способ разделения высокомолекулярных лактонсодержащих соединений

Формула изобретения

1. Способ разделения лактонсодержащих соединений, в котором смесь лактонсодержащего соединения, имеющего основную химическую структуру 1,14-дигидрокси-12-[2-(4-гидроксициклогексил)-1-метилвинил]-23,25-диметокси-13,19,21,27-тетраметил-11,28-диокса-4-азатрицикло[22.3.1.0 ^4,9]октакоз-18-ен-2,3,10,16-тетраона и

по меньшей мере, одну из С₂-С₆ алкенильной группы и C₁-C₆ алкоксигруппы в качестве боковой цепи, и аналогичных им соединений, подвергают либо одной, либо обеим следующим стадиям в любом порядке:

стадии (А) адсорбции смеси на неионной адсорбирующей смоле и элюирования водным растворителем, содержащим ионы серебра, и

стадии (В) абсорбции смеси на основной окиси алюминия и элюирования органическим растворителем для отделения каждого из соединений.

2. Способ по п.1, где лактонсодержащее соединение имеет как С₂-С ₆ алкенильную группу, так и C₁-C₆ алкоксигруппу в качестве боковых цепей, и разделяется проведением стадий (А) и (В) в указанном или обратном порядке.

3. Способ по п.1, где лактонсодержащее соединение имеет С₂-С ₆ алкенильную группу в качестве боковой цепи, и отделяется проведением стадии (А).

4. Способ по п.1, где лактонсодержащее соединение имеет C₁-С₆ алкоксигруппу в качестве его боковой цепи, и отделяется проведением стадии (В).

5. Способ по п.2, где С₂-С₆ алкенильной группой в качестве боковой цепи является пропенильная группа и C₁-C₆ алкоксигруппой в качестве боковой цепи является метоксигруппа.

6. Способ по п.3, где С ₂-С₆ алкенильной группой в качестве боковой цепи является пропенильная группа.

7. Способ по п.4, где C₁-С₆ алкоксигруппой в качестве боковой цепи является метоксигруппа.

8. Способ по п.1, где неионная адсорбирующая смола имеет структуру фрагментов, представленную формулой

где R представляет атом водорода или атом галогена.

9. Способ по п.8, где неионной адсорбирующей смолой является Diaion® HP20, Diaion® HP20SS или Sepabeads® SP207.

10. Способ по п.1, где основной окисью алюминия является АС12.

11. Способ по п.2, где аналогичным соединением является лактонсодержащее соединение, имеющее в качестве боковых цепей C₁-С ₆ алкильную группу и гидроксигруппу вместо С₂ -С₆ алкенильной группы и C₁-С₆ алкоксигруппы, соответственно.

12. Способ по п.3, где аналогичным соединением является лактонсодержащее соединение, имеющее в качестве его боковой цепи C₁-С₆ алкильную группу вместо С₂-С₆ алкенильной группы.

13. Способ по п.4, где аналогичным соединением является лактонсодержащее соединение, имеющее в качестве боковой цепи гидроксигруппу вместо C₁-C₆ алкоксигруппы.

14. Способ по п.5 или 6, где указанная группа пропенила представляет собой аллил.

Описание изобретения к патенту

ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ

Настоящее изобретение относится к способу разделения аналогичных (родственных) высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, более конкретно способу разделения высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, имеющих разные боковые цепи, с использованием неионной адсорбирующей смолы и/или основного активированного оксида алюминия.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Известно использование ионов серебра для разделения цис-транс-изомеров ненасыщенной алифатической кислоты, имеющих одинаковое число атомов углерода (J. Chromatography, 149 (1978) 417-). Однако трудно разделить аналогичные соединения, которые незначительно и частично различаются по молекулярной структуре обычными способами, вследствие того, что они имеют одинаковое или почти одинаковое число атомов углерода и соответственно подобны по своим физическим свойствам, таким как растворимость и сродство к растворителям.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения провели экстенсивные исследования для того, чтобы найти способ эффективного разделения аналогичных соединений, сходных друг с другом по физическим свойствам, без изменения их химической структуры. Неожиданно ими был найден способ разделения высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, имеющих различные боковые цепи, с использованием неионной адсорбирующей смолы и подходящего элюента и/или основного активированного оксида алкминия и подходящего элюента.

Настоящее изобретение предлагает способ разделения высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, по которому смесь высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, имеющих в качестве боковой цепи, по меньшей мере, одну из низшей алкенильной группы и низшей алкоксигруппы, и аналогичного соединения(ий), подвергают либо одной, либо обеим стадиям в любом порядке:

стадии (А) адсорбции смеси неионной адсорбирующей смолой и элюирования водным раствором, содержащим ионы серебра, и

стадии (В) адсорбции смеси основным активным оксидом алюминия и элюирования органическим растворителем для разделения каждого из соединений.

В соответствии с настоящим изобретением, обе стадии (А) и (В), предпочтительно, проводят для разделения высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего в качестве своей боковой цепи как низшую алкенильную группу, так и низшую алкоксигруппу, от аналогичного (близкого) ему соединения(ий). Сначала можно проводить любую из стадий (А) и (В), но обычно стадию (А), что предпочтительно, проводят первой.

Стадию (А), предпочтительно, проводят для отделения высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего в качестве боковой цепи низшую алкенильную группу, от аналогичного ему соединения(ий).

Стадию (В), предпочтительно, проводят для отделения высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего в качестве боковой цепи низшую алкоксигруппу, от аналогичного ему соединения (ий).

Высокомолекулярные лактонсодержащие соединения, для разделения которых можно применять способ настоящего изобретения, представляют соединения, имеющие одно или несколько лактоновых колец в молекулах и молекулярную массу приблизительно 400 или выше. Они могут иметь моноциклическую, бициклическую, трициклическую или подобную основную циклическую структуру. Более предпочтительно, число атомов-членов, образующих указанную основную циклическую структуру, составляет 12 или больше. Такие моноциклические соединения включают эритромицины, лейкомицины, метимицины и тому подобное. Такие трициклические соединения, имеющие кольцо лактона, включают трициклические соединения, как показано в ЕР 0184162; содержащие гетероатомы трициклические соединения, как показано в ЕР 0427680, ЕР 0532088 или WО 93/04680. Предпочтительными трициклическими соединениями, имеющими кольцо лактона, предпочтительно, являются 1,14-дигидрокси-12-[2-(4-гидроксициклогексил)-1-метилвинил]-23,25-диметокси-13,19,21,27-тетраметил-11,28-диокса-4-азатрицикло [22.3.1.0^4,9]октакоз-18-ен-2,3,10,16-тетраон (называемый в дальнейшем “соединением Z”) (которое является такролимусом, когда положение 17 замещено аллильной группой и положение 3 замещено метоксигруппой, и аскомицином, когда положение 17 замещено этильной группой и положение 3 замещено метоксигруппой), рапамизины или тому подобные. Среди этих соединений предпочтительными являются трициклические соединения и более предпочтительным соединение Z.

Низшая алкенильная группа в качестве боковой цепи в высокомолекулярных лактонсодержащих соединениях может быть алкенильной группой с неразветвленной или разветвленной цепью, имеющей 2-6 атомов углерода, такой как винил, пропенил (аллил или 1-пропенил), бутенил, изобутенил, пентенил, гексенил и тому подобное, среди которых предпочтительными являются винил и пропенил.

Низшая алкоксигруппа в качестве боковой цепи в высокомолекулярных лактонсодержащих соединениях может быть алкоксигруппой с неразветвленной или разветвленной цепью, имеющей 1-6 атомов углерода, такой как метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, вторбутокси, третбутокси, пентилокси, изопентилокси, гексилокси и тому подобное, среди которых предпочтительными являются алкоксигруппы, имеющие 1-4 атома углерода, такие как метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси и тому подобное.

В особенности высокомолекулярным лактонсодержащим соединением, которое нужно разделить по настоящему изобретению и которое имеет, по меньшей мере, одну из низшей алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве боковой цепи, предпочтительно, является соединение, содержащее соединение Z в качестве его основной химической структуры, в которой низшей алкенильной группой является пропенильная группа и низшей алкоксигруппой является метоксигруппа, соединение, содержащее соединение Z в качестве его основной химической структуры, в которой низшей алкенильной группой является пропенильная группа, или соединение, содержащее соединение Z в качестве его основной химической структуры, в которой низшей алкоксигруппой является метоксигруппа.

Соединения, аналогичные высокомолекулярному лактонсодержащему соединению, для которых применяют способ разделения настоящего изобретения, означают соединения, имеющие ту же самую или по существу ту же самую основную химическую структуру, как и вышеописанное высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, но имеющие другой заместитель(и) в качестве его боковой цепи (ей). Например, соединениями, аналогичными соединению, имеющему низшие алкенильные группы в качестве боковой цепи, могут быть соединения, имеющие ту же самую основную химическую структуру, но имеющие низшую алкильную группу, низшую алкоксигруппу, гидроксигруппу или тому подобное вместо низшей алкенильной группы в том же положении. Такие аналогичные соединения включают соединения, имеющие основную химическую структуру, несколько отличающуюся в других частях, а не в вышеуказанном положении заместителя, но обладающие сходными свойствами в целом.

Особенно предпочтительными соединениями, аналогичными высокомолекулярному лактонсодержащему соединению, имеющему низшую алкенильную группу в качестве его боковой цепи, могут быть соединения, имеющие низшую алкильную группу вместо низшей алкенильной группы; соединениями, аналогичными соединению, имеющему низшую алкоксигруппу в качестве его боковой цепи, могут быть соединения, имеющие гидроксигруппу вместо низшей алкоксигруппы, и соединениями, аналогичными высокомолекулярному лактонсодержащему соединению, имеющему низшую алкенильную группу и низшую алкоксигруппу в качестве разных боковых цепей, могут быть соединения, имеющие низшую алкильную группу вместо низшей алкенильной группы и/или гидроксигруппу вместо низшей алкоксигруппы.

Низшей алкильной группой в качестве боковой цепи в высокомолекулярных лактонсодержащих соединениях могут быть алкильные группы с неразветвленной или разветвленной цепью, имеющие 1-6 атомов углерода, такие как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, вторбутил, третбутил, пентил, изопентил, гексил и тому подобное, среди которых предпочтительными являются алкильные группы, имеющие 1-4 атома углерода, такие как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил и тому подобное.

Адсорбцию смеси, содержащей лактонсодержащее соединение с высокой молекулярной массой, имеющее, по меньшей мере, одну низшую алкенильную группу и низшую алкоксигруппу в качестве боковой цепи(ей), и аналогичное ему соединение(я) на неионной адсорбирующей смоле или основном активированном оксиде алюминия и элюирование целевого соединения из адсорбента, по настоящему изобретению можно выполнить следующим способом.

Например, в случае, в котором смесь высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего, по меньшей мере, одну из алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве боковой цепи, и аналогичного ему соединения(ий), получают ферментацией, путь, которым смесь подвергают способу разделения, зависит от того, продуцируются ли эти соединения вне бактерий, т.е. внеклеточно, или продуцируются ли они внутри бактерий, т.е. внутриклеточно. Если они продуцируются внеклеточно, жидкую смесь ферментации подвергают способу разделения настоящего изобретения. Если соединения продуцируются внутриклеточно, бактерии обрабатывают подходящим растворителем, и образовавшуюся жидкую смесь экстракции затем подвергают способу разделения настоящего изобретения. Жидкую смесь продуктов ферментации или жидкую смесь экстракции, как таковую или после концентрирования, можно вылить в колонку или подобное устройство, заполненное адсорбентом.

В альтернативном случае жидкость ферментации или жидкость экстракции можно концентрировать досуха с получением остатка и затем остаток можно растворить в подходящем растворителе с получением раствора, который выливают в колонку или подобное устройство.

Если смесь высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего, по меньшей мере, одну из низшей алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве его боковой цепи, и аналогичного ему соединения(ий) получают синтезом, реакционную жидкость или экстракционную жидкость, как таковую или после концентрирования, можно вылить в колонку или подобное устройство, заполненное адсорбентом. В альтернативном случае реакционную жидкость или экстракционную жидкость можно концентрировать досуха с получением остатка, и затем остаток можно растворить в подходящем растворителе с получением раствора, который выливают в колонку или подобное устройство.

Высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, имеющее, по меньшей мере, одну из алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве его боковой цепи(ей), и аналогичное ему соединение(я), содержаще(и)еся в смеси, селективно элюируют в соответствии с их сродством к адсорбенту и элюенту, и объединенный элюат, содержащий требуемое соединение, концентрируют досуха. Таким образом выделяют требуемое высокомолекулярное лактонсодержащее соединение.

Неионной адсорбционной смолой, используемой в качестве адсорбента, может быть полиэтиленовая смола, имеющая структуру фрагмента (звена), представленную формулой:

где R представляет атом водорода или галогена. В частности, предпочтительно используемыми являются Diaion® HP 20, Diaion® HP20SS, Sepabeads® SP207 (изготовлены Mitsubishi Chemical Corporation, Japan) или тому подобное. Например, в случае, когда основной химической структурой высокомолекулярного лактонсодержащего соединения является соединение Z, обычно предпочтительным является использование Diaion® HP20SS.

Для элюирования высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, адсорбированного неионной адсорбирующей смолой, используют водный растворитель, содержащий ионы серебра. В качестве соли серебра, содержащейся в водном растворителе, содержащем ионы серебра, предпочтительно применяют нитрат серебра, перхлорат серебра или тому подобное, который в воде существует в виде ионов серебра, среди указанных солей предпочтительным является нитрат серебра в случае, когда основной химической структурой высокомолекулярного лактонсодержащего соединения является, например, соединение Z. Концентрация ионов серебра варьирует в зависимости от природы высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, которое разделяют, но обычно она составляет от 0,059 до 1,18 моль/л, предпочтительно, от 0,12 до 0,59 моль/л, более предпочтительно, от 0,18 до 0,47 моль/л, очень предпочтительно, от 0,24 до 0,35 моль/л, в виде Аg⁺.

В качестве водной среды для содержащего ионы серебра водного растворителя можно указать в качестве примеров водный спирт (например, метанол и этанол), водный ацетонитрил или тому подобное. Например, водный ацетон можно, предпочтительно, использовать в случае, когда основной химической структурой высокомолекулярного лактонсодержащего соединения является соединение Z.

Основным активированным оксидом алюминия, используемым в качестве адсорбента, может быть, предпочтительно, АС12 (товарный знак, изготовлен Sumitomo Chemical Company, Limited, Japan) в случае, когда основной химической структурой высокомолекулярного лактонсодержащего соединения является, например, соединение Z.

Органический растворитель используют для элюирования высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, адсорбированного основным активированным оксидом алюминия. Органическим растворителем, используемым в качестве элюента, может быть общепринятый растворитель, такой как этилацетат, ацетон, дихлорметан, смесь хлороформа и метанола, смесь этилацетата и н-гексана или тому подобное. Этилацетат, например, можно, предпочтительно, использовать в случае, когда основной химической структурой высокомолекулярного лактонсодержащего соединения является соединение Z.

Тип элюента и, если элюентом является смешанный растворитель, отношение их в смеси, предпочтительно, выбирают в соответствии с природой высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, которое нужно разделить при помощи предварительного анализа, такого как тонкослойная хроматография (ТСХ) или тому подобное.

Количество адсорбента, предпочтительно, в 50 раз больше, чем масса высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, в случае, когда адсорбентом является неионная адсорбирующая смола, и, предпочтительно, в 70 раз больше, чем масса высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, в случае, когда адсорбентом является основной активированный оксид алюминия.

Скорость потока SV элюирующего растворителя варьирует в зависимости от размера частиц адсорбента и обычно составляет приблизительно от 3 до 5 мл/мин в случае неионной адсорбирующей смолы и обычно составляет приблизительно от 3 до 5 мл/мин в случае основного активированного оксида алюминия.

Фракцию(и), содержащую высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, имеющее, по меньшей мере, одну из низшей алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве боковой цепи(ей), можно детектировать ультрафиолетвидимым детектором или дифференциальным детектором по показателю преломления или ТСХ после получения нескольких фракций. Фракции, содержащие требуемое вещество, объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении, посредством чего очищают требуемое соединение.

Хотя настоящее изобретение является способом выделения высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего, по меньшей мере, одну из алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве его боковой цепи(ей), можно также дополнительно отделить аналогичное соединение, оставшееся среди других аналогичных соединений после отделения высокомолекулярного лактонсодержащего соединения. Например, высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, имеющее низшую алкоксигруппу в качестве боковой цепи, выделяют из смеси, содержащей высокомолекулярное лактонсодержащее соединение и аналогичное соединение, имеющее по существу такую же основную химическую структуру и имеющее гидроксигруппу в качестве боковой цепи; и вновь изобретение можно применять для отделения аналогичного соединения элюированием с использованием растворителя, имеющего другую полярность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 является диаграммой, показывающей разделение колоночной хроматографией с использованием Diaion® HP20SS и водного ацетона в качестве элюента.

Фиг.2 является диаграммой, показывающей разделение колоночной хроматографией с использованием Diaion® HP20SS и содержащего водно-ацетоновый раствор нитрата серебра (0,294 моль/л) в качестве элюента.

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение далее объясняется подробно посредством примеров, которые представлены только для иллюстрации изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Пример получения 1

Получение смеси, содержащей высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, имеющее, по меньшей мере, одну из низшей алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве боковых цепей, и аналогичное ему соединение, ферментацией

Культуральную среду (100 мл), содержащую 1% кукурузного крахмала, 1% глицерина, 0,5% глюкозы, 1% муки из семян хлопчатника, 0,5% высушенных дрожжей, 0,5% кукурузный экстракт и 0,2% карбоната кальция, доводят до рН 6,5, разливают в восемь колб Эрленмейера на 500 мл и стерилизуют при 120°С в течение 30 минут. Полной петлей культуры на скошенном агаре Streptomyces Tsukubaensis №9993 (Депозит № FERM BP-927 at the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, under the Budapest Treaty) инокулируют среду в каждой из колб и культивируют при 30°С в течение 72 часов на роторном шейкере. Этот культивированный бульон переносят в качестве посевной культуры в 160 л той же самой среды, которая содержится в сосуде-ферментере на 200 л, предварительно стерилизованном при 120°С в течение 30 минут, к которой было добавлено 0,05% Adekanol® (противовспениватель, товарный знак, произведен Asahi Denka Co., Japan) и 0,05% силикона (производитель Shinetsu Chemical Co., Japan). Данную смесь культивируют при 30°С в течение 48 часов с перемешиванием при 200 об/мин при аэрации 160 л/мин. Данным культивированным бульоном (30 л) инокулируют 3000 л среды продуцирования с рН 6,8, предварительно стерилизованной при 120°С в течение 30 минут и содержащей 3% растворимого крахмала, 0,8% пшеничных проростков, 0,4% высушенных дрожжей, 0,6% экстракта кукурузы, 0,1% карбоната кальция, 0,05% Adecanol® и 0,05% силикона, в чане на 4000 л и ферментацию проводят при 25°С в течение 168 часов с перемешиванием при 140 об/мин и аэрации 1500 л/мин.

Таким образом полученный культивированный бульон фильтруют с использованием 50 кг диатомовой земли. Лепешки мицелий экстрагируют 1000 л ацетона с получением 1000 л экстракта. Ацетоновый экстракт из лепешек мицелий и фильтрат (2700 л) объединяют с получением сырого образца.

Пример 1

Разделение колоночной хроматографией с использованием Diaion® HP20SS в качестве неионной адсорбирующей смолы и элюента, содержащего нитрат серебра

Смесь (200 мг) такролимуса, аскомицина и 17-пропил-1,14-дигидрокси-12-[2-(4-гидрокси-3-метоксициклогексил)-1-метилвинил]-23,25-диметокси-13,19,21,27-тетраметил-11,28-диокса-4-азатрицикло[22.3.1.0 ^4,9]октакоз-18-ен-2,3,10,16-тетраона (называемого в дальнейшем “соединением А”) в 50% водном ацетоне подвергают колоночной хроматографии с использованием Diaion® HP20SS (20 мл) так, чтобы вещества, содержащиеся в смеси, адсорбировались. Затем такролимус, аскомицин и соединение А элюируют при комнатной температуре с использованием 50% (об./об.) водного ацетона, содержащего нитрат серебра (0,294 моль/л), и 60% (об./об.) водного ацетона в качестве элюентов при загрузке 9,5 г/L-R в расчете на такролимус. Контрольное тестирование также проводили таким же способом с использованием водного ацетона в качестве элюента, который не содержит нитрат серебра. Результаты показаны на фиг.1 и фиг.2.

Пример 2

Разделение колоночной хроматографией с использованием Diaion® HP20SS в качестве неионной адсорбирующей смолы и элюента с нитратом серебра

Сырой образец (300 мл), полученный в примере получения 1, подвергают колоночной хроматографии с использованием Diaion® HP20SS так, чтобы содержащиеся вещества адсорбировались. Колонку промывают 40% водным ацетоном (100 мл). После этого смесь такролимуса и 17-аллил-1,14-дигидрокси-12-[2-(3,4-дигидрокси-циклогексил)-1-метилвинил]-23,25-диметокси-13,19,21,27-тетраметил-11,28-диокса-4-азатрицикло[22.3.1.0 ^4,9]октакоз-18-ен-2,3,10,16-тетраона (называемый в дальнейшем “соединением В”) элюируют при комнатной температуре с использованием в качестве элюента 50% (об./об.) водного ацетона, содержащего нитрат серебра (0,294 моль/л). Затем в тех же самых условиях смесь аскомицина и соединения А элюируют отдельно с использованием 60% (об./об.) водного ацетона.

Количество каждого соединения, содержащегося в отдельных фракциях, полученных таким образом, определяют по ВЭЖХ (подвижная фаза: ацетонитрил/10% водный раствор эфира полиоксиэтилена и лаурилового спирта (Nakalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan)/вода = 40/10/50; колонка: TOSOH TSK-gel ODS-80Tm (5 мкм, 4,6 × 150 мм); температура: 75°С, длина волны для детектирования: 210 нм; скорость потока: 1,0 мл/мин; количество для впрыскивания: 20 мкл). Результаты разделения смеси такролимуса и соединения В, аскомицина и соединения А показаны в таблице 1.

Таблица 1
№ фракции	Элюент	Распределение смеси такролимуса и соединения В	Распределение аскомицина	Распределение соединения А
0	Сырой образец	100%	100%	100%
1	Проходящая жидкость	0%	0%	0%
2	40% водный ацетон (промывочная жидкость)	0%	0%	0%
3	50% водный ацетон, содержащий нитрат серебра (0,294 моль/л)	99,7%	19,2%	0%
4	60% водный ацетон (вытесняющая жидкость)	0,3%	80,8%	90,7%
5	100% ацетон (вытесняющая жидкость)	0%	0%	9,3%
вычислено из отношения площадей пиков относительно такролимуса.

Как ясно видно из таблицы 1, такролимус, соединение В, аскомицин и соединение А не элюировались с проходящей жидкостью (фракция 1) или в промывочную жидкость (фракция 2). Они были полностью адсорбированы смолой. Элюированием раствором нитрата серебра (фракция 3) такролимус и соединение В собирали приблизительно в количестве 100% и элюирование соединения А было ниже обнаруживаемого уровня. Во фракции, вытесненной 60% водным ацетоном (фракция 4), аскомицин и соединение А были селективно собраны в количестве приблизительно 100%.

Таким образом, абсорбцией смеси высокомолекулярных лактонсодержащих соединений, имеющих низшую алкенильную группу в качестве боковой цепи (такролимус и соединение В) и аналогичных им соединений (аскомицин и соединение А) на неионной адсорбирующей смоле и элюированием, содержащим ионы серебра водным растворителем, можно отделить высокомолекулярные лактонсодержащие соединения, имеющие низшую алкенильную группу в качестве их боковой цепи.

Кроме того, вышеприведенные результаты показывают, что были также разделены высокомолекулярные лактонсодержащие соединения, имеющие низшую алкильную группу в качестве их боковой цепи (аскомицин и соединение А).

Пример 3

Разделение колоночной хроматографией с использованием основного активированного оксида алюминия, АС12

Фракции, содержащие смесь такролимуса и соединения В, полученные в примере 2, концентрируют и экстрагируют этилацетатом. Органический слой сушат сульфатом магния и затем упаривают досуха. Полученный остаток подвергают колоночной хроматографии с использованием основного активированного оксида алюминия, АС12 (20 мл), заполненного этилацетатом. При комнатной температуре элюирование проводят, используя этилацетат (400 мл) в качестве элюента, и получают отдельные фракции (20 мл × 1 и 200 мл × 2).

Количество каждого соединения, содержащегося в отдельных фракциях, полученных таким образом, определяют ВЭЖХ таким же способом, как в примере 2. Результаты разделения такролимуса и соединения В приводятся в таблице 2.

Таблица 2
№ фракции	Количество жидкости	Такролимус	Соединение В
1	20 мл	0%	0%
2	100 мл	59,7%	0%
3	100 мл	10,4%	0%
Всего	220 мл	70,1%	0%

Как ясно видно из таблицы 2, адсорбцией смеси высокомолекулярного лактонсодержащего соединения, имеющего низшую алкоксигруппу в качестве боковой цепи (такролимус), и аналогичного ему соединения (соединение В) на основном активированном оксиде алюминия и элюированием органическим растворителем можно выделить лактонсодержащее соединение с высокой молекулярной массой, имеющее низшую алкоксигруппу в качестве боковой цепи.

Кроме того, вышеуказанные результаты показывают, что можно также отделить высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, имеющее гидроксигруппу в качестве боковой цепи (соединение В).

Такролимус, который является высокомолекулярным лактонсодержащим соединением, имеющим низшую алкенильную группу и низшую алкоксигруппу в качестве боковых цепей, разделяли, осуществляя примеры 2 и 3, т.е. проведением стадии адсорбции неионной адсорбирующей смолой и элюирования водным растворителем, содержащим ионы серебра, и стадии адсорбции основным активированным оксидом алюминия и элюирования органическим растворителем в прямом или в обратном порядке с раствором, содержащим смесь такролимуса и аналогичного ему соединения.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

В соответствии с настоящим изобретением высокомолекулярное лактонсодержащее соединение, имеющее, по меньшей мере, одну из низшей алкенильной группы и низшей алкоксигруппы в качестве боковой цепи(ей), можно отделить от аналогичного соединения(ий) с неожиданно высокой эффективностью проведением либо одной либо обеих стадий из стадии адсорбции неионной адсорбирующей смолой и элюирования водным раствором, содержащим ионы серебра, и стадии адсорбции на основном активированном оксиде алюминия и элюирования органическим растворителем.