способ определения окисленных метаболитов триптофана при эндогенной интоксикации

Формула изобретения

Способ определения окисленных метаболитов триптофана при эндогенной интоксикации, включающий взятие пробы, осаждение ацетонитрилом высокомолекулярных соединений и регистрацию спектральной характеристики супернатанта, отличающийся тем, что супернатант наносят на бумажный фильтр, высушивают, погружают в раствор, содержащий ароматический альдегид, ацетон и концентрированную соляную кислоту, взятые в соотношении 70:5:1, выдерживают в течение 2-3 мин, после чего повторно высушивают и по интенсивности и цветовым оттенкам определяют качественное и полуколичественное содержание окисленных метаболитов триптофана, при этом по цветовым оттенкам желтого окрашивания определяют содержание гидроксилированных метаболитов, а по цветовым оттенкам фиолетового окрашивания - содержание негидроксилированных метаболитов.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки степени тяжести эндогенной интоксикации.

При эндогенной интоксикации наблюдается отравление организма как конечными продуктами метаболизма вследствие задержки их выведения и накопления в организме выше физиологических норм, так и промежуточными в связи с нарушениями метаболических процессов (Эндогенная интоксикация при острых хирургических заболеваниях / под ред. Ю.Н.Белокурова, В.В.Рябчикова. - Ярославль: ДИА- пресс, 2000. - с.283).

Известен способ обнаружения окисленных продуктов триптофана путем тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием элюентных систем, например метилацетат - изопропанол - 25% амиак, в соотношении 9:7:4 или хлороформ - уксусная кислота в соотношении 95:5. Проявление проводят реактивом Ван-Урка, содержащим 0,125 г альдегида, 0,1 мл 5%-ного раствора хлористого железа и 100 мл 65%-ной серной кислоты.

К недостаткам данного способа следует отнести длительность проведения анализа и необходимость использования специального оборудования (пластины для тонкослойной хроматографии, набор реактивов для элюции и проявления, опрыскиватель).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения содержания токсических продуктов низкого и среднего молекулярного веса в биосубстратах, включающий осаждение высокомолекулярных белков сыворотки и регистрацию спектральной характеристики супернатанта в диапазоне длин волн 210-300 нм (Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации // Эфферентная терапия.- 1995, т.1, №1, с.61-64). Регистрация спектра сыворотки в ультрафиолетовой области позволяет провести комплексную оценку токсичных продуктов и более 200 различных веществ, образующихся при нормальном и нарушенном метаболизме. Расчет количества вещества низкой и средней молекулярной массы проводят по формуле

где: - сумма в условных единицах (у.е.),

Е₂₁₀-Е ₃₀₀ - величины оптической плотности при заданной длине волны.

Общее время проведения анализа составляет 50 минут.

К недостаткам данного способа следует отнести получение общей характеристики веществ, циркулирующих в крови, принадлежащих к разным классам соединений и определяющих профиль спектрограммы. Данное обстоятельство ограничивает получение информации о компонентном составе, что в свою очередь не дает полного представления о степени тяжести эндогенной интоксикации и не позволяет провести в полном объеме необходимые лечебные мероприятия.

Задачей заявляемого технического решения является разработка способа, позволяющего быстро и объективно идентифицировать компонентный состав гетероциклических соединений, формирующих на спектрограмме пик при 280 нм и оценить их содержание в биологических объектах.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности и чувствительности определения за счет обеспечения возможности идентификации окисленных продуктов триптофана - триптамина, О-аминофенола, индола и скатола в биологических средах, а также упрощение и сокращение времени проведения анализа.

Технический результат достигается тем, что способ определения окисленных метаболитов триптофана при эндогенной интоксикации включает взятие пробы, осаждение ацетонитрилом высокомолекулярных соединений и получение супернатанта. Количественное и качественное содержание окисленных метаболитов триптофана проводят по спектральной характеристике супернатанта.

Отличительными приемами заявляемого способа являются: супернатант наносят на бумажный фильтр, высушивают, погружают в раствор, содержащий ароматический альдегид, ацетон и концентрированную соляную кислоту, взятые в весовом соотношении 70:5:1, выдерживают в течение 2-3 минут, после чего повторно высушивают. По интенсивности окрашивания судят о качественном и количественном составе метаболитов.

Приемами нанесения супернатанта на бумажный фильтр, высушивания и помещения в раствор, содержащий ароматический альдегид, ацетон и концентрированную соляную кислоту, взятые в весовом соотношении 70:5:1, достигается стабильная фиксация и проявление исследуемых веществ на бумажном носителе.

Интенсивность окрашивания окисленных метаболитов триптофана позволяет достоверно определить качественный и количественный состав гетероциклических соединений.

Авторам заявляемого способа не известно и в доступной литературе не найдено использование подобного состава реагента для проведения анализа окисленных продуктов триптофана - триптамина, О-аминофенола, индола, скатола.

Все эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения “новизна”.

Сравнение заявляемого технического решения не только с прототипом, но и другими техническими решениями в биохимии не позволило выявить в них признаки, отличающие заявленное решение не только от способа-прототипа, но и от других аналогичных технических решений.

Нами не найдена информация, в которой бы говорилось об определении окисленных метаболитов триптофана при эндогенной интоксикации приемами заявляемого способа.

Предлагаемый способ позволяет получить усматриваемый заявителем технический результат - повышение точности и чувствительности определения содержания окисленных метаболитов триптофана в биологических средах и сокращение времени проведения анализа.

Это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию “изобретательский уровень”.

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения “промышленная применимость”.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

После осаждения высокомолекулярных соединений пробу сыворотки крови наносят на бумажный фильтр в количестве 2-10 мкл и высушивают на воздухе, после чего помещают в кристаллизатор с проявительным раствором. Состав проявителя: ароматический альдегид, ацетон и концентрированная соляная кислота, взятые в весовом соотношении 70:5:1. Экспозицию проводят в течение 2-3 минут, после чего проводят повторное высушивание на воздухе.

При наличии окисленных продуктов триптофана пятна пробы окрашиваются от фиолетового до желтого цвета. По интенсивности и цветовым оттенкам судят о качественном и количественном составе метаболитов. Так о степени гидроксилирования судят по интенсивности желтого окрашивания. Интенсивность окрашивания возрастает в ряду моно-, ди-, триоксипроизводных. Интенсивность окрашивания негидроксилированных метаболитов триптофана служит количественным критерием их содержания в сыворотке, при этом изменение окраски происходит от слабо сине-фиолетовой до ярко-фиолетовой.

Как для гидроксилированных, так и не содержащих гидроксильные группы метаболитов триптофана составлены калибровочные шкалы, которые дают возможность определять пикограммовые количества исследуемых метаболитов.

Общее время анализа составляет не более 30 минут. Предложенный способ поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Больной Н., диагноз: панкреонекроз, распространенный гнойный перитонит. Общее содержание веществ низкого и среднего молекулярного веса, определенное по способу-прототипу, составило: в лимфе 15,177 условных единиц (у.е.), в сыворотке крови - 9,389 у.е. Полученные величины в 1,27 раза превышали их уровень у практически здорового человека. Содержание веществ при 280 нм было особенно высоким в лимфе и в сыворотке крови, что превышало показатель донора в сыворотке крови в 1,6 раза. Данные показатели свидетельствуют о тяжелом клиническом течении заболевания.

Проведение анализа по заявляемому способу позволило выявить наличие соединений с лимонно-желтым окрашиванием, которые были идентифицированы как производные скатола. Полуколичественная их оценка охарактеризована +++.

Нахождение окисленных метаболитов по заявляемому способу в лимфе и сыворотке больного указывает на наличие продуктов промежуточного обмена и характеризует глубокие нарушения метаболических процессов и тяжелый эндотоксикоз, что свидетельствует о необходимости применения методов экстракорпоральной детоксикации.

Пример 2.

Больная Щ. Диагноз железодефицитная анемия. Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) в сыворотке крови составило 10,296 у.е., что в 1,3 раза превысило их содержание у донора. Определение этих веществ при длине волны 280 нм было в 1,82 раза выше, чем у донора.

Проведение анализа по предлагаемому способу позволило выявить присутствие соединений преобладающей серо-фиолетовой окраски, что было верифицировано как производные индола с альдегидной группой. Полуколичественное их содержание оценили ++. Из изложенного следует, что заявляемым способом в сыворотке крови был определен значительный уровень окисленных продуктов триптофана, что указывало на выраженность эндогенной интоксикации.

Пример 3.

Больной С. с диагнозом ИБС, 3-й функциональный класс, стенокардия напряжения и покоя. При поступлении суммарное содержание ВНСММ в сыворотке крови составляло 10,218 у.е., при 280 нм - 0,895, что в 1,32 и 2,28 раза соответственно превышало уровень донора.

Использование предлагаемого способа выявило, что в сыворотке крови больного имеются соединения, дающие фиолетовое окрашивание, что указывает на наличие индолил-3-уксусной или индолил-3-пропионовой кислоты. По интенсивности окраски ее содержание соответствовало +++. Следовательно, предлагаемый способ выявил наличие промежуточных продуктов обмена - окисленных соединений триптофана, что указывает на тяжесть состояния больного с выраженной эндогенной интоксикацией.

Через 1,5 месяца после проведенного лечения фетальной терапией метаболический статус больного явно улучшился: суммарное содержание ВНСММ уменьшилось вдвое и составило 5,088 у.е., пик на спектрограмме при 280 нм снизился в 3 раза - уменьшился уровень окисленных продуктов триптофана. Заявляемым способом обнаружена следовая окраска соединений, что свидетельствовало о резком снижении содержания продуктов извращенного метаболизма.

Через 3 месяца после лечения, хотя и общий пул ВНСММ несколько увеличился, незначительно возросло содержание веществ ароматического строения, определенных при 280 нм. Однако эти показатели находились в пределах значений донора. Особо хотелось бы отметить корреляцию уменьшения содержания окисленных продуктов триптофана с клиническим состоянием больного.

Всего было обследовано в динамике 156 больных, из них 20 пациентов с панкреонекрозом, 80 - с ишемической болезнью сердца, 16 - с железодефицитной анемией, 34 - со злокачественными опухолями толстого кишечника, 6 - с острым лейкозом. У всех больных исследование окисленных метаболитов триптофана проводили одновременно по заявляемому способу и по прототипу. Суммарное содержание токсических продуктов в сыворотке крови, определенное по способу-прототипу (при поступлении в стационар), составляло 12,3-10,8 у.е. Полученные данные не позволили установить качественный состав соединений, циркулирующих в биосредах, в области 270-280 нм. Проведение исследований по заявляемому способу позволило установить, что у 20 больных панкреонекрозом, у 30-ти со злокачественными опухолями толстого кишечника и у 6-ти с острым лейкозом в сыворотке крови присутствовали соединения, дающие лимонно-желтое окрашивание интенсивностью +++, что указывало на наличие производных скатола и свидетельствовало о глубоких нарушениях метаболических процессов и тяжелом эндотоксикозе. У 20-ти пациентов ИБС и 10-ти с железодефицитной анемией предлагаемым способом выявлено, что в сыворотке крови содержатся вещества, дающие серо-фиолетовое окрашивание интенсивностью ++, верифицированные как производные индола с альдегидной группой.

Проведение анализа заявляемым способом у 30-ти больных ИБС, у 6-ти с железодефицитной анемией давало фиолетовую окраску и свидетельствовало о наличии окисленных продуктов триптофана.

Предлагаемый способ позволяет быстро и экономично определить наличие окисленных гетероциклических соединений, являющихся токсическими продуктами, которые вызывают глубокие метаболические нарушения в организме больного, вплоть до поражения различных органов и систем.