способ выделения и очистки аллергенов травяной пыльцы

Формула изобретения

1. Способ выделения травяных аллергенов групп 1, 2, 3, 10 и 13, отличающийся тем, что получают водный экстракт пыльцы Graminae и растворимые компоненты подвергают хроматографии гидрофобного взаимодействия, стадии гель-фильтрации и, при желании, катионобменной хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для экстрагирования применяют пыльцу видов: Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerate, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Poa pratensis, Sеcale cereale.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что экстрагирование проводят при помощи трис/НСl-буферизированного водного раствора.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на первой стадии аллергены групп 1, 2, 3, 10 и 13 отделяют от других компонентов при помощи хроматографии гидрофобного взаимодействия.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что аллергены групп 1 и 13 получают в отдельных фракциях при помощи последующей стадии гель-фильтрации и отделяют от аллергенов групп 2, 3 и 10.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что аллергены групп 2, 3 и 10, полученные после стадии гель-фильтрации, отделяют друг от друга при помощи последующей катионообменной хроматографии.

7. Способ для диагностики in-vitro аллергий на пыльцу с применением аллергенов, полученных способом по пп.1-6.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу быстрого и эффективного выделения и очистки пяти аллергенов из групп 1, 2, 3, 10 и 13 из травяной пыльцы. Природное сырье, использованное для очистки аллергена, представляет собой свежесобранные травы, такие как, например, Phleum pratense. Очистка основывается на новой комбинации хроматографии гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрации и катионобменной хроматографии. Полученные таким образом протеины можно применять для усовершенствованной диагностики пыльцовых аллергенов и для фармацевтических препаратов для терапии заболеваний аллергией, вызванных пыльцой.

Аллергии типа 1 имеют мировое значение. До 20% населения в индустриализованных странах страдает от заболеваний, таких как аллергические риниты, конъюктивиты или бронхиальная астма, вызванными аллергенами, присутствующими в воздухе (аэроаллергены), которые имеют различные источники, такие как растения, клещи, кошки и собаки. В свою очередь, до 40% страдающих аллергией типа 1 проявляют специфическую IgE реактивность в случае аллергенов травяной пыльцы (Freidhoff и др., 1986, J Allergy Clin Immunol 78, 1190-201).

Вещества, вызывающие аллергию типа 1, представляют собой протеины, гликопротеины или полипептиды. После попадания внутрь через слизистые мембраны, эти аллергены реагируют с молекулами IgE, связанными с поверхностью мачтовых клеток у людей, имеющих к ним чувствительность. Если две или более молекул IgE связываются друг с другом через аллерген, это приводит к секреции медиаторов (например, гистамина, простогландинов) и цитокинов эффекторными клетками и, таким образом, к соответствующим клиническим симптомам.

В зависимости от относительной частоты страдающих аллергией, имеющих IgE антитела против некоторых аллергенов, делают различие между основными и второстепенными аллергенами. В случае тимофеевки луговой (Phleum pratense), Phi p 1 (Petersen и др., 1993, J.Allergy Clin. ImmunoL 92, 789-796),Phi p 5 (Metthiesen и Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen и др., 1992). Phi p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) и Phi p 2/3 (Dolecek и др., 1993) таким образом охарактеризованы как основные аллергены, a Phi p 4 (Lowenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) и группы 10 и 11 из Lolium perenne (Ansari и др., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) как второстепенные аллергены. Дополнительно, недавно был описан еще один имеющий высокий молекулярный вес аллерген, названный Phl p 13. (Suck и др. J.Immunol. Meth. 229 (1999), 73-80). Аллергены группы 1 и группы 13 гликосилированы.

В связи с настоящим изобретением, группы аллергий 1, 2, 3, 10 и 13 являются особенно важными. Традиционные способы очистки природных аллергенов основаны на выделении в каждом случае отдельных протеинов. При помощи аффинной хроматографии, используя специфичные антитела, таким образом были очищены, например, аллергены группы 1 из Lolium perenne (Boutin и др., 1996, Int. Arch. Allergy ImmunoL 112, 218-225) и Phteam pratense (Grobe и др., 1999, Eur. J. Biochem. 263, 33-40). Этот способ имеет ограниченную производительность и проводится с применением экстремальных рН, что ведет к тому, что не гарантируется, что может быть получена природная структура. Другие способы основаны на различных многостадийных последовательностях хроматографических стадий. Отдельные аллергены, такие как, например, группа 10 (Ansari и др., 1987, J Allergy Clin Immunol 80, 229-235) или группа 3 (Ansari и др. 1989, Biochemistry 28, 8665-8670), получают по каждому из этих способов. Другие аллергены теряются или не могут быть получены в чистой форме при этих способах.

Данные о последовательности ДНК доступны, среди прочих, для Phi p 1 (Laffer и др., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94,1190-98; Petersen и др., 1995. J, Allergy Clin. Immunol. 95 (5), 987-994). Phi p 5 (Vrtala и др.. 1993. J. Immunol. 151 (9), 4773-4781), Phi p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol 108 (1.) 55-59) и Phi p 2 (Dolecek и др., 1993, FEBS 335 (3), 299-304). При помощи последовательностей кДНК можно получать рекомбинантные аллергены, которые можно применять при диагностике и терапии (Scheiner и Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).

Классический подход к эффективному терапевтическому лечению аллергий представляет собой специфическую иммунотерапию или гипосенситизацию (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6), 336-339; Bousquet и др., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102 (4), 558-562). При этих способах пациенту вводят подкожную инъекцию экстрактов природных аллергенов в возрастающих дозах. Тем не менее, этот метод содержит риск аллергических реакций или даже анафилактического шока. Чтобы свести к минимуму эти риски, применяют новые препараты в виде аллергоидов. Они представляют собой химически модифицированные экстракты аллергенов с существенно сниженной IgE-реактивностью, но с Т-клеточной реактивностью, идентичной по сравнению с необработанным экстрактом.(Fiеbig, 7995, Allergo J. 4 (7), 377-362).

Оптимизация терапии в большей степени была бы возможна при наличии высокоочищенных аллергенов. Определенные коктейли из природных аллергенов способны заменить ранее известные экстракты, так как последние, кроме различных аллергенов, содержат относительно большое количество иммуногенных, но неаллергенных сопутствующих протеинов, в которых при специфической иммунотерапии нет необходимости. Применение аллергеновых коктейлей также позволяет получать пациент-специфические смеси аллергенов, соответствующие спектру сенситизации. Реальные перспективы, которые могут привести к безопасной гипосенситизации при помощи природных аллергенов высокой частоты, предлагаются при помощи модифицированных аллергенов, в которых IgE эпитопы разрушены при помощи необратимой модификации вторичной и третичной структуры без ослабления Т-клеточных эпитопов, которые имеют значение для терапии.

Подобным образом изобретение может найти применение при диагностике in-vitro и in-vivo аллергических заболеваний, особенно сенной лихорадки. Для этого очищенные группы аллергенов применяют по традиционным способам (WO 98/53321) для определения IgE антител.

Изобретение относится к способу биохимической очистки, которая ведет к выделению 4 основных аллергенов и одного второстепенного аллергена из водных кратковременных экстрактов пыльцы при помощи эффективной трехстадийной очистки. Применяемое природное сырье представляет собой пыльцу Graminae, таких как, например, среди прочих Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus. Фиг.1 показывает схему очистки 5 упомянутых аллергенов из экстрактов травяной пыльцы. Названия аллергенов Phi p 1 до Phi p 13 соответствуют названиям аллергенов 1 до 13, также использованным в тексте.

Изобретение таким образом относится к способу выделения существенно чистых травяных аллергенов групп 1, 2, 3, 10 и 13, при котором получают водный экстракт пыльцы Graminae, и растворимые составляющие подвергают хроматографии гидрофобного взаимодействия, стадии гельфильтрации и, при желании, катионобменной хроматографии.

Согласно изобретению также можно проводить множество стадий одного типа хроматографии, но в общем, способ настолько эффективен, что в каждом случае достаточного одной стадии разделения.

Способ особенно подходит для выделения упомянутых аллергенов из пыльцы видов: Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Festuca pratensis. Holcus lanatus, Poa pratensis, Secale cereale.

При предпочтительном осуществлении, экстрагирование проводят при помощи трис/НСL-буферизированного водного раствора. Тем не менее, также можно применять, согласно изобретению, другие известные водные буферные растворы.

Для очистки упомянутых аллергенов применяют пригодные составляющие экстрактов. Для этого экстракт центрифугируют от 3 до 8 предпочтительно 5 мин, при от 18 000 до 30 000×g, и верхний слой отбирают для дальнейшей очистки. В альтернативном варианте, нерастворимые составляющие можно отделять по другим способам, например, при помощи фильтрации.

Первая стадия хроматографирования проводится при помощи хроматографии гидрофобного взаимодействия, например, на Сефарозе®. При этом большое количество загрязнений связывается на основе, в то время как желаемые аллергены расположены во фракции, которая проходит через колонну. Можно применять другие соответствующие материалы основы.

Изобретение таким образом относится к соответствующему способу, при котором травяные аллергены групп 1, 2, 3, 10 и 13 отделяют от других составляющих при помощи хроматографии гидрофобного взаимодействия.

В последующей стадии очистки травяные аллергены разделяют на фракции, с группами 1 и 13, каждая из которых представляет одну фракцию и группами 2, 3 и 10, представляющими собой третью фракцию. Таким образом, изобретение относится в частности к способу, при котором аллергены групп 1 и 13 получают в отдельных фракциях при последующей стадии гель-фильтрации и отделяют от аллергенов групп 2, 3 и 10.

Последние затем можно отделить друг от друга согласно изобретению при помощи последующей стадии хроматографии через катионный обменник. Таким образом, изобретение относится к способу, в котором аллергены групп 2, 3 и 10, полученные после стадии гель-фильтрации разделяют при помощи последующей катионобменной хроматографии.

Упомянутые аллергены, известные сами по себе, определяют либо исходя из их известных, различных физических, химических, биологических или иммунологических свойств, в частности, при помощи изоэлектрической фокусировки, измерений УФ абсорбции, SDS-PAGE и специфических антител. Эти способы и методы известны и были описаны в общих трудах.

Выход аллергенов, полученных по изобретению составляет 0,5-1,5%, в зависимости от использованного общего количества протеина травяной пыльцы.

Изобретение также служит для улучшения диагностики in-vitro и in-vivo в качестве составляющей идентификации пациент-специфического спектра сенситивизации, включающего аллергенные компоненты. Изобретение также относится к способу диагностики in-vitro аллергий на пыльцу с применением аллергенов, полученных по предложенным способом. Способ осуществляют с использованием традиционно методике (WO 98/53321).

Изобретение таким образом, служит для получения усовершенствованных препаратов для специфической иммунотерапии аллергий на травяную пыльцу, что достигается отделением составляющих экстракта, которые являются иммуногенными, но не имеют отношения к терапии. Более того, можно, при помощи химической реакции очищенных аллергенов получить аллергоидный препарат. Изобретение, таким образом, также относится к фармацевтическому препарату, который включает один или более аллергенов, полученных по способу по изобретению и, при желании, соответствующие вспомогательные вещества и эксципиенты.

Способ детально описан ниже:

Очистка природных аллергенов из пыльцы тимофеевки луговой проводится по трехстадийному способу (см. чертеж). После водной экстракции пыльцы при помощи трис/НС1-буферизированного раствора (20 мМ трис/HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0) на протяжении 30 мин, экстракт отделяют при помощи центрифугирования, предпочтительно при 20 000×на протяжении 5 мин. Трис/НСl-буферизированный (20 мМ трис/HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0) верхний слой обрабатывают 1 М сульфата аммония и затем подвергают хроматографии гидрофобного взаимодействия (Фенил-Сефароза с высоким разрешением, Pharmatica). Типичная колонна укомплектована от 50 до 100 мл материала основы и работает при скорости течения около 5 мл/мин. Фракция, проходящая через колонну включает только протеины пяти аллергенных групп: группы 1 (30-35 кДа), группы 2 (11 кДа), группы 3 (12 кДа), группы 10 (13 кДа) и группы 13 (55-60 кДа).

После этого следует снижение объема, предпочтительно при помощи ультрафильтрации или лиофилизации.

На второй стадии аллергены групп 13 и 1 отделяют от аллергенов с низким молекулярным весом при помощи гель-фильтрации согласно их различным молекулярным весам с применением Супердекса® шкала получения 75 (Pharmacia) или подобных известных материалов основы, пригодных для этой цели. Элюент предпочтительно представляет собой 50 мМ гидрогенкарбонат аммония. Скорость течения в колонне составляет около 5 мл/мин. Получают три фракции, которые включают аллергены 1 и 13 (каждый отдельно) и 2, 3 и 10 (в одной фракции).

Аллергены с низким молекулярным весом групп 2, 3 и 10, которые вымываются вместе в третьей фракции гель-фильтрации, разделяют при помощи катионобменной хроматографии. При этом лиофилизированный образец отбирают в водный буфер, предпочтительно 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,2, и применяют в катинобменной колонне, уравновешенной этим буфером (например, Source S®). Фракция, проходящая через колонну содержит кислотный аллерген 2. Связанные аллергены 3 и 10 вымывают по очереди при помощи около 20 объемов колонны соляного градиента от 0 до 200 NaCl. Таким образом, группу низкомолекулярных аллергенов разделяют на отдельные аллергены. Также можно применять другие катионобменные материалы согласно изобретению.

При помощи способа по изобретению, который обеспечивается и определяется специфической последовательностью хроматографических стадий и выбором среды хроматографирования, данное изобретение таким образом дает возможность высокоточного способа получения для выделения множества высокочистых природных травяных аллергенов, который не является трудоемким или занимающим много времени, и который может быть осуществлен технологически. Так как применяемые методы очистки очень осторожны с протеинами, их структуры и антигенность сохраняются. Это является предпосылкой успешной диагностики аллергических заболеваний.