штамм mucor racemosus № 195, используемый при приготовлении иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных

Формула изобретения

Штамм Mucor racemosus №195, депонированный во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов и хранящийся в Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции, используемый при приготовлении иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и иммуногенных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.

Максимальное получение антигенов прямо пропорционально продуктивности штамма по ряду признаков, одним из которых является интенсивность спорообразования.

Указанный признак, а также отсутствие токсигенности и выраженные иммупогенные свойства определяют целесообразность использования штамма для производства диагностикумов и конструирования вакцинных препаратов.

Известно использование штамма Mucor ATCC 15242 из Японской коллекции микроорганизмов JCM для получения трансглутаминазы, которую применяют с терапевтической целью и в виде лечебно-пищевых добавок (см. патент США №6 472 182, опуб. 29.10.2002 г.).

Однако данный штамм не предназначен для получения антигенов-полисахаридов и пептидогликанов.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Mucor lusitanicus BKMF - 306 D, используемый для получения -линолиевой кислоты, являющейся основой липидного продукта, применяемого при лечении ран, ожогов и аллергических контактных дерматитов (см. патент РФ №2129002 по кл. МПК А 61К 35/70, опуб. 20.04.1999 г.).

Данный штамм, также как и предыдущий аналог, не синтезирует комплекс белков, полисахаридов и пептидогликанов.

Изобретение направлено на решение задачи создания нового штамма - Mucor racemosus №195, обладающего высокой спорообразующей активностью, отсутствием патогенности и продуцуированием пептидогликанов и полисахаридов, обладающих иммуногенными свойствами.

Штамм Mucor racemosus выделен в Саратовской области от теленка 15-дневного возраста, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ), хранится в Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции (НИВС).

Штамм Mucor racemosus №195 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Рост гриба после инкубирования при 37°С на пластинчатом агаре Сабуро появляется через 24 часа в виде беловатого пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием сероватого цвета. В бульоне Сабуро к 3 суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост культуры в виде плотных “войлочных” дисков с развитым мицелием и с одновременным образованием ватоподобного осадка.

При микроскопировании (с фиксацией в 10% КОН или в 50% глицерине) гриб представлен несептированным мицелием, имеющим различную ширину (до 20 мкм) на протяжении нити, древовидно ветвящийся. Обнаруживается при увеличении микроскопа (×7). Спорангиеносцы прямолинейные, спорангии шаровидные, не имеющие апофизы.

Токсинообразование происходит на бульоне Сабуро и средах, изготовленных по патенту Саратовской НИВС №2093569 (опуб. 20.10.97 г.).

Продукт, синтезируемый штаммом, - в основном, комплекс белков, полисахаридов, пептидогликанов, обладающих антигенными свойствами.

Чувствительность к антимикробным препаратам.

Зона задержки роста дисками, пропитанными амфотерицином - 9 мм; нистатином - 21 мм; клотримазолом - 27 мм; 0,01% раствором тимерсала -20 мм; 5% раствором препарата “А-24” - 26 мм; 0,03% раствором AgNO ₃ - 14 мм.

Вирулентные свойства.

Внутрибрюшинное введение 3-суточной культуры в объеме 0,5 мл и концентрации спор 1·10⁷ в см³ гибели белых мышей не вызывает; LД₅₀ - 5·10⁷ спор/см ³, LД₁₀₀ - 1·10⁸ спор/см ³ (гибель на 4-5 сутки). Внутривенное заражение белых крыс в объеме 1 мл и концентрации спор от 1·10⁶ до 1·10⁷ в см³ вызывает гибель на 3 сутки, в дозе 7·10⁷ в см³- на 2 сутки у 100% животных.

Штамм относится к III группе патогенности - условно патогенный.

Штамм Mucor racemosus №195 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку спорообразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались.

Пассажирования на животных не требуется.

Штамм Mucor racemosus №195 хранят на агаре Сабуро в течение не более 20-30 суток, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма - в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4°С до 1 года.

Способ, условия и состав среды для размножения штамма - бульон и агар Сабуро. Культивирование осуществляется при температуре 26-37°С.

Пример 1.

Штамм Mucor racemosus №195 культивируют на плотных средах: Чапека, Сабуро, Дрожжевой или разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ №2093569 (опуб. 20.10.97 г.), содержащей, мас.%: глюкозу 4-5, гидролизат лактальбумина 0,45-0,55, сыворотку крови крупного рогатого скота 9,0-11,0, пептон 0,95-1,05, агар 3,5-3,6, солевой раствор Хенкса - остальное.

Спорообразование штамма испытано методом подсчета клеток в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства по формуле:

(а·4000·1000):в=х,

где а - число сосчитанных клеток,

в - число малых квадратов камеры.

Результаты спорообразования штамма М. racemosus №195 на твердых питательных средах представлены в таблице 1.

Таблица 1
Питательный агар	Кол-во проб	Время отбора проб (сутки)
		3	6	9	12
		Среднее количество спор в 1 мл пробы, млн
Чапека	10	4,0	4,0	4,0	9,0
Сабуро	10	40,5	50,5	70,5	76,0
Дрожжевой	10	60,0	69,0	100,0	89,0
Среда по Патенту СНИВС №2093569	10	44,0	47,0	100,0	100,0

Пример 2.

Штамм Mucor racemosus №195 культивируют при температуре 37°С в течение 12 суток на питательной среде, разработанной Саратовской НИВС по патенту №2093569, состав которой описан в примере 1, но без добавления агара, т.е. жидкой. После завершения культивирования мицелий и споры разрушают в течение 2-х часов ультразвуковым дезинтегратором.

Затем осуществляют фильтрацию через мембрану “Владипор” №3 для освобождения от мицелия и спор культуры штамма. Вносят раствор формалина 0,4% конечной концентрации и добавляют масляный адьювант в соотношении 5 частей антигена и 1 часть адьюванта.

Полученным антигеном иммунизировали лабораторных животных. В последующем их подвергали внутривенному заражению вирулентным штаммом Mucor racemosus. В качестве контроля использовали неиммунизированных животных. Результаты иммунизации представлены в таблице 2.

Таблица 2
Вид животных	Кол-во голов, иммунизированных антигенами из штамма Mucor racemosus	Кол-во выживших животных из числа иммунизированных	Кол-во голов не иммунизированных животных	Кол-во выживших животных из числа не иммунизированных
Мыши	10	9	10	0
Морские свинки	8	4	8	0
Кролики	5	3	5	0

Таким образом, предлагаемый штамм Mucor racemosus №195 обладает высокой спорообразующей способностью, а в антигенном отношении - иммуногенностью.