способ получения пептидов

Формула изобретения

1. Способ получения соединений, содержащих одну или более амидных связей, с использованием избытка активированного карбоксильного компонента, который ацилирует аминокомпонент, в котором после ацилирования амин, включающий латентный анион, представляющий собой производное блокированной аминокислоты, используется в качестве акцептора остаточных активируемых карбоксильных функций.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что латентный анион в акцептирующем амине несет временную защитную группу, которая может селективно удаляться в присутствии любой перманентной защитной группы, присоединенной к наращиваемому пептиду.

3. Способ по любому из п.1 или 2, отличающийся тем, что латентный анион в акцептирующем амине несет временную защитную группу, которая проявляет лабильность, аналогичную лабильности временной защитной группы, представленной на N-конце наращиваемого пептида.

4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что временные защитные группы представляют собой гидрогенолитически удаляемые группы, а перманентные защитные группы представляют собой ацидолитически удаляемые группы.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что временные защитные группы являются группами бензильного типа.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что акцептор представляет собой первичный амин, включающий латентный анион.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что первичный амин представляет собой производное аминокислоты, блокированное на С-конце.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой -аланин или его производное.

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что акцептор представляет собой бензил--аланинат или его соль.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что осуществляется в растворе.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что получают пептид.

12. Соединение, содержащее одну или более амидных связей, полученное в соответствии со способом, включающим способ по любому из пп.1-11.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новому и универсальному способу получения соединений, содержащих одну или более амидных связей, в частности, в пептидах, особенно к способам, осуществляемым в растворе.

Пептиды синтезируют либо в растворе, либо на твердом носителе. В обоих методах стадии конденсации и деблокирования чередуются в повторах и могут разделяться периодическими выделениями очисткой. Избыток активированного карбоксильного компонента предпочтительно используется на каждой стадии конденсации для обеспечения количественной конденсации с аминокомпонентом; поэтому случаи утраты последовательностей в конечном продукте могут быть исключены. В твердофазном пептидном синтезе остаточный активируемый карбоксильный компонент обычно удаляется путем фильтрации в конце каждой стадии конденсации. Обычно считают, что при синтезе в растворимой фазе остаточный активируемый карбоксильный компонент разрушается и удаляется во время периодической водной обработки. Наряду с этим, встраивание пептидных последовательностей, часто встречаемое при синтезе в растворимой фазе как загрязнение конечного пептида, связано с неполным удалением после стадии конденсации остаточного (активируемого) карбоксильного компонента, который присоединяется позднее по прошествии стадии деблокирования. Для того чтобы избежать возникновения указанных побочных реакций, стадию акцептирования можно вводить сразу после стадии конденсации, что акцептирует (инактивирует) остаточные активируемые карбоксильные функции. В качестве акцепторов обычно применяют амины. Применение полиаминов в качестве акцепторов дает акцептируемые соединения, которые, в зависимости от их полярности, могут активно экстрагироваться в водную фазу, предпочтительно в кислую водную фазу [например, Kisfaludy, L. et al. (1974) Tetrahedron Lett. 19, 1785-1786]. Эту экстракцию обычно осуществляют перед стадией деблокирования, чтобы исключить потерю наращиваемого пептида в водной фазе. Однако обнаружено, что во многих случаях данная операция приводит к неполному периодическому выделению очисткой, что обусловлено гидрофобностью акцептируемого соединения: естественная гидрофобность, присущая аминоацильной части карбоксильного компонента, усиливается все еще присутствующей аминоблокирующей группой. Поэтому водное экстрагирование не вполне эффективно.

Недавно Carpino, L.A. et al. [(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338] сообщили об усовершенствовании способа акцептирования. Помимо использования полиамина в качестве акцептора амино-блокирующей группы, в данном способе применили 1,1-диоксобензо [b] тиофен-2-илметоксикарбонил (Bsmoc). Функция Bsmoc обладает высокой лабильностью по отношению к основанию. В результате этого остаточные активируемые карбоксильные функции являются акцептируемыми, а функции Bsmoc устраняются в одной и той же стадии при использовании полиамина.

В настоящее время разработан новый способ получения пептидов, в котором избыток активированного карбоксильного компонента используется для ацилирования аминокомпонента и в котором после ацилирования аминосоставляющей свободный анион или латентный анион (т.е. анион, образующийся после деблокирования) используется в качестве акцептора активируемых карбоксильных функций. Данный новый способ позволяет фактически произвольно выбрать защитную группу на N-конце активированного карбоксильного компонента, поскольку, в противоположность способу Carpino, его деблокирование не является обязательным при тех же реакционных условиях, что и акцептирование избытка активируемых карбоксильных функций. Более того, способ настоящего изобретения позволяет с высокой эффективностью удалять остаточный активируемый карбоксильный компонент, не встречая трудностей, связанных с гидрофобностью или с иными процессами в данной области техники, в котором в качестве акцепторов используются полиамины. Предпочтительно, способ настоящего изобретения осуществляют в растворе. Вместе с тем данный способ можно также применять в твердофазном пептидном синтезе. Способ настоящего изобретения пригоден также для получения иных соединений, содержащих одну или более амидных связей.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения амин, включающий латентный анион, используется в качестве акцептора. Предпочтительно, латентный анион в акцептирующем амине несет временную защитную группу, которую можно избирательно удалить в присутствии перманентной защитной группы, присоединенной к наращиваемому пептиду. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения защитная группа латентного аниона в акцептирующем амине проявляет лабильность, аналогичную лабильности временной защитной группы, присутствующей на N-конце наращиваемого пептида. Это позволяет деблокировать акцептор, дающий этот анион, и деблокировать N-конец наращиваемого пептида для осуществления одностадийного способа. Особенно предпочтительным является способ настоящего изобретения, в котором временные защитные группы, присутствующие на N-конце наращиваемого пептида и необязательно присутствующие в акцепторе, представляют собой гидрогенолитически удаляемые группы, тогда как перманентные деблокирующие группы представляют собой ацидолитически удаляемые защитные группы. Предпочтительно, указанные временные защитные группы представляют собой группы бензильного типа, например (замещенные) бензильные и бензилоксикарбонильные группы. Предпочтительный акцептор представляет собой первичный амин, включающий свободный анион или латентный анион, и в особенности аминокислотное производное, блокированное на С-конце. Кроме карбоксилата, акцептирующий амин может включать другие анионные функции, такие как, но не ограниченные, сульфонатная, сульфатная, фосфонатная, фосфатная или фенолятная. Высоко предпочтительной аминокислотой для использования в качестве акцептора является -аланин или его производное (например, производное сложного эфира или силилирующего сложного эфира). Наиболее предпочтительным акцептором является бензильный -аланинат или его соль.

В соответствии со способом настоящего изобретения тиол, включающий свободный или латентный анион, также может использоваться в качестве акцептора вместо амина, включающего свободный или латентный анион.

Акцептор предпочтительно используется в двух-шестикратном молярном избытке по отношению к остатку активного компонента, который нужно акцептировать.

Такое использование акцептора в соответствии с настоящим изобретением дает гидрофильные акцептируемые соединения, которые после стадии деблокирования могут активно экстрагироваться в щелочной водной фазе: после деблокирования (в случае применения), у акцептируемых видов усиливается гидрофильность из-за присутствия свободной аминофункции и свободной карбоксильной функции. Таким образом, способ настоящего изобретения дает очень эффективное периодическое выделение очисткой, обусловленное возможностью активно экстрагировать гидрофильное акцептируемое соединение. Кроме того, по-видимому, присутствующий избыток карбоксильного компонента, который не активируется и временная защитная группа которого также была удалена во время деблокирования, экстрагируется из реакционной смеси в это же время.

Новый способ настоящего изобретения удобно использовать для получения олиго- и полипептидов и, вообще, для получения соединений, содержащих одну или более амидных связей.

В соответствии с настоящим изобретением подходящий способ заключается в конденсации избытка карбоксильного компонента с аминокомпонентом, в котором карбоксильная функция преактивируется или активируется in situ с использованием конденсирующего агента и, при необходимости, добавки. Вслед за стадией конденсации остаточные активируемые карбоксильные функции акцептируются в результате добавления акцептора в реакционную смесь. Затем временные защитные группы удаляются с использованием подходящих методов, известных в данной области техники, с последующим удалением акцептируемого соединения щелочной водной экстракцией. В это же время, по-видимому, присутствующий избыток карбоксильного компонента, который не активируется и временная защитная группа которого также была удалена во время деблокирования, экстрагируется из реакционной смеси.

Термин аминокомпонент относится к молекуле, включающей свободную аминофункцию. В частности, данный аминокомпонент может представлять собой любой амин, аминокислоту или олигопептид, который несет свободную аминофункцию и у которого другие функциональные группы защищены таким образом, что они не препятствуют требуемой реакции конденсации. С-концевая функция используемой аминокислоты или олигопептида может быть защищена (блокирована) в виде замещенного или незамещенного амида или в виде сложного эфира; примеры последнего включают, но не ограничены, метильный, этильный, трет-бутильный, бензильный, фенацильный, 3-(3-метил)пентильный (Мре), 2-(2-фенил)пропильный (Рр), 2-хлортритильный (Clt), дифенил(4-пиридил) метильный (PyBzh), дициклопропилметильный (Dcpm), 9-флуоренилметильный (Fm), аллильный (АН), 2-(триметилсилил)этильный (Tmse), 4-{N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]амино}бензильный (Dmab) эфиры и ферментативно расщепляемые сложные эфиры [Roeske, R.W. (1981) в ‘The Peptides’, vol.3 (Gross, E. and Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp.101-136; по Мре: Karlstrom, A. and Unden, A. (1996) Tetrahedron Lett. 37, 4343-4246; по Рр: Yue, С. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34. 323-326; по Cit: Athanassopoulus, P. et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648; no PyBzh: Mergler, M. et al. (2001) P154, 2^nd International Peptide Symposium & 17^th American Peptide Symposium; no Dcpm: Carpino, L.A. et al. (1995) J. Org. Chem. 60, 7718-7719; no Fro: Al-Obeidi, F. et al. (1990) Jnt. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218; no All: Kunz, H. et al. (1985) Jnt. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497; no Tmse: Sieber, P. (1977) Helv. Chim Ada 60, 2711-2716; no Dmab: Chan, W.C. et al. (1995) J. Chem. Soc., Chem Commun., 2209-2210]. Функции трет-бутильного типа или функции аналогичной лабильности предпочтительны для перманентной защиты других функциональных групп в аминокомпонентах; они включают, но не ограничены, трет-бутильную (^tВu) для защиты боковых цепей Asp, Glu, Ser, Thr и Тyr, трет-бутоксикарбонильную (Воc) для защиты боковых цепей Lys и Тrр, тритильную (Trt) для защиты боковых цепей Asn, Gln и His и 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонильную (Рmc) или 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильную (Pbf) для защиты боковой цепи Arg [Barany, G. and Merrifield, R.B. (1980) в: ‘The Peptides’, vol.2 (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.) Academic Press, New York, pp.1-284; no Trp (Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700; no Asn (Trt) и Gln (Trt): Sieber, P. and Riniker B. (1991) Tetrahedron -Lett. 32, 739-742; по His(Trt): Sieber, P. and Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; no Pmc: Ramage, R. and Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; no Pbf: Carpino, L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832].

Термин карбоксильный компонент относится к молекуле, включающей свободную карбоксильную функцию. В частности, карбоксильный компонент может представлять собой карбоновую кислоту, аминокислоту или олигопептид, который несет свободную карбоксильную функцию, а другие функциональные группы которого защищены таким образом, что они не препятствуют искомой реакции конденсации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аминогруппа применяемой аминокислоты или олигонуклеотида временно защищена с помощью бензилоксикарбонильной (2) функции; другие примеры включают, но не ограничены, функции Воc, Trt, флуорен-9-илметоксикарбонильную (Fmoc), 2-(метилсульфонил)этоксикарбонильную (Msc), аллилоксикарбонильную (Alloc), функции арилсульфонильного типа, такую как орто-нитробензолсульфонильная (o-NBS), и ферментативно расщепляемые функции [Geiger, R. and Konig, W. (1981) in: ‘The Peptictes’, vol.3 (Gross, E and Meienhofer, J. eds.) Academic Press, New York, pp.1-99; no Alloc: Kunz, H. and Unverzagt, C. (1984) Angew. Сhem. 96, 426-427; по арилсульфонилу: Fukuyama, Т. et al, (1997) Tetrahedron Lett. 38, 5831-5834]. Функции трет-бутильного типа или функции подобной лабильности предпочтительны для перманентной защиты других функциональных групп в карбоксильном компоненте, как описано выше для аминокомпонента. Карбоксильный компонент может быть преактивирован в виде активного сложного эфира, предпочтительно сложного эфира N-гидроксисукцинимида, бензотриазол-1-ила, пентафторфенила или 4-нитрофенила, галогенида, N-карбоксиангидрида или в виде симметричного ангидрида. Альтернативно, карбоксильный компонент может быть активирован in situ в виде смешанного ангидрида или с использованием конденсирующего агента, такого как карбодиимид, предпочтительно N/N’-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (EDC), урониевой или фосфониевой соли, как вероятной конденсирующей добавки, предпочтительно N-гидроксисукцинимида (HONSu), 1-гидроксибензотриазола (HOBt), 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазина (HOOBt), 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HOAt) или 6-хлор-1-гидроксибензотриазола (Cl-HOBt) и, при необходимости, в присутствии третичного амина [‘The Peptldes’, vol.1 (1979) (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.) Academic Press, New York; Li, P. and Xu, J.-C. (2000) Chin. J. Chem. 18, 456-466].

Временная защитная группа может быть удалена в соответствии со способами, известными в данной области техники (см. выше). Z-функцию можно удалить с помощью гидрогенолиза с использованием стандартных методик, например, газообразным водородом или формиатом в качестве донора водорода. Во время этого процесса все защитные группы бензильного типа удаляются, а защитные группы трет-бутильного типа или функции, соответствующие лабильности, сохраняются. Последние могут быть удалены путем ацидолиза в соответствии со способами, известными в данной области техники.

Специалистам в данной области техники понятно, что означает термин щелочная водная экстракция. Однако щелочные водные экстракции предпочтительно осуществляют с использованием водных растворов кислой углекислой соли или карбоната натрия, если требуется, в присутствии хлорида натрия или нитрата калия. Термин активная водная экстракция относится к экстракции, в которой либо аминокомпонент экстрагируется в кислой среде в протонированной форме (аммоний), либо карбоксильный компонент экстрагируется в щелочной среде в депротонированной форме (карбоксилат).

Далее настоящее изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами, которые не рассматриваются как ограничение настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

H-Asp (O^tBu)-Phe-O ^tBu

К перемешиваемой суспензии, состоящей из 5,52 г H-Phe-C^tBu.HCl в смеси с этилацетатом и дихлорметаном при 20°С, добавляют 7,76 г Z-Asp(O^tBu)-ОН, 3,24 г 1-гидроксибензотриазола, 4,20 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и 4,62 мл 4-морфолина. После перемешивания в полученную смесь, еще до завершения реакции, добавляют 1,21 мл 4-метилморфолина и добавляют 3,51 г бензил--аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Эту смесь перемешивают в течение следующих 30 мин и экстрагируют 5% Na₂CO₂ /10% NaCl, 5% KHSО₄/10% NaCl и 5% Na₂CО ₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий блокированный дипептид Z-Asp(O^tBu)-Phe-O^tBu, подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. По завершении данной реакции добавляют 5% Na₂CO ₃/10 NaCl и полученную суспензию фильтруют. Остаток промывают смесью этилацетата и дихлорметана, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Nа₂СО₃/10% NaCl, 30% NaCl и водой. Полученный органический слой упаривают досуха с количественным получением требуемого дипептида на выходе.

Очистка: 98,4% в обращенно-фазовой ВЭЖХ (24-68% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте за 29 мин при 220 нм, 2,0 мл/мин., 5-микронная колонка C₁₈). Идентичность: m/z 393,4 [М+Н]⁺ в электрораспылительной MS; ¹H ЯМР (CDCl₃) (1,41 (с, 9Н), 1,46 (с, 9Н), 1,63 (ушир.с, 2Н), 2,39 (дд, 1Н), 2,79 (дд, 1Н), 3,39 (д, 2Н), 3,65 (м, 1Н), 4,72 (м, 1Н), 7,17-7,32 (м, 5Н), 7,81 (д, 1Н).

ПРИМЕР 2

H-Leu-Phe-NH-(CH₂)₇-СН₃

К перемешиваемому раствору, состоящему из 2,12 мл н-октиламина в этилацетате при 20°С, добавляют 4,61 г Z-Phe-ОН, 2,08 г 1-гидроксибензотриазола, 2,71 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и 1,55 мл 4-метилморфолина. После перемешивания к полученной суспензии, еще до завершения реакции, добавляют 0,78 мл 4-метилморфолина и 2,26 г бензил--аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Эту смесь перемешивают в течение следующих 30 мин и экстрагируют с помощью 5% Na₂CO ₃/10% NaCl, 5% KHSО₄/10% NaCl и 5% Nа ₂СО₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий Z-Phe-NH-(СН₂)₇-СН₃, разбавляют 1-метил-2-пирролидиноном и подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. По завершении реакции добавляют 30% NaCl и полученную суспензию фильтруют. Остаток промывают этилацетатом, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Na₂CO₃/10% NaCl и 30% NaCl.

К органическому слою, содержащему H-Phe-NH-(СН₂) ₇-СН₃ при 20°С, добавляют 4,09 г Z-Leu-OH, 2,08 г 1-гидроксибензотриазола, 2,71 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида, 1,55 мл 4-метилморфолина и 1-метил-2-пирролидинона. После перемешивания к полученной суспензии, еще до завершения реакции, добавляют 0,78 мл 4-метилморфолина и 2,26 г бензил--аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Эту смесь перемешивают в течение следующих 30 мин и экстрагируют с помощью 30% NaCl, 5% Na ₂CO₃/10% NaCl, 5% KHSO₄/10% NaCl и 5% Nа₂СО₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий Z-Phe-NH-(CH₂) 7-СН₃, разбавляют 1-метил-2-пирролидиноном и подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. По завершении реакции добавляют 5% Na₂CO₃/10% NaCl и полученную суспензию фильтруют при 45°С. Остаток промывают этилацетатом, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Nа ₂СО₃/10% NaCl, 30% NaCl и водой.

Полученный органический слой упаривают досуха с получением на выходе 85% требуемого продукта.

Очистка: 99,3% в обращенно-фазовой ВЭЖХ (24-68% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте за 29 мин при 220 нм, 2,0 мл/мин, 5-микронная колонка C₁₈ ). Идентичность: m/z 390,4 [М+Н]⁺ 412,4 [М+Na] ⁺, 388,2 [М-Н]^-, 434,2 [М+НСОО]^- в электрораспылительной MS; ¹H ЯМР (СОСl₃ ) 0,89 (м, 9Н), 1,12-1,39 (м, 14Н), 1,50-1,60 (м, 3Н), 3,01-3,22 (м, 4Н), 3,35 (дд, 1Н), 4,53 (дд, 1Н), 5,90 (т, 1Н), 7,19-7,32 (м, 5Н), 7,83 (д, 1Н).

Заключение: Степень очистки и идентификация получаемого продукта свидетельствуют о том, что при использовании способа настоящего изобретения избыток (активируемого) карбоксильного компонента удаляется полностью, а встраиваемые пептидные последовательности не образуются.