vivo, изменения РНК-аффинности, увеличения устойчивости к нуклеазам и т.д. [например, см. Agrawal and lyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387]; аналоги, такие как пептиднуклеиновые кислоты, также могут быть использованы [например, см. Соrеу (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt et ai. (1993) TIBTECH 11:384-386].

Альтернативно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является другим хорошо известным способом для обнаружения небольших количеств нуклеиновых кислот-мишеней. Этот анализ описан у Mullis et al. [Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350]; в патентах США 4683195 и 4683202. Два “праймерных” нуклеотида гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используются для праймирования реакции. Праймеры могут содержать последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью амплифицируемой мишени (или не является ее комплементом) для увеличения стабильности дуплекса или, например, для включения удобного сайта рестрикции. Обычно такая последовательность будет фланкировать желаемую менингококковую последовательность.

Термостабильная полимераза создает копии нуклеиновых кислот-мишеней из данных праймеров с использованием исходных нуклеиновых кислот-мишеней в качестве матрицы. После того как пороговое количество нуклеиновых кислот-мишеней генерируется полимеразой, они могут быть детектированы более традиционными способами, такими как Саузерн-блоты. При использовании способа блоттинга по Саузерну меченый зонд будет гибридизоваться с менингококковой последовательностью (или ее комплементом).

мРНК или кДНК могут быть также детектированы традиционными способами блоттинга, описанными у Sambrook et al. [supra]. мРНК или кДНК, генерируемая из мРНК с использованием полимеразного фермента, могут быть очищены и разделены с использованием гель-электрофореза. Затем нуклеиновые кислоты на геле подвергают блоттингу на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза. Твердую подложку подвергают действию меченого зонда и затем промывают для удаления негибридизованного зонда. Затем детектируют дуплексы, содержащие меченый зонд. Обычно зонд метят радиоактивной частью молекулы.

ПРИМЕРЫ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ФРАГМЕНТОВ

Белковые последовательности, описанные в WO99/36544, подвергали компьютерному анализу для прогнозирования антигенных пептидных фрагментов в полноразмерных белках. В этом анализе использовали три алгоритма:

- AMPHI (АМФИ) Эту программу использовали для предсказания Т-клеточных эпитопов [Gao et al. (1989) J. Immunol. 143:3007; Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retrovir 12:593; Quakyi et al. (1992) Scand J Immunol suppl. 11:9], и она доступна в Protean package of DNASTAR, Inc. (1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715 USA).

- антигенный ИНДЕКС, как описано Jameson and Wolf (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. CABIOS 4:181-186.

- ГИДРОФИЛЬНОСТЬ, как описано Норр and Woods (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. PNAS USA 78:3824-3828.

Таблица I показывает предпочтительные фрагменты белков, описанных в WO99/36544. Три алгоритма часто идентифицируют одни и те же фрагменты (например, ORF38-1 - фрагменты из остатков 37-42 и 143-146 оба идентифицированы дважды). Такие множественно-идентифицированные фрагменты являются особенно предпочтительными. Данные алгоритмы часто идентифицируют перекрывающиеся фрагменты (например, ORF40-1 - АМФИ идентифицирует остатки 161-165, а Гидрофильность идентифицировала остатки 163-175). Данное изобретение специально включает фрагменты, происходящие из комбинации этих перекрывающихся фрагментов (например, фрагмент от остатка 161 до остатка 175 в случае ORF40-1). Фрагменты, разделенные единственной аминокислотой, также часто идентифицируются (например, ORF40-1 Антигенный Индекс 423-426 и 428-438). Данное изобретение также включает в себя фрагменты, соединяющие два края таких “смежных” фрагментов (например, 423-438 для ORF40-1).

ТАБЛИЦА I - 1769 фрагментов белков, описанных в WO99/36544

Код: фрагмент #1 данной заявки является аминокислотами 6-14 ORF38-1, описанного в WO99/36544, фрагмент #2 данной заявки является аминокислотами 57-59 ORF38-1, описанного в WO99/36544, и т.д.

Фрагмент #ORF W099/36544 АлгоритмАминокислоты
1.38-1АМФИ 6-14
2.38-1 АМФИ57-59
3.38-1 АМФИ67-76
4.38-1АМФИ 92-100
5. 38-1АМФИ127-137
6.38-1 АМФИ149-166
7.38-1АМФИ 210-215
8. 38-1АМФИ231-236
9.38-1 АМФИ270-272
10.38-1АМФИ 303-320



11.
38-1 Антигенный индекс16-34
12.38-1Антигенный индекс37-42
13.38-1Антигенный индекс46-64
14.38-1Антигенный индекс72-91
15.38-1Антигенный индекс94-112
16.38-1Антигенный индекс114-117
17.38-1Антигенный индекс124-136
18.38-1Антигенный индекс143-146
19.38-1Антигенный индекс148-160
20.38-1Антигенный индекс167-195
21.38-1Антигенный индекс201-216
22.38-1Антигенный индекс218-240
23.38-1Антигенный индекс244-252
24.38-1Антигенный индекс257-278
25.38-1Антигенный индекс282-290
26.38-1Антигенный индекс308-314
27.38-1Гидрофильность 21-34
28. 38-1Гидрофильность 37-42
29. 38-1Гидрофильность 47-55
30. 38-1Гидрофильность 57-61
31. 38-1Гидрофильность 72-74
32. 38-1Гидрофильность 76-78
33. 38-1Гидрофильность 82-91
34. 38-1Гидрофильность 94-101
35. 38-1Гидрофильность 108-112
36. 38-1Гидрофильность 126-136
37. 38-1Гидрофильность 143-146
38. 38-1Гидрофильность 148-160
39. 38-1Гидрофильность 167-195
40. 38-1Гидрофильность 221-223
41. 38-1Гидрофильность 226-236
42. 38-1Гидрофильность 244-250
43. 38-1Гидрофильность 257-274

44.38-1Гидрофильность 282-286
45. 38-1Гидрофильность 311-314
46. 38аАМФИ 6-14
47.38а АМФИ57-59
48.38а АМФИ67-76
49.38аАМФИ 92-100
50. 38аАМФИ127-137
51.38а АМФИ149-166
52.38аАМФИ 210-215
53. 38аАМФИ223-225
54.38а АМФИ231-236
55.38аАМФИ 270-272
56. 38аАМФИ303-320
57.38а Антигенный индекс16-34
58.38аАнтигенный индекс37-42
59.38аАнтигенный индекс46-64
60.38аАнтигенный индекс72-91
61.38аАнтигенный индекс94-112
62.38аАнтигенный индекс114-117
63.38аАнтигенный индекс124-136
64.38аАнтигенный индекс143-146
65.38аАнтигенный индекс148-160
66.38аАнтигенный индекс165-195
67.38аАнтигенный индекс201-216
68.38аАнтигенный индекс218-240
69.38аАнтигенный индекс244-252
70.38аАнтигенный индекс257-278
71.38аАнтигенный индекс282-290
72.38аАнтигенный индекс308-314
73.38аГидрофильность 21-34
74. 38аГидрофильность 37-42
75. 38аГидрофильность 47-55
76. 38аГидрофильность 57-61

77.38аГидрофильность 72-74
78. 38аГидрофильность 76-78
79. 38аГидрофильность 82-91
80. 38аГидрофильность 94-101
81. 38аГидрофильность 108-112
82. 38аГидрофильность 126-136
83. 38аГидрофильность 143-146
84. 38аГидрофильность 148-160
85. 38аГидрофильность 165-195
86. 38аГидрофильность 221-223
87. 38аГидрофильность 226-236
88. 38аГидрофильность 244-250
89. 38аГидрофильность 257-273
90. 38аГидрофильность 282-286
91. 38аГидрофильность 311-314
92. 39-1АМФИ 6-13
93.39-1 АМФИ21-24
94.39-1 АМФИ37-40
95.39-1АМФИ 60-75
96. 39-1АМФИ118-122
97.39-1 АМФИ134-139
98.39-1АМФИ 165-183
99. 39-1АМФИ192-195
100.39-1 АМФИ233-241
101.39-1 АМФИ247-267
102.39-1АМФИ 273-275
103. 39-1АМФИ 299-308
104. 39-1АМФИ310-319
105.39-1 АМФИ322-330
106.39-1 АМФИ338-347
107.39-1АМФИ 358-364
108. 39-1АМФИ 366-368
109. 39-1АМФИ376-378

110.39-1АМФИ 385-392
111. 39-1АМФИ 413-416
112. 39-1АМФИ421-424
113.39-1 АМФИ429-438
114.39-1 АМФИ445-454
115.39-1АМФИ 456-458
116. 39-1АМФИ 498-500
117. 39-1АМФИ512-519
118.39-1 АМФИ576-587
119.39-1 АМФИ589-600
120.39-1АМФИ 650-652
121. 39-1АМФИ 670-674
122. 39-1Антигенный индекс 26-32
123. 39-1Антигенный индекс 35-45
124. 39-1Антигенный индекс 54-69
125. 39-1Антигенный индекс 79-84
126. 39-1Антигенный индекс 88-96
127. 39-1Антигенный индекс 105-110
128. 39-1Антигенный индекс 117-124
129. 39-1Антигенный индекс 152-154
130. 39-1Антигенный индекс 190-192
131. 39-1Антигенный индекс 222-231
132. 39-1Антигенный индекс 246-265
133. 39-1Антигенный индекс 292-295
134. 39-1Антигенный индекс 318-335
135. 39-1Антигенный индекс 353-362
136. 39-1Антигенный индекс 370-372
137. 39-1Антигенный индекс 402-404
138. 39-1Антигенный индекс 406-408
139. 39-1Антигенный индекс 419-421
140. 39-1Антигенный индекс 446-449
141. 39-1Антигенный индекс 453-460
142. 39-1Антигенный индекс 465-469

143.39-1Антигенный индекс476-487
144.39-1Антигенный индекс491-499
145.39-1Антигенный индекс505-514
146.39-1Антигенный индекс522-536
147.39-1Антигенный индекс557-567
148.39-1Антигенный индекс569-575
149.39-1Антигенный индекс577-580
150.39-1Антигенный индекс593-599
151.39-1Антигенный индекс603-619
152.39-1Антигенный индекс626-628
153.39-1Антигенный индекс634-637
154.39-1Антигенный индекс639-647
155.39-1Антигенный индекс655-658
156.39-1Антигенный индекс672-674
157.39-1Антигенный индекс677-686
158.39-1Антигенный индекс688-691
159.39-1Антигенный индекс693-699
160.39-1Антигенный индекс707-710
161.39-1Гидрофильность 28-32
162. 39-1Гидрофильность 38-44
163. 39-1Гидрофильность 54-69
164. 39-1Гидрофильность 80-83
165. 39-1Гидрофильность 89-96
166. 39-1Гидрофильность 117-119
167. 39-1Гидрофильность 121-123
168. 39-1Гидрофильность 152-154
169. 39-1Гидрофильность 224-231
170. 39-1Гидрофильность 247-265
171. 39-1Гидрофильность 318-332
172. 39-1Гидрофильность 357-361
173. 39-1Гидрофильность 402-404
174. 39-1Гидрофильность 406-408
175. 39-1Гидрофильность 446-449

176.39-1Гидрофильность 454-459
177. 39-1Гидрофильность 465-469
178. 39-1Гидрофильность 476-487
179. 39-1Гидрофильность 491-499
180. 39-1Гидрофильность 506-514
181. 39-1Гидрофильность 525-535
182. 39-1Гидрофильность 560-567
183. 39-1Гидрофильность 573-575
184. 39-1Гидрофильность 577-580
185. 39-1Гидрофильность 594-596
186. 39-1Гидрофильность 605-607
187. 39-1Гидрофильность 611-619
188. 39-1Гидрофильность 634-637
189. 39-1Гидрофильность 639-647
190. 39-1Гидрофильность 672-674
191. 39-1Гидрофильность 677-686
192. 39-1Гидрофильность 688-690
193. 39-1Гидрофильность 693-695
194. 39аАМФИ 6-13
195. 39аАМФИ21-24
196.39а АМФИ37-40
197.39аАМФИ 60-75
198. 39аАМФИ118-122
199.39а АМФИ134-139
200.39аАМФИ 165-183
201. 39аАМФИ192-195
202.39а АМФИ233-241
203.39аАМФИ 247-267
204. 39аАМФИ273-275
205.39а АМФИ299-308
206.39аАМФИ 310-319
207. 39аАМФИ322-330
208.39а АМФИ338-347

209.39аАМФИ 358-364
210. 39аАМФИ366-368
211.39а АМФИ376-378
212.39аАМФИ 385-392
213. 39аАМФИ413-416
214.39а АМФИ421-424
215.39аАМФИ 429-438
216. 39аАМФИ445-454
217.39а АМФИ456-458
218.39аАМФИ 498-500
219. 39аАМФИ512-520
220.39а АМФИ576-587
221.39аАМФИ 589-600
222. 39аАМФИ650-652
223.39а АМФИ670-674
224.39аАнтигенный индекс26-32
225.39аАнтигенный индекс35-45
226.39аАнтигенный индекс54-69
227.39аАнтигенный индекс79-84
228.39аАнтигенный индекс89-96
229.39аАнтигенный индекс103-110
230.39аАнтигенный индекс117-124
231.39аАнтигенный индекс152-154
232.39аАнтигенный индекс190-192
233.39аАнтигенный индекс222-231
234.39аАнтигенный индекс246-265
235.39аАнтигенный индекс292-295
236.39аАнтигенный индекс318-335
237.39аАнтигенный индекс353-362
238.39аАнтигенный индекс370-372
239.39аАнтигенный индекс402-404
240.39аАнтигенный индекс406-408
241.39аАнтигенный индекс419-421

242.39аАнтигенный индекс446-449
243.39аАнтигенный индекс453-460
244.39аАнтигенный индекс465-469
245.39аАнтигенный индекс476-487
246.39аАнтигенный индекс491-499
247.39аАнтигенный индекс505-514
248.39аАнтигенный индекс529-535
249.39аАнтигенный индекс557-567
250.39аАнтигенный индекс569-575
251.39аАнтигенный индекс577-580
252.39аАнтигенный индекс593-599
253.39аАнтигенный индекс603-619
254.39аАнтигенный индекс626-628
255.39аАнтигенный индекс634-637
256.39аАнтигенный индекс639-647
257.39аАнтигенный индекс655-658
258.39аАнтигенный индекс672-674
259.39аАнтигенный индекс677-686
260.39аАнтигенный индекс688-691
261.39аАнтигенный индекс693-699
262.39аАнтигенный индекс707-710
263.39аГидрофильность 28-32
264. 39аГидрофильность 38-44
265. 39аГидрофильность 54-69
266. 39аГидрофильность 80-83
267. 39аГидрофильность 89-95
268. 39аГидрофильность 105-108
269. 39аГидрофильность 117-119
270. 39аГидрофильность 121-123
271. 39аГидрофильность 152-154
272. 39аГидрофильность 224-231
273. 39аГидрофильность 247-265
274. 39аГидрофильность 318-332

275.39аГидрофилы-юсть 357-361
276. 39аГидрофильность 402-404
277. 39аГидрофильность 406-408
278. 39аГидрофильность 446-449
279. 39аГидрофильность 454-459
280. 39аГидрофильность 465-469
281. 39аГидрофильность 476-487
282. 39аГидрофильность 491-499
283. 39аГидрофильность 506-514
284. 39аГидрофильность 525-535
285. 39аГидрофильность 560-567
286. 39аГидрофильность 573-575
287. 39аГидрофильность 577-580
288. 39аГидрофильность 594-596
289. 39аГидрофильность 605-607
290. 39аГидрофильность 611-619
291. 39аГидрофильность 634-637
292. 39аГид рофил ьность 639-647
293. 39аГидрофильность 672-674
294. 39аГид рофил ьность 677-686
295. 39аГидрофильность 688-690
296. 39аГидрофильность 693-695
297. 40-1АМФИ 6-14
298. 40-1АМФИ16-19
299.40-1 АМФИ22-27
300.40-1 АМФИ30-33
301.40-1АМФИ 41-44
302. 40-1АМФИ 62-68
303. 40-1АМФИ129-139
304.40-1 АМФИ161-165
305.40-1 АМФИ181-191
306.40-1АМФИ 199-202
307. 40-1АМФИ 215-220

308.40-1АМФИ 237-249
309. 40-1АМФИ 298-302
310. 40-1АМФИ313-318
311.40-1 АМФИ335-342
312.40-1 АМФИ376-383
313.40-1АМФИ 399-402
314. 40-1АМФИ 426-428
315. 40-1АМФИ430-433
316.40-1 АМФИ435-437
317.40-1 АМФИ479-482
318.40-1АМФИ 491-511
319. 40-1АМФИ 523-525
320. 40-1АМФИ560-563
321.40-1 Антигенный индекс21-32
322.40-1 Антигенный индекс 49-61
323. 40-1Антигенный индекс 64-66
324. 40-1Антигенный индекс 74-92
325. 40-1Антигенный индекс 98-123
326. 40-1Антигенный индекс 129-135
327. 40-1Антигенный индекс 138-176
328. 40-1Антигенный индекс 193-195
329. 40-1Антигенный индекс 199-219
330. 40-1Антигенный индекс 226-240
331. 40-1Антигенный индекс 242-245
332. 40-1Антигенный индекс 251-257
333. 40-1Антигенный индекс 261-276
334. 40-1Антигенный индекс 279-306
335. 40-1Антигенный индекс 308-346
336. 40-1Антигенный индекс 352-367
337. 40-1Антигенный индекс 375-378
338. 40-1Антигенный индекс 384-406
339. 40-1Антигенный индекс 408-420
340. 40-1Антигенный индекс 423-426

341.40-1Антигенный индекс428-438
342.40-1Антигенный индекс553-459
343.40-1Антигенный индекс462-481
344.40-1Антигенный индекс485-494
345.40-1Антигенный индекс506-518
346.40-1Антигенный индекс535-539
347.40-1Антигенный индекс544-552
348.40-1Антигенный индекс559-566
349.40-1Антигенный индекс571-582
350.40-1Гидрофильность 21-32
351. 40-1Гидрофильность 51-61
352. 40-1Гидрофильность 64-66
353. 40-1Гидрофильность 75-92
354. 40-1Гидрофильность 100-122
355. 40-1Гидрофильность 129-135
356. 40-1Гидрофильность 140-145
357. 40-1Гидрофильность 149-152
358. 40-1Гидрофильность 157-161
359. 40-1Гидрофильность 163-175
360. 40-1Гидрофильность 199-201
361. 40-1Гидрофильность 203-219
362. 40-1Гидрофильность 227-240
363. 40-1Гидрофильность 251-257
364. 40-1Гидрофильность 261-276
365. 40-1Гидрофильность 279-306
366. 40-1Гидрофильность 308-318
367. 40-1Гидрофильность 320-328
368. 40-1Гидрофильность 334-341
369. 40-1Гидрофильность 354-356
370. 40-1Гидрофильность 359-366
371. 40-1Гидрофильность 392-398
372. 40-1Гидрофильность 400-405
373. 40-1Гидрофильность 410-420

374.40-1Гидрофильность 429-438
375. 40-1Гидрофильность 463-467
376. 40-1Гидрофильность 471-480
377. 40-1Гидрофильность 487-493
378. 40-1Гидрофильность 506-518
379. 40-1Гидрофильность 547-552
380. 40-1Гидрофильность 575-579
381. 40аАМФИ 6-10
382. 40аАМФИ19-27
383.40а АМФИ30-33
384.40аАМФИ 41-44
385. 40аАМФИ61-72
386.40а АМФИ78-81
387.40аАМФИ 92-94
388. 40аАМФИ128-130
389.40а АМФИ132-134
390.40аАМФИ 161-165
391. 40аАМФИ181-193
392.40а АМФИ197-199
393.40аАМФИ 204-211
394. 40аАМФИ213-218
395.40а АМФИ227-229
396.40аАМФИ 237-249
397. 40аАМФИ298-302
398.40а АМФИ313-318
399.40аАМФИ 335-342
400. 40аАМФИ376-383
401.40а АМФИ399-402
402.40аАМФИ 426-428
403. 40аАМФИ435-437
404.40а АМФИ475-483
405.40аАМФИ 492-512
406. 40аАМФИ524-526

407.40аАМФИ 561-564
408. 40аАнтигенный индекс 21-34
409. 40аАнтигенный индекс 50-64
410. 40аАнтигенный индекс 75-83
411. 40аАнтигенный индекс 88-97
412. 40аАнтигенный индекс 105-122
413. 40аАнтигенный индекс 129-134
414. 40аАнтигенный индекс 140-176
415. 40аАнтигенный индекс 190-207
416. 40аАнтигенный индекс 211-217
417. 40аАнтигенный индекс 224-240
418. 40аАнтигенный индекс 242-245
419. 40аАнтигенный индекс 250-255
420. 40аАнтигенный индекс 260-276
421. 40аАнтигенный индекс 279-306
422. 40аАнтигенный индекс 308-346
423. 40аАнтигенный индекс 352-367
424. 40аАнтигенный индекс 375-378
425. 40аАнтигенный индекс 384-406
426. 40аАнтигенный индекс 408-420
427. 40аАнтигенный индекс 423-438
428. 40аАнтигенный индекс 453-468
429. 40аАнтигенный индекс 471-481
430. 40аАнтигенный индекс 487-493
431. 40аАнтигенный индекс 507-519
432. 40аАнтигенный индекс 536-540
433. 40аАнтигенный индекс 545-553
434. 40аАнтигенный индекс 560-567
435. 40аАнтигенный индекс 572-583
436. 40аГидрофильность 21-34
437. 40аГидрофильность 50-64
438. 40аГидрофильность 75-83
439. 40аГидрофильность 88-96

440.40аГидрофильность 105-121
441. 40аГидрофильность 129-134
442. 40аГидрофильность 140-145
443. 40аГидрофильность 148-155
444. 40аГидрофильность 157-161
445. 40аГидрофильность 163-175
446. 40аГидрофильность 196-202
447. 40аГидрофильность 211-217
448. 40аГидрофильность 225-230
449. 40аГидрофильность 232-240
450. 40аГидрофильность 253-255
451. 40аГидрофильность 261-276
452. 40аГидрофильность 279-306
453. 40аГидрофильность 308-318
454. 40аГидрофильность 320-328
455. 40аГидрофильность 334-341
456. 40аГидрофильность 354-356
457. 40аГидрофильность 359-366
458. 40аГидрофильность 392-398
459. 40аГидрофильность 400-405
460. 40аГидрофильность 410-420
461. 40аГидрофильность 428-438
462. 40аГидрофильность 462-468
463. 40аГидрофильность 472-481
464. 40аГидрофильность 489-493
465. 40аГидрофильность 507-519
466. 40аГидрофильность 548-553
467. 40аГидрофильность 576-580
468. 41-1АМФИ 30-36
469. 41-1АМФИ93-98
470.41-1 АМФИ111-122
471.41-1 АМФИ126-129
472.41-1АМФИ 136-143

473.41-1АМФИ 145-150
474. 41-1АМФИ 156-158
475. 41-1АМФИ186-195
476.41-1 АМФИ201-208
477.41-1 АМФИ213-223
478.41-1АМФИ 236-247
479. 41-1АМФИ 250-255
480. 41-1АМФИ273-282
481.41-1 АМФИ303-309
482.41-1 АМФИ311-314
483.41-1АМФИ 329-338
484. 41-1АМФИ 344-362-
485. 41-1АМФИ372-377
486.41-1 АМФИ385-392
48741-1 АМФИ409-412
488.41-1АМФИ 419-426
489. 41-1АМФИ 458-463
490. 41-1АМФИ470-474
491.41-1 АМФИ486-489
492.41-1 АМФИ512-518
493.41-1АМФИ 527-551
494. 41-1АМФИ 564-579
495. 41-1АМФИ593-597
496.41-1 Антигенный индекс13-22
497.41-1 Антигенный индекс 30-38
498. 41-1Антигенный индекс 43-55
499. 41-1Антигенный индекс 73-75
500. 41-1Антигенный индекс 87-89
501. 41-1Антигенный индекс 105-112
502. 41-1Антигенный индекс 114-124
503. 41-1Антигенный индекс 136-141
504. 41-1Антигенный индекс 147-153
505. 41-1Антигенный индекс 163-166

506.41-1Антигенный индекс174-184
507.41-1Антигенный индекс195-207
508.41-1Антигенный индекс226-236
509.41-1Антигенный индекс244-246
510.41-1Антигенный индекс249-265
511.41-1Антигенный индекс281-287
512.41-1Антигенный индекс294-313
513.41-1Антигенный индекс317-342
514.41-1Антигенный индекс350-375
515.41-1Антигенный индекс379-386
516.41-1Антигенный индекс390-396
517.41-1Антигенный индекс413-422
518.41-1Антигенный индекс425-430
519.41-1Антигенный индекс436-440
520.41-1Антигенный индекс446-465
521.41-1Антигенный индекс468-495
522.41-1Антигенный индекс498-518
523.41-1Антигенный индекс520-522
524.41-1Антигенный индекс525-542
525.41-1Антигенный индекс547-558
526.41-1Антигенный индекс565-590
527.41-1Антигенный индекс595-602
528.41-1Антигенный индекс608-619
529.41-1Гидрофильность 14-21
530. 41-1Гидрофильность 30-33
531. 41-1Гидрофильность 45-55
532. 41-1Гидрофильность 87-89
533. 41-1Гидрофильность 106-111
534. 41-1Гидрофильность 114-120
535. 41-1Гидрофильность 122-124
536. 41-1Гидрофильность 136-141
537. 41-1Гидрофильность 148-150
538. 41-1Гидрофильность 177-184

539.41-1Гидрофильность 195-207
540. 41-1Гидрофильность 226-234
541. 41-1Гидрофильность 249-265
542. 41-1Гидрофильность 285-287
543. 41-1Гидрофильность 294-297
544. 41-1Гидрофильность 299-313
545. 41-1Гидрофильность 317-321
546. 41-1Гидрофильность 323-342
547. 41-1Гидрофильность 350-371
548. 41-1Гидрофильность 379-386
549. 41-1Гидрофильность 417-422
550. 41-1Гидрофильность 425-427
551. 41-1Гидрофильность 447-449
552. 41-1Гидрофильность 459-462
553. 41-1Гидрофильность 468-475
554. 41-1Гидрофильность 479-482
555. 41-1Гидрофильность 484-491
556. 41-1Гидрофильность 499-518
557. 41-1Гидрофильность 520-522
558. 41-1Гидрофильность 526-542
559. 41-1Гидрофильность 550-558
560. 41-1Гидрофильность 568-590
561. 41-1Гидрофильность 595-598
562. 41-1Гидрофильность 617-619
563. 41аАМФИ 6-12
564. 41аАМФИ32-34
565.41а АМФИ69-74
566.41аАМФИ 86-98
567. 41аАМФИ111-119
568.41а АМФИ121-126
569.41аАМФИ 132-134
570. 41аАМФИ155-160
571.41а АМФИ162-171

572.41аАМФИ 177-184
573. 41аАМФИ189-199
574.41а АМФИ212-223
575.41аАМФИ 226-231
576. 41аАМФИ249-258
577.41а АМФИ287-290
578.41аАМФИ 305-314
579. 41аАМФИ320-338
580.41а АМФИ348-353
581.41аАМФИ 361-368
582. 41аАМФИ385-388
583.41а АМФИ395-402
584.41аАМФИ 434-439
585. 41аАМФИ446-450
586.41а АМФИ462-467
587.41аАМФИ 470-475
588. 41аАМФИ488-494
589.41а АМФИ503-525
590.41аАМФИ 540-555
591. 41аАМФИ569-573
592.41а АМФИ578-594
593.41аАнтигенный индекс10-13
594.41аАнтигенный индекс19-31
595.41аАнтигенный индекс48-50
596.41аАнтигенный индекс63-65
597.41аАнтигенный индекс82-101
598.41аАнтигенный индекс112-117
599.41аАнтигенный индекс123-129
600.41аАнтигенный индекс139-142
601.41аАнтигенный индекс150-160
602.41аАнтигенный индекс171-183
603.41аАнтигенный индекс202-212
604.41аАнтигенный индекс220-222

605.41аАнтигенный индекс225-241
606.41аАнтигенный индекс257-263
607.41аАнтигенный индекс270-289
608.41аАнтигенный индекс293-318
609.41аАнтигенный индекс326-351
610.41аАнтигенный индекс355-362
611.41аАнтигенный индекс366-372
612.41аАнтигенный индекс389-398
613.41аАнтигенный индекс401-406
614.41аАнтигенный индекс412-416
615.41аАнтигенный индекс422-441
616.41аАнтигенный индекс444-446
617.41аАнтигенный индекс451-471
618.41аАнтигенный индекс475-494
619.41аАнтигенный индекс496-498
620.41аАнтигенный индекс501-518
621.41аАнтигенный индекс523-534
622.41аАнтигенный индекс540-566
623.41аАнтигенный индекс571-578
624.41аАнтигенный индекс582-595
625.41аГидрофильность 21-31
626. 41аГидрофильность 63-65
627. 41аГидрофильность 83-96
628. 41аГидрофильность 98-100
629. 41аГидрофильность 112-117
630. 41аГидрофильность 124-126
631. 41аГидрофильность 153-160
632. 41аГидрофильность 171-183
633. 41аГидрофильность 202-210
634. 41аГидрофильность 220-222
635. 41аГидрофильность 225-241
636. 41аГидрофильность 261-263
637. 41аГидрофильность 270-273

638.41аГидрофильность 275-289
639. 41аГидрофильность 293-297
640. 41аГидрофильность 299-318
641. 41аГидрофильность 326-347
642. 41аГидрофильность 355-362
643. 41аГидрофильность 393-398
644. 41аГидрофильность 401-403
645. 41аГидрофильность 423-425
646. 41аГидрофильность 435-438
647. 41аГидрофильность 454-458
648. 41аГидрофильность 460-471
649. 41аГидрофильность 475-494
650. 41аГидрофильность 496-498
651. 41аГидрофильность 502-518
652. 41аГидрофильность 527-534
653. 41аГидрофильность 544-566
654. 41аГидрофильность 571-574
655. 41аГидрофильность 593-595
656. 44-1АМФИ 57-60
657. 44-1АМФИ76-79
658.44-1 Антигенный индекс22-34
659.44-1 Антигенный индекс 38-46
660. 44-1Антигенный индекс 50-55
661. 44-1Антигенный индекс 64-70
662. 44-1Антигенный индекс 72-80
663. 44-1Антигенный индекс 83-89
664. 44-1Антигенный индекс 96-106
665. 44-1Антигенный индекс 110-124
666. 44-1Гидрофильность 22-34
667. 44-1Гидрофильность 40-46
668. 44-1Гидрофильность 64-69
669. 44-1Гидрофильность 73-80
670. 44-1Гидрофильность 84-89

671.44-1Гидрофильность 97-106
672. 44-1Гидрофильность 120-124
673. 44аАМФИ 57-60
674. 44аАМФИ76-79
675.44а Антигенный индекс23-34
676.44аАнтигенный индекс38-46
677.44аАнтигенный индекс50-55
678.44аАнтигенный индекс64-70
679.44аАнтигенный индекс72-80
680.44аАнтигенный индекс83-89
681.44аАнтигенный индекс96-106
682.44аАнтигенный индекс110-124
683.44аГидрофильность 28-34
684. 44аГидрофильность 40-46
685. 44аГидрофильность 64-69
686. 44аГидрофильность 73-80
687. 44аГидрофильность 84-89
688. 44аГидрофильность 97-106
689. 44аГидрофильность 120-124
690. 49-1АМФИ 16-21
691. 49-1АМФИ44-48
692.49-1 АМФИ56-61
693.49-1 АМФИ92-97
694.49-1АМФИ 118-127
695. 49-1АМФИ 130-149
696. 49-1АМФИ156-178
697.49-1 АМФИ235-240
698.49-1 АМФИ253-264
699.49-1АМФИ 268-271
700. 49-1АМФИ 278-285
701. 49-1АМФИ287-292
702.49-1 АМФИ298-300
703.49-1 АМФИ328-337

704.49-1АМФИ 343-350
705. 49-1АМФИ 355-365
706. 49-1АМФИ378-389
707.49-1 АМФИ422-424
708.49-1 АМФИ442-450
709.49-1АМФИ 464-481
710. 49-1АМФИ 486-496
711. 49-1АМФИ514-521
712.49-1 АМФИ548-551
713.49-1 АМФИ553-557
714.49-1АМФИ 562-568
715. 49-1АМФИ 573-575
716. 49-1АМФИ588-590
717.49-1 АМФИ603-605
718.49-1 АМФИ614-618
719.49-1Антигенный индекс15-21
720.49-1Антигенный индекс26-43
721.49-1Антигенный индекс50-59
722.49-1Антигенный индекс61-75
723.49-1Антигенный индекс79-87
724.49-1Антигенный индекс98-108
725.49-1Антигенный индекс110-120
726.49-1Антигенный индекс122-139
727.49-1Антигенный индекс147-164
728.49-1Антигенный индекс171-179
729.49-1Антигенный индекс185-197
730.49-1Антигенный индекс214-216
731.49-1Антигенный индекс229-231
732.49-1Антигенный индекс248-266
733.49-1Антигенный индекс278-283
734.49-1Антигенный индекс289-295
735.49-1Антигенный индекс316-326
736.49-1Антигенный индекс337-349

737.49-1Антигенный индекс368-378
738.49-1Антигенный индекс386-388
739.49-1Антигенный индекс390-410
740.49-1Антигенный индекс412-414
741.49-1Антигенный индекс423-429
742.49-1Антигенный индекс438-454
743.49-1Антигенный индекс462-475
744.49-1Антигенный индекс482-500
745.49-1Антигенный индекс503-509
746.49-1Антигенный индекс521-528
747.49-1Антигенный индекс540-562
748.49-1Антигенный индекс572-579
749.49-1Антигенный индекс590-606
750.49-1Антигенный индекс610-612
751.49-1Антигенный индекс617-619
752.49-1Антигенный индекс626-634
753.49-1Антигенный индекс637-640
754.49-1Гидрофильность 18-21
755. 49-1Гидрофильность 26-29
756. 49-1Гидрофильность 31-43
757. 49-1Гидрофильность 51-57
758. 49-1Гидрофильность 64-68
759. 49-1Гидрофильность 79-87
760. 49-1Гидрофильность 98-107
761. 49-1Гидрофильность 122-125
762. 49-1Гидрофильность 147-164
763. 49-1Гидрофильность 172-175
764. 49-1Гидрофильность 187-197
765. 49-1Гидрофильность 229-231
766. 49-1Гидрофильность 256-262
767. 49-1Гидрофильность 264-266
768. 49-1Гидрофильность 278-283
769. 49-1Гидрофильность 290-292

770.49-1Гидрофильность 319-326
771. 49-1Гидрофильность 337-349
772. 49-1Гидрофильность 368-376
773. 49-1Гидрофильность 386-388
774. 49-1Гидрофильность 390-410
775. 49-1Гидрофильность 412-414
776. 49-1Гидрофильность 423-429
777. 49-1Гидрофильность 441-451
778. 49-1Гидрофильность 446-472
779. 49-1Гидрофильность 484-490
780. 49-1Гидрофильность 492-494
781. 49-1Гидрофильность 496-498
782. 49-1Гидрофильность 522-528
783, 49-1Гидрофильность 543-562
784. 49-1Гидрофильность 591-606
785. 49-1Гидрофильность 617-619
786. 49-1Гидрофильность 626-632
787. 49-1Гидрофильность 637-640
788. 49аАМФИ 55-61
789. 49аАМФИ92-97
790.49а АМФИ118-127
791.49аАМФИ 129-135
792. 49аАМФИ137-145
793.49а АМФИ156-178
794.49аАМФИ 198-200
795. 49аАМФИ235-240
796.49а АМФИ252-264
797.49аАМФИ 277-285,
798. 49аАМФИ287-292
799.49а АМФИ298-300
800.49аАМФИ 321-326
801. 49аАМФИ328-337
802.49а АМФИ343-350

803.49аАМФИ 355-365
804. 49аАМФИ378-389
805.49а АМФИ392-397
806.49аАМФИ 415-424
807. 49аАМФИ453-456
808.49а АМФИ471-480
809.49аАМФИ 486-504
810. 49аАМФИ514-519
811.49а АМФИ527-534
812.49аАМФИ 551-554
813. 49аАМФИ561-568
814.49а АМФИ600-605
815.49аАМФИ 612-616
816. 49аАМФИ628-633
817.49а АМФИ636-641
818.49аАМФИ 654-660
819. 49аАМФИ669-691
820.49а АМФИ706-721
821.49аАМФИ 735-739
822. 49аАМФИ744-760
823.49а Антигенный индекс4-23
824.49аАнтигенный индекс27-43
825.49аАнтигенный индекс51-62
826.49аАнтигенный индекс64-68
827.49аАнтигенный индекс72-75
828.49аАнтигенный индекс79-87
829.49аАнтигенный индекс98-108
830.49аАнтигенный индекс110-120
831.49аАнтигенный индекс124-139
832.49аАнтигенный индекс147-164
833.49аАнтигенный индекс176-179
834.49аАнтигенный индекс185-197
835.49аАнтигенный индекс214-216

836.49аАнтигенный индекс229-231
837.49аАнтигенный индекс248-267
838.49аАнтигенный индекс278-283
839.49аАнтигенный индекс289-295
840.49аАнтигенный индекс305-308
841.49аАнтигенный индекс316-326
842.49аАнтигенный индекс337-349
843.49аАнтигенный индекс368-378
844.49аАнтигенный индекс386-388
845.49аАнтигенный индекс391-407
846.49аАнтигенный индекс423-429
847.49аАнтигенный индекс436-455
848.49аАнтигенный индекс459-484
849.49аАнтигенный индекс492-517
850.49аАнтигенный индекс521-528
851.49аАнтигенный индекс532-539
852.49аАнтигенный индекс555-564
853.49аАнтигенный индекс567-572
854.49аАнтигенный индекс578-582
855.49аАнтигенный индекс588-607
856.49аАнтигенный индекс610-612
857.49аАнтигенный индекс617-637
858.49аАнтигенный индекс641-660
859.49аАнтигенный индекс662-664
860.49аАнтигенный индекс667-684
861.49аАнтигенный индекс689-700
862.49аАнтигенный индекс706-732
863.49аАнтигенный индекс737-744
864.49аАнтигенный индекс748-761
865.49аГидрофильность 4-23
866. 49аГидрофильность 31-43
867. 49аГидрофильность 51-53
868. 49аГидрофильность 55-57

869.49аГидрофильность 64-68
870. 49аГидрофильность 79-87
871. 49аГидрофильность 98-106
872. 49аГидрофильность 114-120
873. 49аГидрофильность 130-139
874. 49аГидрофильность 147-164
875. 49аГидрофильность 187-197
876. 49аГидрофильность 229-231
877. 49аГидрофильность 249-262
878. 49аГидрофильность 264-266
879. 49аГидрофильность 278-283
880. 49аГидрофильность 290-292
881. 49аГидрофильность 319-326
882. 49аГидрофильность 337-349
883. 49аГидрофильность 368-376
884. 49аГидрофильность 386-388
885. 49аГидрофильность 391-407
886. 49аГидрофильность 427-429
887. 49аГидрофильность 436-439
888. 49аГидрофильность 441-455
889. 49аГидрофильность 459-463
890. 49аГидрофильность 465-484
891. 49аГидрофильность 492-513
892. 49аГидрофильность 521-528
893. 49аГидрофильность 559-564
894. 49аГидрофильность 567-569
895. 49аГидрофильность 589-591
896. 49аГидрофильность 601-604
897. 49аГидрофильность 620-624
898. 49аГидрофильность 626-637
899. 49аГидрофильность 641-660
900. 49аГидрофильность 662-664
901. 49аГидрофильность 668-684

902.49аГидрофильность 693-700
903. 49аГидрофильность 710-732
904. 49аГидрофильность 737-740
905. 49аГидрофильность 759-761
906. 51-1АМФИ 15-21
907. 51-1АМФИ40-54
908.51-1 АМФИ75-86
909.51-1 АМФИ108-110
910.51-1АМФИ 112-124
911. 51-1АМФИ 141-148
912. 51-1АМФИ184-189
913.51-1 АМФИ211-216
914.51-1 Антигенный индекс58-65
915.51-1Антигенный индекс123-127
916.51-1Антигенный индекс132-137
917.51-1Антигенный индекс149-153
918.51-1Антигенный индекс165-177
919.51-1Антигенный индекс198-204
920.51-1Антигенный индекс222-231
921.51-1Гидрофильность 60-65
922. 51-1Гидрофильность 123-127
923. 51-1Гидрофильность 132-135
924. 51-1Гидрофильность 165-174
925. 51-1Гидрофильность 200-203
926. 51-1Гидрофильность 222-227
927. 51аАМФИ 15-21
928. 51 аАМФИ40-54
929.51а АМФИ75-86
930.51аАМФИ 108-110
931. 51 аАМФИ112-124
932.51а АМФИ141-148
933.51аАМФИ 184-189
934. 51аАМФИ211-216

935.51аГидрофильность 60-65
936. 51аГидрофильность 123-127
937. 51аГидрофильность 132-135
938. 51аГидрофильность 165-174
939. 51аГидрофильность 200-203
940. 51аГидрофильность 222-227
941. 52-1АМФИ 48-50
942. 52-1АМФИ64-73
943.52-1 Антигенный индекс19-26
944.52-1 Антигенный индекс 30-35
945. 52-1Антигенный индекс 42-52
946. 52-1Антигенный индекс 57-86
947. 52-1Гидрофильность 22-26
948. 52-1Гидрофильность 30-35
949. 52-1Гидрофильность 42-52
950. 52-1Гидрофильность 57-71
951. 52-1Гидрофильность 78-86
952. 69-1АМФИ25-27
953.69-1 АМФИ46-66
954.69-1 Антигенный индекс32-41
955.69-1Антигенный индекс43-45
956.69-1Антигенный индекс71-78
957.69-1Гидрофильность 32-38
958. 69-1Гидрофильность 71-78
959. 69аАМФИ 25-27
960. б9аАМФИ46-66
961.69а Антигенный индекс32-41
962.69аАнтигенный индекс43-46
963.69аАнтигенный индекс71-78
964.69аГидрофильность 32-38
965. 69аГидрофильность 71-78
966. 77-1АМФИ 12-16
967. 77-1АМФИ23-33

968.77-1АМФИ 35-42
969. 77-1АМФИ 51-57
970. 77-1АМФИ67-70
971.77-1 АМФИ73-79
972.77-1 АМФИ122-124
973.77-1АМФИ 130-134
974. 77-1АМФИ 165-178
975. 77-1АМФИ191-211
976.77-1 Антигенный индекс22-31
977.77-1 Антигенный индекс 34-44
978. 77-1Антигенный индекс 80-94
979. 77-1Антигенный индекс 101-104
980. 77-1Антигенный индекс 155-158
981. 77-1Антигенный индекс 167-181
982. 77-1Гидрофильность 22-28
983. 77-1Гидрофильность 38-44
984. 77-1Гидрофильность 80-92
985. 77-1Гидрофильность 171-178
986. 77аАМФИ8-15
987.77а АМФИ24-30
988.77аАМФИ 40-43
989. 77аАМФИ46-52
990.77а АМФИ95-97
991.77аАМФИ 103-107
992. 77аАМФИ114-125
993.77а АМФИ144-151
994.77аАМФИ 154-156
995. 77аАМФИ166-184
996.77а Антигенный индекс7-17
997.77аАнтигенный индекс53-67
998.77аАнтигенный индекс74-77
999.77аАнтигенный индекс128-131
1000.77аАнтигенный индекс140-154

1001.77аГидрофильность 11-17
1002. 77аГидрофильность 53-65
1003. 77аГидрофильность 141-151
1004. 81-1АМФИ 30-40
1005. 81-1АМФИ54-56
1006.81-1 АМФИ60-63
1007.81-1 АМФИ76-93
1008.81-1АМФИ 96-101
1009. 81-1АМФИ 104-406
1010. 81-1АМФИ118-126
1011.81-1 АМФИ190-205
1012.81-1 АМФИ230-233
1013.81-1АМФИ 239-242
1014. 81-1АМФИ 256-258
1015. 81-1АМФИ264-284
1016.81-1 АМФИ290-297
1017.81-1 АМФИ317-326
1018.81-1АМФИ 388-396
1019. 81-1АМФИ 403-414
1020. 81-1АМФИ458-463
1021.81-1 АМФИ476-480
1022.81-1 Антигенный индекс1-4
1023.81-1Антигенный индекс35-38
1024.81-1Антигенный индекс86-89
1025.81-1Антигенный индекс95-98
1026.81-1Антигенный индекс100-103
1027.81-1Антигенный индекс128-136
1028.81-1Антигенный индекс154-174
1029.81-1Антигенный индекс197-211
1030.81-1Антигенный индекс220-226
1031.81-1Антигенный индекс232-240
1032.81-1Антигенный индекс244-249
1033.81-1Антигенный индекс251-253

1034.81-1Антигенный индекс255-258
1035.81-1Антигенный индекс276-290
1036.81-1Антигенный индекс292-301
1037.81-1Антигенный индекс307-312
1038.81-1Антигенный индекс318-323
1039.81-1Антигенный индекс334-345
1040.81-1Антигенный индекс352-358
1041.81-1Антигенный индекс364-372
1042.81-1Антигенный индекс376-384
1043.81-1Антигенный индекс387-401
1044.81-1Антигенный индекс409-417
1045.81-1Антигенный индекс423-444
1046.81-1Антигенный индекс452-459
1047.81-1Антигенный индекс486-488
1048.81-1Антигенный индекс490-499
1049.81-1Антигенный индекс507-520
1050.81-1Гидрофильность 1-4
1051. 81-1Гидрофильность 35-38
1052. 81-1Гидрофильность 95-98
1053. 81-1Гидрофильность 128-136
1054. 81-1Гидрофильность 154-164
1055. 81-1Гидрофильность 166-172
1056. 81-1Гидрофильность 202-209
1057. 81-1Гидрофильность 220-226
1058. 81-1Гидрофильность 234-238
1059. 81-1Гидрофильность 245-249
1060. 81-1Гидрофильность 251-253
1061. 81-1Гидрофильность 284-287
1062. 81-1Гидрофильность 292-299
1063. 81-1Гидрофильность 307-312
1064. 81-1Гидрофильность 321-323
1065. 81-1Гидрофильность 338-345
1066. 81-1Гидрофильность 366-368

1067.81-1Гидрофильность 378-384
1068. 81-1Гидрофильность 387-401
1069. 81-1Гидрофильность 409-415
1070. 81-1Гидрофильность 453-459
1071. 81-1Гидрофильность 493-499
1072. 81-1Гидрофильность 507-509
1073. 81-1Гидрофильность 512-518
1074.. 82аАМФИ 36-40
1075. 82аАМФИ95-111
1076.82а АМФИ117-132
1077.82а АМФИ135-137
1078.82аАМФИ 160-174
1079. 82аАМФИ 183-187
1080. 82аАнтигенный индекс 2-8
1081. 82аАнтигенный индекс 56-60
1082. 82аАнтигенный индекс 90-97
1083. 82аАнтигенный индекс 104-111
1084. 82аАнтигенный индекс 114-137
1085. 82аАнтигенный индекс 141-151
1086. 82аАнтигенный индекс 170-175
1087. 82аАнтигенный индекс 180-188
1088. 82аАнтигенный индекс 194-201
1089. 82аАнтигенный индекс 206-209
1090. 82аАнтигенный индекс 216-218
1091. 82аГидрофильность 2-8
1092. 82аГидрофильность 56-60
1093. 82аГидрофильность 90-97
1094. 82аГидрофильность 105-108
1095. 82аГидрофильность 120-128
1096. 82аГидрофильность 130-134
1097. 82аГидрофильность 141-151
1098. 82аГидрофильность 170-175
1099. 82аГидрофильность 186-188

1100.82аГидрофильность 195-201
1101. 82аГидрофильность 206-209
1102. 112-1АМФИ 6-8
1103. 112-1АМФИ12-34
1104.112-1 АМФИ45-53
1105.112-1 АМФИ63-65
1106.112-1АМФИ 70-82
1107. 112-1АМФИ 84-86
1108. 112-1АМФИ107-109
1109.112-1 АМФИ116-123
1110.112-1 АМФИ183-186
1111.112-1АМФИ 244-246
1112. 112-1АМФИ 248-258
1113. 112-1АМФИ280-282
1114.112-1 АМФИ302-313
1115.112-1 Антигенный индекс35-44
1116.112-1Антигенный индекс57-61
1117.112-1Антигенный индекс81-84
1118.112-1Антигенный индекс91-98
1119.112-1Антигенный индекс125-133
1120.112-1Антигенный индекс140-147
1121.112-1Антигенный индекс149-159
1122.112-1Антигенный индекс161-165
1123.112-1Антигенный индекс174-190
1124.112-1Антигенный индекс192-200
1125.112-1Антигенный индекс202-216
1126.112-1Антигенный индекс218-224
1127.112-1Антигенный индекс228-232
1128.112-1Антигенный индекс239-244
1129.112-1Антигенный индекс255-263
1130.112-1Антигенный индекс290-300
1131.112-1Гидрофильность 38-40
1132. 112-1Гидрофильность 57-61

1133.112-1Гидрофильность 92-98
1134. 112-1Гидрофильность 125-133
1135. 112-1Гидрофильность 141-143
1136. 112-1Гидрофильность 150-159
1137. 112-1Гидрофильность 161-164
1138. 112-1Гидрофильность 175-190
1139. 112-1Гидрофильность 203-216
1140. 112-1Гидрофильность 218-224
1141. 112-1Гидрофильность 228-232
1142. 112-1Гидрофильность 239-244
1143. 112-1Гидрофильность 259-261
1144. 112-1Гидрофильность 293-297
1145. 112аАМФИ 6-8
1146. 112аАМФИ12-34
1147.112а АМФИ47-54
1148.112а АМФИ63-65
1149.112аАМФИ 69-72
1150. 112аАМФИ 84-86
1151. 112аАМФИ89-91
1152.112а АМФИ107-109
1153.112а АМФИ116-123
1154.112аАМФИ 183-186
1155. 112аАМФИ 244-246
1156. 112аАМФИ248-258
1157.112а АМФИ280-282
1158.112а АМФИ302-310
1159.112аАМФИ 321-336
1160. 112аАнтигенный индекс 35-44
1161. 112аАнтигенный индекс 57-61
1162. 112аАнтигенный индекс 81-84
1163. 112аАнтигенный индекс 91-98
1164. 112аАнтигенный индекс 125-133
1165. 112аАнтигенный индекс 140-147

1166.112аАнтигенный индекс150-158
1167.112аАнтигенный индекс161-164
1168.112аАнтигенный индекс174-190
1169.112аАнтигенный индекс194-200
1170.112аАнтигенный индекс202-216
1171.112аАнтигенный индекс218-220
1172.112аАнтигенный индекс222-224
1173.112аАнтигенный индекс228-232
1174.112аАнтигенный индекс239-244
1175.112аАнтигенный индекс256-263
1176.112аАнтигенный индекс290-301
1177.112аАнтигенный индекс351-356
1178.112аГидрофильность 38-40
1179. 112аГидрофильность 57-61
1180. 112аГидрофильность 93-98
1181. 112аГидрофильность 125-133
1182. 112аГидрофильность 141-143
1183. 112аГидрофильность 150-155
1184. 112аГидрофильность 161-164
1185. 112аГидрофильность 175-190
1186. 112аГидрофильность 203-216
1187. 112аГидрофильность 218-220
1188. 112аГидрофильность 222-224
1189. 112аГидрофильность 228-232
1190. 112аГидрофильность 239-244
1191. 112аГидрофильность 259-261
1192. 112аГидрофильность 293-297
1193. 112аГидрофильность 351-356
1194. 114-1АМФИ 45-54
1195. 114-1АМФИ154-160
1196.114-1 АМФИ182-190
1197.114-1 АМФИ224-226
1198.114-1АМФИ 229-233

1199.114-1АМФИ 285-287
1200. 114-1АМФИ 303-310
1201. 114-1АМФИ321-332
1202.114-1 АМФИ392-398
1203.114-1 АМФИ413-416
1204.114-1АМФИ 450-452
1205. 114-1АМФИ 477-487
1206. 114-1АМФИ506-509
1207.114-1 АМФИ525-529
1208.114-1 АМФИ565-567
1209.114-1АМФИ 614-621
1210. 114-1АМФИ 631-635
1211. 114-1АМФИ770-774
1212.114-1 АМФИ810-813
1213.114-1 АМФИ847-849
1214.114-1АМФИ 851-853
1215. 114-1АМФИ 875-879
1216. 114-1АМФИ951-956
1217.114-1 АМФИ975-980
1218.114-1 АМФИ1034-1036
1219.114-1АМФИ 1048-1051
1220. 114-1АМФИ 1073-1081
1221. 114-1АМФИ1086-1090
1222.114-1 АМФИ1095-1102
1223.114-1 АМФИ1111-1115
1224.114-1 АМФИ1163-1167
1225.114-1АМФИ 1242-1245
1226. 114-1АМФИ 1275-1281
1227. 114-1АМФИ1312-1317
1228.114-1 АМФИ1338-1347
1229.114-1 АМФИ1349-1355
1230.114-1 АМФИ1357-1360
1231.114-1АМФИ 1362-1365

1232.114-1АМФИ 1376-1398
1233. 114-1АМФИ 1418-1421
1234. 114-1АМФИ1425-1429
1235.114-1 АМФИ1468-1473
1236.114-1 АМФИ1476-1485
1237.114-1 АМФИ1495-1515
1238.114-1АМФИ 1518-1526
1239. 114-1АМФИ 1546-1555
1240. 114-1АМФИ1557-1559
1241.114-1 АМФИ1580-1583
1242.114-1 АМФИ1585-1597
1243.114-1 АМФИ1604-1606
1244.114-1АМФИ 1613-1624
1245. 114-1АМФИ 1626-1630
1246. 114-1АМФИ1638-1644
1247.114-1 АМФИ1655-1660
1248.114-1 АМФИ1662-1664
1249.114-1 АМФИ1672-1674
1250.114-1АМФИ 1677-1679
1251. 114-1АМФИ 1691-1694
1252. 114-1АМФИ1713-1716
1253.114-1 АМФИ1719-1729
1254.114-1 АМФИ1735-1738
1255.114-1 АМФИ1753-1757
1256.114-1АМФИ 1772-1778
1257. 114-1АМФИ 1790-1792
1258. 114-1АМФИ1817-1826
1259.114-1 АМФИ1828-1832
1260.114-1 АМФИ1840-1851
1261.114-1 АМФИ1854-1856
1262.114-1АМФИ 1871-1881
1263. 114-1АМФИ 1883-1896
1264. 114-1АМФИ1922-1927

1265.114-1АМФИ 1934-1946
1266. 114-1АМФИ 1950-1955
1267. 114-1АМФИ1957-1964
1268.114-1 Антигенный индекс 1-6
1269. 114-1Антигенный индекс 10-16
1270. 114-1Антигенный индекс 23-37
1271. 114-1Антигенный индекс 41-55
1272. 114-1Антигенный индекс 75-85
1273. 114-1Антигенный индекс 91-97
1274. 114-1Антигенный индекс 102-140
1275. 114-1Антигенный индекс 147-156
1276. 114-1Антигенный индекс 161-168
1277. 114-1Антигенный индекс 172-174
1278. 114-1Антигенный индекс 181-189
1279. 114-1Антигенный индекс 196-203
1280. 114-1Антигенный индекс 208-213
1281. 114-1Антигенный индекс 220-229
1282. 114-1Антигенный индекс 242-248
1283. 114-1Антигенный индекс 251-266
1284. 114-1Антигенный индекс 268-276.
1285. 114-1Антигенный индекс 295-307,
1286. 114-1Антигенный индекс 309-312
1287. 114-1Антигенный индекс 318-340
1288. 114-1Антигенный индекс 345-351
1289. 114-1Антигенный индекс 357-366
1290. 114-1Антигенный индекс 371-381
1291. 114-1Антигенный индекс 385-392
1292. 114-1Антигенный индекс 404-417
1293. 114-1Антигенный индекс 419-432
1294. 114-1Антигенный индекс 440-456
1295. 114-1Антигенный индекс 464-468
1296. 114-1Антигенный индекс 473-480
1297. 114-1Антигенный индекс 482-488

1298.114-1Антигенный индекс496-511
1299.114-1Антигенный индекс515-530
1300.114-1Антигенный индекс535-549
1301.114-1Антигенный индекс555-560
1302.114-1Антигенный индекс564-582
1303.114-1Антигенный индекс588-596
1304.114-1Антигенный индекс602-615
1305.114-1Антигенный индекс617-620
1306.114-1Анти генный индекс622-624
1307.114-1Антигенный индекс628-632
1308.114-1Антигенный индекс637-640
1309.114-1Антигенный индекс647-654
1310.114-1Антигенный индекс660-666
1311.114-1Антигенный индекс668-688
1312.114-1Антигенный индекс696-725
1313.114-1Антигенный индекс730-733
1314.114-1Антигенный индекс738-755
1315.114-1Антигенный индекс760-766
1316.114-1Антигенный индекс779-783
1317.114-1Антигенный индекс786-799
1318.114-1Антигенный индекс807-809
1319.114-1Антигенный индекс811-819
1320.114-1Антигенный индекс831-839
1321.114-1Антигенный индекс845-857
1322.114-1Антигенный индекс860-862
1323.114-1Антигенный индекс864-868
1324.114-1Антигенный индекс872-879
1325.114-1Антигенный индекс883-891
1326.114-1Антигенный индекс893-903
1327.114-1Антигенный индекс908-916
1328.114-1Антигенный индекс919-936
1329.114-1Антигенный индекс941-947
1330.114-1Антигенный индекс950-956

1331.114-1Антигенный индекс959-976
1332.114-1Антигенный индекс979-991
1333.114-1Антигенный индекс993-1000
1334.114-1Антигенный индекс1007-1022
1335.114-1Антигенный индекс1041-1053
1336.114-1Антигенный индекс1062-1068
1337.114-1Антигенный индекс1075-1108
1338.114-1Антигенный индекс1115-1121
1339.114-1Антигенный индекс1126-1145
1340.114-1Антигенный индекс1148-1152
1341.114-1Антигенный индекс1156-1178
1342.114-1Антигенный индекс1195-1206
1343.114-1Антигенный индекс1208-1212
1344.114-1Антигенный индекс1217-1243
1345.114-1Антигенный индекс1246-1263
1346.114-1Антигенный индекс1271-1282
1347.114-1Антигенный индекс1284-1288
1348.114-1Антигенный индекс1292-1295
1349.114-1Антигенный индекс1299-1307
1350.114-1Антигенный индекс1318-1328
1351.114-1Антигенный индекс1330-1340
1352.114-1Антигенный индекс1344-1359
1353.114-1Антигенный индекс1367-1384
1354.114-1Антигенный индекс1395-1399
1355.114-1Антигенный индекс1405-1417
1356.114-1Антигенный индекс1445-1449
1357.114-1Антигенный индекс1491-1510
1358.114-1Антигенный индекс1526-1529
1359.114-1Антигенный индекс1532-1548
1360.114-1Антигенный индекс1552-1556
1361.114-1Антигенный индекс1560-1562
1362.114-1Антигенный индекс1573-1583
1363.114-1Антигенный индекс1594-1611

1364.114-1Антигенный индекс1627-1635
1365.114-1Антигенный индекс1643-1645
1366.114-1Антигенный индекс1647-1665
1367.114-1Антигенный индекс1680-1686
1368.114-1Антигенный индекс1700-1722
1369.114-1Антигенный индекс1724-1726
1370.114-1Антигенный индекс1739-1746
1371.114-1Антигенный индекс1752-1757
1372.114-1Антигенный индекс1780-1783
1373.114-1Антигенный индекс1791-1795
1374.114-1Антигенный индекс1804-1808
1375.114-1Антигенный индекс1829-1835
1376.114-1Антигенный индекс1841-1859
1377.114-1Антигенный индекс1867-1886
1378.114-1Антигенный индекс1897-1903
1379.114-1Антигенный индекс1908-1912
1380.114-1Антигенный индекс1917-1922
1381.114-1Антигенный индекс1926-1934
1382.114-1Антигенный индекс1938-1945
1383.114-1Антигенный индекс1947-1957
1384.114-1Антигенный индекс1961-1968
1385.114-1Антигенный индекс1974-1978
1386.114-1Гидрофильность 4-6
1387. 114-1Гидрофильность 12-15
1388. 114-1Гидрофильность 23-34
1389. 114-1Гидрофильность 43-55
1390. 114-1Гидрофильность 76-85
1391. 114-1Гидрофильность 104-110
1392. 114-1Гидрофильность 118-123
1393. 114-1Гидрофильность 127-132
1394. 114-1Гидрофильность 147-154
1395. 114-1Гидрофильность 163-167
1396. 114-1Гидрофильность 185-187

1397.114-1Гидрофильность 197-203
1398. 114-1Гидрофильность 208-211
1399. 114-1Гидрофильность 221-227
1400. 114-1Гидрофильность 243-245
1401. 114-1Гидрофильность 253-261
1402. 114-1Гидрофильность 263-266
1403. 114-1Гидрофильность 270-272
1404. 114-1Гидрофильность 295-301
1405. 114-1Гидрофильность 309-312
1406. 114-1Гидрофильность 320-328
1407. 114-1Гидрофильность 332-337
1408. 114-1Гидрофильность 345-351
1409. 114-1Гидрофильность 360-366
1410. 114-1Гидрофильность 371-378
1411. 114-1Гидрофильность 387-392
1412. 114-1Гидрофильность 404-415
1413. 114-1Гидрофильность 419-432
1414. 114-1Гидрофильность 441-450
1415. 114-1Гидрофильность 452-456
1416. 114-1Гидрофильность 473-480
1417. 114-1Гидрофильность 482-485
1418. 114-1Гидрофильность 496-500
1419. 114-1Гидрофильность 504-509
1420. 114-1Гидрофильность 515-520
1421. 114-1Гидрофильность 536-549
1422. 114-1Гидрофильность 555-560
1423. 114-1Гидрофильность 565-568
1424. 114-1Гидрофильность 570-579
1425. 114-1Гидрофильность 589-594
1426. 114-1Гидрофильность 602-604
1427. 114-1Гидрофильность 609-615
1428. 114-1Гидрофильность 617-620
1429. 114-1Гидрофильность 660-666

1430.114-1Гидрофильность 668-680
1431. 114-1Гидрофильность 684-686
1432. 114-1Гидрофильность 699-708
1433. 114-1Гидрофильность 715-725
1434. 114-1Гидрофильность 730-733
1435. 114-1Гидрофильность 738-744
1436. 114-1Гидрофильность 746-754
1437. 114-1Гидрофильность 760-766
1438. 114-1Гидрофильность 789-793
1439. 114-1Гидрофильность 816-818
1440. 114-1Гидрофильность 831-836
1441. 114-1Гидрофильность 845-857
1442. 114-1Гидрофильность 860-862
1443. 114-1Гидрофильность 864-866
1444. 114-1Гидрофильность 873-879
1445. 114-1Гидрофильность 883-885
1446. 114-1Гидрофильность 887-889
1447. 114-1Гидрофильность 896-899
1448. 114-1Гидрофильность 908-916
1449. 114-1Гидрофильность 919-932
1450. 114-1Гид рофил ьность 941-947
1451. 114-1Гидрофильность 962-975
1452. 114-1Гидрофильность 979-989
1453. 114-1Гидрофильность 993-1000
1454.114-1Гидрофильность 1007-1022
1455.114-1Гидрофильность 1041-1043
1456.114-1Гидрофильность 1045-1053
1457.114-1Гидрофильность 1062-1068
1458.114-1Гидрофильность 1075-1078
1459.114-1Гидрофильность 1080-1087
1460.114-1Гидрофильность 1089-1104
1461.114-1Гидрофильность 1115-1121
1462.114-1Гидрофильность 1126-1141

1463114-1Гидрофилы-юсть 1143-1145
1464.114-1Гидрофильность 1148-1151
1465.114-1Гидрофильность 1157-1178
1466.114-1Гидрофильность 1197-1203
1467.114-1Гидрофильность 1217-1243
1468.114-1Гидрофильность 1246-1263
1469.114-1Гидрофильность 1271-1273
1470114-1Гидрофильность 1275-1277
1471.114-1Гидрофильность 1284-1288
1472.114-1Гидрофильность 1299-1307
1473.114-1Гидрофильность 1318-1326
1474.114-1Гидрофильность 1334-1340
1475.114-1Гидрофильность 1350-1355
1476.114-1Гидрофильность 1357-1359
1477.114-1Гидрофильность 1367-1384
1478.114-1Гидрофильность 1407-1417
1479.114-1Гидрофильность 1491-1510
1480.114-1Гидрофильность 1534-1540
1481.114-1Гидрофильность 1576-1583
1482.114-1Гидрофильность 1595-1607
1483.114-1Гидрофильность 1629-1635
1484.114-1Гидрофильность 1643-1645
1485.114-1Гидрофильность 1649-1665
1486.114-1Гидрофильность 1682-1686
1487.114-1Гидрофильность 1704-1722
1488.114-1Гидрофильность 1724-1726
1489.114-1Гидрофильность 1740-1746
1490.114-1Гидрофильность 1804-1806
1491.114-1Гидрофильность 1829-1835
1492.114-1Гидрофильность 1842-1855
1493.114-1Гидрофильность 1876-1879
1494.114-1Гидрофильность 1898-1900
1495.114-1Гидрофильность 1910-1912

1496.114-1Гидрофильность 1920-1922
1497.114-1Гидрофильность 1928-1930
1498.114-1Гидрофильность 1938-1940
1499.114-1Гидрофильность 1948-1954
1500.114-1Гидрофильность 1962-1967
1501.114аАМФИ 45-54
1502. 114аАМФИ 154-160
1503. 114аАМФИ182-190
1504.114а АМФИ224-226
1505.114а АМФИ229-233
1506.114аАМФИ 285-287
1507. 114аАМФИ 303-310
1508. 114аАМФИ321-332
1509.114а АМФИ348-350
1510.114а АМФИ392-398
1511.114аАМФИ 414-416
1512. 114аАМФИ 478-486
1513. 114аАМФИ506-509
1514.114а АМФИ525-529
1515.114а АМФИ565-567
1516.114аАМФИ 614-621
1517. 114аАМФИ 631-635
1518. 114аАМФИ770-774
1519.114а АМФИ811-813
1520.114а АМФИ847-849
1521.114аАМФИ 851-853
1522. 114аАМФИ 875-879
1523. 114аАМФИ951-959
1524.114а АМФИ975-981
1525.114а АМФИ1034-1036
1526.114аАМФИ 1048-1051
1527. 114аАМФИ 1073-1081
1528. 114аАМФИ1086-1090

1529.114аАМФИ 1095-1102
1530. 114аАМФИ 1111-1115
1531. 114аАМФИ1163-1166
1532.114а АМФИ1275-1281
1533.114а АМФИ1312-1317
1534.114а АМФИ1338-1347
1535.114аАМФИ 1349-1355
1536. 114аАМФИ 1357-1365
1537. 114аАМФИ1376-1398
1538.114а АМФИ1418-1420
1539.114а АМФИ1455-1460
1540.114а АМФИ1472-1484
1541.114аАМФИ 1497-1505
1542. 114аАМФИ 1507-1512
1543. 114аАнтигенный индекс 1-6
1544. 114аАнтигенный индекс 10-16
1545. 114аАнтигенный индекс 23-37
1546. 114аАнтигенный индекс 41-55
1547. 114аАнтигенный индекс 75-85
1548. 114аАнтигенный индекс 91-97
1549. 114аАнтигенный индекс 102-137
1550. 114аАнтигенный индекс 147-156
1551. 114аАнтигенный индекс 161-168
1552. 114аАнтигенный индекс 172-174
1553. 114аАнтигенный индекс 181-189
1554. 114аАнтигенный индекс 196-203
1555. 114аАнтигенный индекс 208-213
1556. 114аАнтигенный индекс 220-229
1557. 114аАнтигенный индекс 242-248
1558. 114аАнтигенный индекс 251-266
1559. 114аАнтигенный индекс 268-276
1560. 114аАнтигенный индекс 295-307
1561. 114аАнтигенный индекс 309-312

1562.114аАнтигенный индекс318-340
1563.114аАнтигенный индекс345-352
1564.114аАнтигенный индекс357-366
1565.114аАнтигенный индекс371-381
1566.114аАнтигенный индекс385-392
1567.114аАнтигенный индекс404-427
1568.114аАнтигенный индекс429-434
1569.114аАнтигенный индекс440-456
1570.114аАнтигенный индекс465-468
1571.114аАнтигенный индекс473-494
1572.114аАнтигенный индекс496-510
1573.114аАнтигенный индекс515-530
1574.114аАнтигенный индекс535-549
1575.114аАнтигенный индекс555-560
1576.114аАнтигенный индекс564-578
1577.114аАнтигенный индекс588-596
1578.114аАнтигенный индекс602-615
1579.114аАнтигенный индекс617-620
1580.114аАнтигенный индекс622-624
1581.114аАнтигенный индекс628-632
1582.114аАнтигенный индекс637-640
1583.114аАнтигенный индекс647-654
1584.114аАнтигенный индекс660-666
1585.114аАнтигенный индекс668-688
1586.114аАнтигенный индекс697-725
1587.114аАнтигенный индекс730-733
1588.114аАнтигенный индекс738-755
1589.114аАнтигенный индекс760-766
1590.114аАнтигенный индекс779-783
1591.114аАнтигенный индекс786-799
1592.114аАнтигенный индекс806-809
1593.114аАнтигенный индекс811-819
1594.114аАнтигенный индекс831-839

1595.114аАнтигенный индекс845-857
1596.114аАнтигенный индекс860-862
1597.114аАнтигенный индекс864-868
1598.114аАнтигенный индекс872-879
1599.114аАнтигенный индекс883-891
1600.114аАнтигенный индекс893-902
1601.114аАнтигенный индекс908-916
1602.114аАнтигенный индекс923-936
1603.114аАнтигенный индекс941-947
1604.114аАнтигенный индекс950-956
1605.114аАнтигенный индекс959-976
1606.114аАнтигенный индекс979-989
1607.114аАнтигенный индекс993-1000
1608.114аАнтигенный индекс1007-1022
1609.114аАнтигенный индекс1041-1053
1610.114аАнтигенный индекс1062-1068
1611.114аАнтигенный индекс1075-1108
1612.114аАнтигенный индекс1115-1121
1613.114аАнтигенный индекс1126-1145
1614.114аАнтигенный индекс1148-1152
1615.114аАнтигенный индекс1157-1176
1616.114аАнтигенный индекс1195-1206
1617.114аАнтигенный индекс1208-1212
1618.114аАнтигенный индекс1224-1243
1619.114аАнтигенный индекс1247-1263
1620.114аАнтигенный индекс1271-1282
1621.114аАнтигенный индекс1284-1288
1622.114аАнтигенный индекс1292-1295
1623.114аАнтигенный индекс1299-1307
1624.114аАнтигенный индекс1318-1328
1625.114аАнтигенный индекс1330-1340
1626.114аАнтигенный индекс1344-1359
1627.114аАнтигенный индекс1367-1384

1628.114аАнтигенный индекс1396-1399
1629.114аАнтигенный индекс1405-1417
1630.114аАнтигенный индекс1434-1436
1631.114аАнтигенный индекс1449-1451
1632.114аАнтигенный индекс1468-1487
1633.114аАнтигенный индекс1498-1503
1634.114аАнтигенный индекс1509-1515
1635.114аАнтигенный индекс1525-1532
1636.114аГидрофильность 4-6
1637. 114аГидрофильность 12-15
1638. 114аГидрофильность 23-34
1639. 114аГидрофильность 43-55
1640. 114аГидрофильность 76-85
1641. 114аГидрофильность 104-110
1642. 114аГидрофильность 118-123
1643. 114аГидрофильность 127-132
1644. 114аГидрофильность 147-154
1645. 114аГидрофильность 163-167
1646. 114аГидрофильность 185-187
1647. 114аГидрофильность 197-203
1648. 114аГидрофильность 208-211
1649. 114аГидрофильность 221-227
1650. 114аГидрофильность 243-245
1651. 114аГидрофильность 253-261
1652. 114аГидрофильность 263-266
1653. 114аГидрофильность 270-272
1654. 114аГидрофильность 295-301
1655. 114аГидрофильность 309-312
1656. 114аГидрофильность 320-328
1657. 114аГидрофильность 332-337
1658. 114аГидрофильность 345-351
1659. 114аГидрофильность 360-366
1660. 114аГидрофильность 371-378

1661.114аГидрофильность 387-392
1662. 114аГидрофильность 404-417
1663. 114аГидрофильность 421-423
1664. 114аГидрофильность 425-427
1665. 114аГидрофильность 442-456
1666. 114аГидрофильность 473-488
1667. 114аГидрофильность 499-509
1668. 114аГидрофильность 515-520
1669. 114аГидрофильность 536-549
1670. 114аГидрофильность 555-560
1671. 114аГидрофильность 565-568
1672. 114аГидрофильность 570-578
1673. 114аГидрофильность 589-594
1674. 114аГидрофильность 602-604
1675. 114аГидрофильность 609-615
1676. 114аГидрофильность 617-620
1677. 114аГидрофильность 660-665
1678. 114аГидрофильность 668-680
1679. 114аГидрофильность 684-686
1680. 114аГидрофильность 699-708
1681. 114аГидрофильность 715-725
1682. 114аГидрофильность 730-733
1683. 114аГидрофильность 738-744
1684. 114аГидрофильность 746-754
1685. 114аГидрофильность 760-766
1686. 114аГидрофильность 789-793
1687. 114аГидрофильность 816-818
1688. 114аГидрофильность 831-836
1689. 114аГидрофильность 845-857
1690. 114аГидрофильность 860-862
1691. 114аГидрофильность 864-866
1692. 114аГидрофильность 873-879
1693. 114аГидрофильность 883-885

1694.114аГидрофильность 887-889
1695. 114аГидрофильность 896-899
1696. 114аГидрофильность 908-916
1697. 114аГидрофильность 923-932
1698. 114аГидрофильность 941-947
1699. 114аГидрофильность 961-975
1700. 114аГидрофильность 979-989
1701. 114аГидрофильность 993-1000
1702.114аГидрофильность 1007-1022
1703.114аГидрофильность 1041-1043
1704.114аГидрофильность 1045-1053
1705.114аГидрофильность 1062-1068
1706.114аГидрофильность 1075-1078
1707.114аГидрофильность 1080-1087
1708.114аГидрофильность 1089-1104
1709.114аГидрофильность 1115-1121
1710.114аГидрофильность 1126-1141
1711.114аГидрофильность 1143-1145
1712.114аГидрофильность 1148-1151
1713.114аГидрофильность 1158-1171
1714.114аГидрофильность 1197-1203
1715.114аГидрофильность 1224-1243
1716.114аГидрофильность 1251-1263
1717.114аГидрофильность 1271-1273
1718.114аГидрофильность 1275-1277
1719.114аГидрофильность 1284-1288
1720.114аГидрофильность 1299-1307
1721.114аГидрофильность 1318-1326
1722.114аГидрофильность 1334-1340
1723.114аГидрофильность 1350-1359
1724.114аГидрофильность 1367-1384
1725.114аГидрофильность 1407-1417
1726.114аГидрофильность 1449-1451

1727.114аГидрофильность 1469-1482
1728.114аГидрофильность 1484-1486
1729.114аГидрофильность 1498-1503
1730.114аГидрофильность 1510-1512
1731.114аГидрофильность 1527-1532
1732.124-1АМФИ 37-43
1733. 124-1АМФИ 94-96
1734. 124-1АМФИ113-115
1735.124-1 Антигенный индекс20-26
1736.124-1 Антигенный индекс 38-43
1737. 124-1Антигенный индекс 52-55
1738. 124-1Антигенный индекс 62-70
1739. 124-1Антигенный индекс 88-97
1740. 124-1Антигенный индекс 104-114
1741. 124-1Антигенный индекс 123-135
1742. 124-1Антигенный индекс 146-155
1743. 124-1Гидрофильность 20-26
1744. 124-1Гидрофильность 41-43
1745. 124-1Гидрофильность 52-55
1746. 124-1Гидрофильность 63-69
1747. 124-1Гидрофильность 91-94
1748. 124-1Гидрофильность 104-114
1749. 124-1Гидрофильность 123-135
1750. 124-1Гидрофильность 146-155
1751. 124аАМФИ19-21
1752.124а АМФИ23-29
1753.124а АМФИ37-43
1754.124аАМФИ 94-96
1755. 124аАнтигенный индекс 38-43
1756. 124аАнтигенный индекс 52-55
1757. 124аАнтигенный индекс 62-70
1758. 124аАнтигенный индекс 77-80
1759. 124аАнтигенный индекс 90-96

1760.124аАнтигенный индекс105-115
1761.124аАнтигенный индекс120-135
1762.124аАнтигенный индекс145-153
1763.124аГидрофильность 41-43
1764. 124аГидрофильность 52-55
1765. 124аГидрофильность 63-69
1766. 124аГидрофильность 91-95
1767. 124аГидрофильность 108-115
1768. 124аГидрофильность 120-135
1769. 124аГидрофильность 146-153

Должно быть понятно, что данное изобретение описано выше только посредством примера, и без отклонения от объема и сущности данного изобретения могут быть произведены его модификации.

ТАБЛИЦА II

Данное изобретение не включает в его объем белки, содержащие любую из 45 белковых последовательностей, описанных в WO99/36544. Как указано выше, если длина какой-либо конкретной белковой последовательности, описанной в WO99/36544, равна х аминокислотам, то антигенный фрагмент данного изобретения имеет самое большее х-1 аминокислот данного белка. Для каждой из 45 белковых последовательностей, приведенных в WO99/36544, величина х приведена для ссылки в следующей таблице:

SEQ ID NO:XSEQ ID NO:XSEQ ID NO: XSEQ ID NO: X
2245 26571 5018574 150
4591 28710 5216676 255
6592 30710 5432678 255
8164 3262 5635680 172
10321 3486 5828482 242
12321 3692 60197884 242
14124 38103 62153286 183
16124 4085 6459388 155
18173 4278 6612990 153
20640 4478 68319  
22 76146219 70619
24 11148 21272595

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2253678

patent-2253678.pdf

Класс C12N15/31 гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины

рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью -  патент 2524429 (27.07.2014)
штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина -  патент 2524133 (27.07.2014)
способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени -  патент 2518302 (10.06.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
рекомбинантный полипептид а2, селективно связывающий hsa, рекомбинантная днк pa2, кодирующая hsa-связывающую часть полипептида a2, его продуцент - рекомбинантный штамм escherichia coli m15-a2, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pqe 32-pa2, обеспечивающую получение полипептида a2 и применение полипептида а2 для диагностики микроальбуминурии и выделения hsa из сыворотки крови -  патент 2506271 (10.02.2014)
полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный белок пертактин, вектор, включающий такую последовательность, и вакцинные композиции, содержащие белок пертактина или вектор -  патент 2499046 (20.11.2013)
гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение -  патент 2497830 (10.11.2013)
нейссериальные вакцинные композиции, содержащие комбинацию антигенов -  патент 2494758 (10.10.2013)
конструкции, содержащие составные экспрессионные кассеты, для терапии рака -  патент 2487165 (10.07.2013)

Класс C07K2/00 Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные

способ выделения низкомолекулярных пептидов -  патент 2510398 (27.03.2014)
способ получения нового полимерного соединения, обладающего противовирусной активностью, сополимеризацией 2,5-дигидроксибензойной кислоты и желатина с помощью фермента лакказы -  патент 2494119 (27.09.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485133 (20.06.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485132 (20.06.2013)
комбинация пептидов -  патент 2482127 (20.05.2013)
активирующий люминесценцию белка гидридный комплекс -  патент 2475493 (20.02.2013)
способ получения и очистки ингибина-а человека -  патент 2434018 (20.11.2011)
штамм staphylococcus hominis klp-1 - продуцент низкомолекулярных пептидных соединений, ингибирующих развитие грамположительных бактерий -  патент 2428470 (10.09.2011)
очистка белков с помощью катионного поверхностно-активного вещества -  патент 2426738 (20.08.2011)
способ прогнозирования вторичной структуры белка -  патент 2425837 (10.08.2011)

Класс C07K14/195 из бактерий

выделение белка, ответственного за восстановление урана (vi) -  патент 2527892 (10.09.2014)
белок, обуславливающий свойство аутоагглютинации клеток чумного микроба, и способ его получения -  патент 2473558 (27.01.2013)
способ конденсации плазмидной днк для трансфекции эукариотических клеток -  патент 2464314 (20.10.2012)
пептиды rumc, обладающие антимикробной активностью -  патент 2464274 (20.10.2012)
рекомбинантная плазмидная днк pтв323, кодирующая гибридный полипептид gst-дельтамрт64 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена мрт64 (мрв64), рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного полипептида gst-дельтамрт64 и рекомбинантный полипептид gst-дельтамрт64 -  патент 2458130 (10.08.2012)
микроорганизм-носитель нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены и белковые токсины -  патент 2447145 (10.04.2012)
способ стимуляции регенерации дефектов кожи и слизистых оболочек и лекарственное средство для его реализации -  патент 2447082 (10.04.2012)
полипептиды нетипируемой haemophilus influenzae -  патент 2432357 (27.10.2011)
рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком -  патент 2412253 (20.02.2011)
пептид lana1, выделенный из бактерии bacillus licheniformis vk21, обладающий антимикробным действием -  патент 2408732 (10.01.2011)

Класс A61K38/02 пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные

клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью -  патент 2524429 (27.07.2014)
способ комплексного воздействия на нервно-рефлекторные механизмы зуда у больных атопическим дерматитом -  патент 2523634 (20.07.2014)
способ эндоскопической биопластики гастродуоденальных язв комплексным биопластическим материалом -  патент 2520599 (27.06.2014)
конъюгаты и малые молекулы, взаимодействующие с рецептором cd16а -  патент 2519546 (10.06.2014)
композиции, включающие антигены neisseria meningitidis из серогрупп в и с, и дополнительный антиген -  патент 2508122 (27.02.2014)
иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты -  патент 2506275 (10.02.2014)
способ получения комплекса биологически активных веществ из печени рыб тресковых пород -  патент 2495672 (20.10.2013)
биологически активный комплекс, обладающий противоаллергическим действием -  патент 2493861 (27.09.2013)
способ получения лекарственного препарата иммуномодулятора для лечения тяжелых форм гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний -  патент 2491944 (10.09.2013)
иммунологические анализы активности ботулинического токсина серотипа а -  патент 2491293 (27.08.2013)

Класс A61K38/40 трансферрины, например лактоферрины, овотрансферрины

новые фармацевтические композиции -  патент 2501566 (20.12.2013)
лечение или предупреждение ротавирусных инфекций -  патент 2493860 (27.09.2013)
фармацевтическая композиция, продуцирующая антиоксидантный, антимикробный, антитоксический белок - лактоферрин человека, способ ее получения и способ терапии -  патент 2489168 (10.08.2013)
фармацевтическая композиция для терапии острых токсических состояний -  патент 2488406 (27.07.2013)
способы иммунной или гематологической стимуляции, ингибирования образования или роста опухоли и лечение или предупреждение злокачественной опухоли, симптомов злокачественной опухоли или симптомов, связанных с лечением злокачественных опухолей -  патент 2483735 (10.06.2013)
применение апо-формы лактоферрина человека в качестве антигипоксанта и стабилизатора гипоксия-индуцибельного фактора-1 альфа -  патент 2465004 (27.10.2012)
новые композиции липосом -  патент 2454229 (27.06.2012)
применение композиции для ингибирования образования жира тела и способ ингибирования образования жира тела -  патент 2446819 (10.04.2012)
дерматологическое применение молочных белков -  патент 2445105 (20.03.2012)
применение бычьего лактоферрина для создания лекарственного средства, предназначенного для ингибирования роста бактерий -  патент 2399380 (20.09.2010)

Класс A61P31/04 антибактериальные средства

способ получения алкилбензилдиметиламмонийфторидов, обладающих противовирусным и антибактериальным действием -  патент 2529790 (27.09.2014)
вакцины на основе солюбилизированных и комбинированных капсулярных полисахаридов -  патент 2528066 (10.09.2014)
производные 5-гидроксиметилоксазолидин-2-она для лечения бактериальных кишечных заболеваний -  патент 2527769 (10.09.2014)
способ комплексного лечения некротического энтероколита у новорожденных и детей младшего грудного возраста -  патент 2527348 (27.08.2014)
композиции карбонатных соединений, препятствующих образованию биопленки, для использования при уходе за полостью рта -  патент 2526912 (27.08.2014)
способ получения комплексного антибактериального иммуномодулирующего препарата -  патент 2526184 (20.08.2014)
антибактериальные соединения -  патент 2525915 (20.08.2014)
производные 5-амино-2-(1-гидроксиэтил)тетрагидропирана -  патент 2525541 (20.08.2014)
композиции и способы лечения, включающие цефтаролин -  патент 2524665 (27.07.2014)
антимикробные/антибактериальные медицинские устройства, покрытые традиционными средствами китайской медицины -  патент 2524635 (27.07.2014)
Наверх