конъюгат окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином для иммунохимического способа определения окситетрациклина

Формула изобретения

Конъюгат антибиотика окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) для иммунохимического метода определения окситетрациклина общей формулы

где n=2-10,

полученный путем реакции окситетрациклина и формальдегида с бычьим сывороточным альбумином в присутствии воды или смеси воды с метанолом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области органической химии, в частности к конъюгату окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) для иммунохимического способа определения окситетрациклина. Иммунохимический способ определения окситетрациклина в тканях и физиологических жидкостях животных не разработан. Предпочтительным для иммунохимического способа определения окситетрациклина в тканях и физиологичеких жидкостях животных явился бы его конъюгат с БСА, но источников информации по данному вопросу не обнаружено.

Цель изобретения - конъюгат окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) общей формулы

где п=2-10,

предназначенный для определения окситетрациклина в тканях и физиологичеких жидкостях животных иммунохимическим способом, полученный путем реакции окситетрациклина и формальдегида с БСА в водной среде или в смеси воды с метанолом.

Конъюгат получен методом, основанным на реакции Манниха [1]. Для этого окситетрациклин (1) конденсируют с бычьим сывороточным альбумином (БСА) с помощью формальдегида при 20°С в водной среде.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

К раствору, содержащему 150 мг БСА в 8 см ³ воды, прибавляют 2 см 3 н раствора ацетата натрия и доводят рН до 6,7 с помощью 5%-ного едкого натра.

К полученному раствору прибавляют последовательно раствор 50 мг окситетрациклина гидрохлорида (1) в 12 см³ воды и 2 см³ 7,5%-ного раствора формальдегида, рН раствора вновь доводят до 6,7. Реакционную смесь перемешивают 2 ч в закрытом сосуде на магнитной мешалке при комнатной температуре, после чего диализуют в проточной водопроводной воде в течение 3 суток и центрифугируют 30 мин при 15 000 об/мин.

В надосадочной жидкости определяют количество белка методом Лоури и количество связанного окситетрациклина (1) спектрофотометрическим методом, после чего раствор конъюгата лиофилизируют.

Получают 125 мг конъюгата (2).

[] ²⁵_D-40,8° (25 мг в 5 см³ трис-буфера при рН 8,0).

_макс 340 нм (ацетатный буфер рН 7,4).

Конъюгат содержит в среднем 7,8 молекул окситетрациклина (1) на 1 моль БСА.

В ИК-спектре конъюгата (2) найдены полосы, характерные для гаптена (1).

ИК-спектр (КВг), см^-1: 3379, 3311, 3108, 1672, 1616, 1584, 1535, 1359, 1233,1004,950 и 676.

Пример 2.

Конденсацию окситетрациклина (1) с БСА осуществляют, как описано в примере 1, в водной среде, а также в смеси воды с диоксаном и воды с метанолом при иных условиях реакции и составе реакционных смесей.

В молярном отношении окситетрациклин и формальдегид применяют в большом избытке относительно БСА.

Условия получения конъюгата окситетрациклина с БСА и его характеристика представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 следует, что увеличение количества формальдегида в реакционной смеси несущественно, однако повышение концентрации окситетрациклина в ней полезно. Использование диоксана ухудшает результаты реакции, а метанола, напротив, дает положительный эффект.

Положительное влияние оказывает разбавление реакционной массы водой. Изменение рН от 6,5 до 8,0 и времени реакции с 0,5 до 24 ч незначительно влияет на результаты реакции.

Максимальная концентрация белка в конъюгате, достигнутая в опытах, составляет 6 мг/см ³, а наибольшее количество молекул окситетрациклина, связанных с одним молем БСА, равно 10.

Пример 3.

Получают кроличью антисыворотку, специфичную к окситетрациклину (1), путем иммунизации трех кроликов-самцов массой 2-3 кг конъюгатом окситетрациклина с БСА (2), полученного по примеру 1, в количестве 0,1 мг на животное. 0,1 мг конъюгата перед введением разводят в 1,5 см³ стерильного изотонического раствора и эмульгируют в 1,5 см ³ полного адъюванта Фрейнда. Антиген вводят подкожно в 30-40 точек в область спины. Через 4 недели после иммунизации проводят реиммунизацию животных водным раствором антигена без адъюванта. Через 1 неделю после реиммунизации у кроликов отбирают кровь из краевой вены уха и получают сыворотку.

Полученную сыворотку смешивают с глицерином в равных соотношениях, расфасовывают по 1 см³ в пробирки типа эппендорфов и хранят при минус 20°С в течение 2 лет.

Титр антисыворотки к конъюгату окситетрациклина с БСА (2), полученного по примеру 1, в непрямом твердофазном ИФА равен 12 800.

Пример 4.

Полученную по примеру 3 иммунную кроличью сыворотку в разведении 1:12 800 используют для определения количества окситетрациклина (1) в его растворах с известными концентрациями (1,0; 10,0 и 100 нг/см ³).

Для этого иммунологический полистероловый планшет сенсибилизируют раствором конъюгата окситетрациклина с БСА, полученного по примеру 1. После чего в лунки дозируют растворы специфических кроличьих антител и растворы окситетрациклина с известными концентрациями (1,0; 10,0 и 100 нг/см³ ), которые конкурируют за участки связывания антител с твердофазным антигеном в ИФА. Не связавшиеся антитела удаляют промыванием. Количество связавшихся специфических антител определяют с помощью вторичных (антивидовых) антител, меченных пероксидазой хрена и выявляемых раствором субстрата, содержащего хромоген - ортофенилендиамин и перекись водорода. В результате реакции перекиси водорода с пероксидазой хрена в молекулах связавшегося пероксидазного конъюгата хромоген окрашивает раствор в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окрашивания измеряют на вертикальном спектрофотометре при 492 нм (ОП₄₉₂). Интенсивность окраски (ОП) обратно пропорциональна концентрации окситетрациклина в исследуемых образцах.

Рассчитывают показатель процента связывания антител как отношение средних величин ОП контроля (сыворотка) и опыта (сыворотка+раствор окситетрациклина):

Результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, полученная сыворотка обладает высокой специфичностью и активностью по отношению к окситетрациклину (1). Предел обнаружения содержания окситетрациклина в растворе составляет 0,001 мкг/см ³. Конъюгат (2) может быть использован для иммунохимического способа определения окситетрациклина (1) в физиологических жидкостях и тканях животных.