способ диагностики хронического эндометрита и характера воспаления

Формула изобретения

Способ диагностики хронического эндометрита, включающий клинико-морфологическое обследование, отличающийся тем, что иммуногистоцитохимическим методом в ткани эндометрия определяют показатели местного иммунитета: количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры естественных киллерных клеток CD56+, CD16+ и маркеры активации HLA-DR(II)+, при этом подсчет осуществляют в световом микроскопе при увеличении объектива х40, окуляра х10 в трех полях зрения, и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют отсутствие эндометрита; при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют аутоиммунный хронический эндометрит; при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+, выше 10 в поле зрения диагностируют обострение аутоиммунного хронического эндометрита; при количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит; при количестве клеток, экспрессирующих CD16+, CD56+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хроническое воспаление с аутоиммунным компонентом, но без активации процесса; при количестве клеток, экспрессирующих CD16+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+ и HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хронический эндометрит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, к разделу гинекологии, патологической анатомии и иммунологии.

Проблема изучения воспалительных заболеваний эндометрия у женщин репродуктивного возраста является актуальной, так как вызывает не только нарушение менструальной функции, но и генеративной. Частота встречаемости хронического эндометрита при бесплодии колеблется от 20 до 60% (Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. - 2-е издание. - СПб., 1995.- Кн.2 - С. 46-52), при привычном невынашивании беременности от 60,5 до 86,7% (Демидова Е.М. Привычный выкидыш (Патогенез, акушерская тактика) автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук. - СПб., 1993). Клинические проявления хронического эндометрита неспецифичны, заболевание часто диагностируется случайно при скрининговом обследовании женщин.

Для диагностики хронического эндометрита используют стандартный гистологический метод, учитывающий совокупность общих морфологических признаков хронического воспаления: наличие очаговой лимфо-лейкоцитарной инфильтрации; очагового фиброза стромы; наличие плазматических клеток и склеротических изменений стенок спиральных артерий (Хмельницкий O.K. Патоморфологическая диагностика гинекологических заболеваний. - Спб: Сотис., 1994. С.136-144; Кузнецова А.В. Хронический эндометрит. Архив патологии, 2000, №3, С.48-52). Основным недостатком существующего метода является низкая точность диагностики. Наличие только одного или двух вышеописанных критериев воспаления всегда вызывает сомнение у морфологов в постановке диагноза хронического эндометрита. Других способов верификации диагноза на сегодняшний день не существует (Савельева Г.М. и др. Гистероскопия/ Савельева Г.М., Брусенко В.Г., Каплушева Л.М. - М.: ГЗОТАР Медицина, 1999).

Данные литературы, касающиеся изменений параметров местного иммунитета при хронических воспалительных процессах эндометрия (эндометритах), малочисленны (Кузнецова А.В. и др. Морфологические особенности хронического эндометрита. Архив патологии, 2001, №5, С.8-13; Эллиниди В.Н., Калинина Н.М. Иммуноморфология эндометрия. Лечение бесплодия: нерешенные проблемы. Саратов, 2001, С. 158-162).

Цель предлагаемого изобретения - разработка критериев диагностики хронического эндометрита.

Решение указанной цели достигается путем выявления воспаления в ткани эндометрия на основании комплексного клинико-морфологического обследования женщин, определения показателей местного иммунитета, характерных для воспаления, иммуногистоцитохимическим методом и уточнения характера воспалительного процесса при сопоставлении показателей местного и системного иммунитета.

Согласно предлагаемому способу осуществляют определение маркеров иммунокомпетентных клеток эндометрия иммуногистохимическим методом, позволяющим достоверно выявить наличие хронического воспаления в эндометрии и степень его выраженности; для этого исследуют в эндометрии лимфоциты, экспрессирующие маркеры естественных киллерных клеток CD56+ и CD16+ и лимфоциты, экспрессирующие маркер активации HLA-DR+ II класса, участвующие в распознавании антигена.

Обоснованием предлагаемого способа диагностики является факт, что воспаление нередко развивается только локально, вызывая нарушение функции органа, и всегда сопровождается изменениями параметров системного и локального иммунитета.

Предложенный метод определения экспрессии на мембранах иммунокомпетентных клеток специфических антигенов, то есть поверхностного фенотипа, выбран в связи с тем, что является методом идентификации клеток. Преимуществом предложенного метода является определение клеток, участвующих в воспалении. Иммуногисто-цитохимический метод - современный, высокочувствительный метод идентификации и определения локализации в клетке и ткани различных структур, имеющих антигенные свойства, основан на реакции антиген-антитело. В основе метода используются высокоавидные и высокоспецифичные моноклональные антитела, направленные к одному эпитопу антигена. В связи с этим метод позволяет идентифицировать различные иммунекомпетентные клетки (лимфоциты Т, В, натуральные киллерные клетки), участвующие в воспалении. С целью визуализации реакции антиген-антитело используется авидин-биотин-пероксидазный комплекс, а проявление пероксидазы хрена осуществляется диаминобензидином. В результате продукт реакции выявляется в виде коричневого стойкого окрашивания мембраны. Иммуногистохимический метод подробно изложен в методических рекомендациях (Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А.: Практическая иммуногистохимия (методические рекомендации), СПб., 2002, С.1-36).

Согласно предлагаемому способу наряду с использованием иммуногистоцитохимического метода осуществляют количественную оценку иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих маркеры активации и маркеры натуральных киллеров, что позволяет оценить выраженность воспалительного процесса, а по динамике изменений изучаемых параметров оценить эффективность проводимой терапии.

Предлагаемый способ диагностики позволяет путем сопоставления местного и системного иммунитета уточнить характер воспаления, выделить пациентов с аутоиммунным характером воспалительных процессов.

Предлагаемый способ диагностики хронического эндометрита и характера воспалительных заболеваний осуществляют следующим образом.

Определяют в эндометрии лимфоциты, экспрессирующие маркеры CD56+, CD16+ и HLA-DR(II)+. Исследование выполняют с применением антигенспецифических моноклональных антител фирмы Novocastra к данным маркерам на парафиновых срезах ткани эндометрия иммуногистоцитохимическим методом, включающим следующие этапы.

Осуществляют депарафинизацию срезов, с последующей демаскировкой антигена ткани, кипячением в цитратном буфере (рН 6,0) под давлением в скороварке 2 минуты. Проводят инкубацию срезов с нормальной сывороткой 30 минут. Проводят инкубацию срезов с первыми антигенспецифичными моноклональными антителами CD56+, CD16+ и HLA-DR(II)+ фирмы Novocastra в течение часа. Проводят инкубацию срезов со вторыми биотинилированными антителами 30 мин. Проводят инкубацию с авидин-биотин-пероксидазным комплексом 30 минут. Достижение окрашивания субстрата реакции (пероксидазы хрена) с целью визуализации осуществляют с помощью диаминобензидина 3 минуты. Продукт реакции проявляется в виде стойкого мембранного окрашивания в коричневый цвет. Результаты исследования параметров местного иммунитета (CD56+, CD16+ и HLA-DR(II)+) измеряют количественным способом, просматривая в световом микроскопе окрашенные иммуногистохимическим методом ткани эндометрия (биоптаты, соскобы, аспираты) при увеличении объектива 40, окуляра 10 в 3 полях зрения.

Подсчитывают количество положительно окрашенных клеток (экспрессирующих изучаемые маркеры) в каждом поле зрения. В случае незначительного разброса количественных показателей в разных полях зрения определяют среднее арифметическое.

Количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD56+, CD16+ и HLA-DR(II)+ определяют следующим способом.

Количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD56+ равно сумме количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD56+ в первом, втором и третьем полях зрения, разделенной на 3.

Количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD16+ равно сумме количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD16+ в первом, втором и третьем полях зрения, разделенной на 3.

Количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры HLA-DR(II)+ равно сумме количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры HLA-DR(II)+ в первом, втором и третьем полях зрения, разделенной на 3.

Пример. Количество лимфоцитов CD56+ в первом поле зрения - 21, во втором поле зрения - 23, в третьем поле зрения - 25.

Подсчет осуществляют следующим образом: (21+23+25):3=23.

По нарастанию количественных показателей исследуемых маркеров определяют выраженность воспалительного процесса.

С целью анализа полученных результатов, выявленные изменения параметров местного иммунитета естественных киллерных клеток (CD56+, CD16+) и лимфоцитов, экспрессирующих маркер активации (HLA-DR(II)+ в ткани эндометрия сопоставляют с показателями системного иммунитета у обследованных женщин, для чего исследуют субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (метод проточной цитометрии), продукцию цитокинов и содержание в сыворотке иммуноглобулинов классов А, М, G, Е, секреторный иммуноглобулин A (sIgA) (методом иммуноферментного анализа).

Согласно предлагаемому способу при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют отсутствие эндометрита. При количестве клеток, экспрессирующих CD56+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют аутоиммунный хронический эндометрит. При количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+ выше 10 в поле зрения, диагностируют обострение аутоиммунного хронического эндометрита. При количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит. При количестве клеток, экспрессирующих CD16+, CD56+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения, диагностируют хроническое воспаление с аутоиммунным компонентом, но без активации процесса. При количестве клеток, экспрессирующих CD16+ выше 10, и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+ и HLA-DR(II)+ от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хронический эндометрит.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

1. № истории болезни 4620.01 поликлинического отделения Института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Г.Л.Н., 28 лет. Клинический диагноз: Бесплодие первичное. Данные анамнеза, объективного осмотра, гинекологического осмотра не выявили признаков хронического эндометрита. Данных за перенесенную урогенитальную инфекцию нет. Больная обследована на 19 день менструального цикла. Гистологическое исследование N2277.01: эндометрий средней стадии фазы пролиферации, очаговая лимфоидная инфильтрация стромы. Иммуногистохимическое исследование: количество клеток экспрессирующих CD56+ - 5 в поле зрения, CD16+ - 10 в поле зрения, HLA-DR(II)+ - 0 в поле зрения, что свидетельствует об отсутствии воспаления. После проведения специфической гормональной терапии наступила беременность, закончившаяся 05.11.2002 года рождением доношенного ребенка.

2. № истории болезни 3170.01 поликлинического отделения Института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, В.Ю.В., 28 лет. Клинический диагноз: Бесплодие первичное. Данные анамнеза, объективного и гинекологического осмотра не выявили признаков хронического эндометрита. Данных за перенесенную урогенитальную инфекцию нет. Обследована на 24 день менструального цикла. Гистологическое исследование N1887.01: эндометрий средней стадии фазы секреции - поздней пролиферации, отставание в развитии стромы, структуры "железа в железе", единичные мононуклеары в строме, лимфоидная инфильтрация стромы. Иммуногистохимическое исследование: количество клеток экспрессирующих CD56+ - 5 в поле зрения, CD16+ 0 -10 в поле зрения, HLA-DR(II)+ 0 в поле зрения, что свидетельствует об отсутствии воспаления. После проведения специфической гормональной терапии наступила беременность, на 15.01.2003 г. - прогрессирует 25 недель.

3. № истории болезни 3440.02 - поликлинического отделения Института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, И.Ш.Н., 27 лет. Клинический диагноз: Привычное невынашивание. Перед обследованием получала комплексную терапию по поводу урогенитальной инфекции: из цервикального канала были выделены микоплазмы и уреаплазмы, в крови определялся диагностический титр иммуноглобулина G к хламидиям 1/64. Обследована на 12 день менструального цикла: Гистологическое исследование N: 1515.02: эндометрий средней стадии фазы пролиферации, строма с наклонностью к фиброзированию, выраженная диффузно-очаговая мононуклеарная инфильтрация. Иммуногистохимическое исследование: количество клеток экспрессирующих CD56+ - 50 в поле зрения, CD16+ - 60 в поле зрения, HLA-DR(II)+ - 5 в поле зрения, что свидетельствовало о хроническом воспалительном процессе в эндометрии без признаков активации, но с аутоиммунным компонентом. После проведения комплексной терапии наступила беременность, на 15.01.2003 г. - прогрессирует - 29 недель.

4. № истории болезни 4408.02 - поликлинического отделения Института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, П.М., 32 года, в анамнезе бесплодие первичное 7 лет. Клинический диагноз: Первичное бесплодие. При бактериологическом обследовании данных за инфекцию не получено. Гистологическое исследование N2033.02: 7 день цикла: эндометрий средней стадии фазы пролиферации с умеренной диффузно-очаговой мононуклеарной инфильтрацией и фиброзом стромы. Иммуногистохимическое исследование: количество клеток экспрессирующих CD56+ - 3 в поле зрения, CD16+ - 17 в поле зрения, HLA-DR(II)+ - 30 в поле зрения, что свидетельствовало о хроническом эндометрите без аутоиммунного компонента, но с признаками обострения (активном воспалении).

После проведения комплексной терапии наступила беременность, на данный момент прогрессирует - 26 недель.

5. № истории болезни 58,01 - поликлинического отделения Института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Т.Е.В., 24 года. Клинический диагноз: Бесплодие вторичное. В анамнезе самопроизвольный выкидыш раннего срока. При бактериологическом обследовании данных за наличие генитальной инфекции не получено. Гистологическое исследование N1316.01: 22 день цикла: эндометрий ранней стадии фазы секреции, клубки спиральных артерий хорошо выражены, слабая диффузная мононуклеарная инфильтрация стромы, наклонность к фиброзированию под поверхностным эпителием. Иммуногистохимическое исследование: количество, клеток экспрессирующих CD56+ - 45 в поле зрения, CD16+ 0 - 45 в поле зрения, HLA-DR(II)+ - 45 в поле зрения, что свидетельствовало об аутоиммунном хроническом эндометрите в фазе обострения. После проведения комплексной терапии наступила беременность, закончившаяся рождением доношенного ребенка 05.02.2002 г.

После проведения комплексной терапии на данный момент разные сроки прогрессирующей беременности имеют 19 женщин, беременность закончилась срочными родами у 16 женщин.

На основании заявляемого способа диагностики хронического эндометрита проведено обследование 156 женщин репродуктивного возраста в клиниках Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН (из них 5 здоровых женщин - группа контроля).

Перед выполнением инвазивных обследований (лапароскопий, гистероскопий, гистеросальпингографий, биопсий эндометрия) все женщины были клинически обследованы. Проводилось обследование на исключение сифилиса, ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С. Генитальная инфекция была исключена при бактериологическом исследовании секретов влагалища и цервикального канала, в том числе проводилась культуральная диагностика микоплазм, хламидий, методом иммунофлюоресценции выявлялся герпес I и II типов, выполнялось серологическое исследование крови на наличие антихламидийных антител классов G и А, антител класса G к возбудителям герпетической инфекции, а при их наличии определялся индекс авидности. Всего инфицировано было 44,5% женщин, выявление 2-х и более возбудителей отмечено у 66% из числа инфицированных. До проведения иммунологического обследования все инфицированные женщины были пролечены по поводу выявленных инфекций генитального тракта.

Параметры местного иммунитета - количество естественных киллерных клеток CD56+и CD 16+, лимфоцитов экспрессирующих маркер активации (HLA-DR(II)+) изучали в эндометрии всех 156 женщин.

При использовании обычного способа обследования (гистологический способ) диагноз хронического эндометрита был установлен только у 18 из 151 женщин (11,9%). Использование иммуногистохимического исследования позволило установить диагноз хронического эндометрита у 81 из 151 женщин (53,6%), что повысило точность клинической диагностики и способствовало выработке правильной тактике лечения женщин.

После проведения комплексной терапии на данный момент разные сроки прогрессирующей беременности имеют 28 женщин, беременность закончилась срочными родами у 27 женщин.

Таким образом, предложенный способ позволил выработать критерии оценки показателей местного иммунитета эндометрия иммуногистохимическим способом на парафиновых срезах. Предложенный способ диагностики хронического эндометрита и характера воспалительных изменений в эндометрии у женщин иммуногистоцитохимическим методом отличается тем, что позволяет точно установить вовлечение иммунной системы в воспалительный процесс в исследуемой ткани (эндометрии). Сопоставление показателей местного иммунитета (лимфоцитов экспрессирующих дифференцировочные антигены к CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+) и системного иммунитета позволил подтвердить характер аутоиммунного воспалительного процесса в эндометрии.

Список литературы

1. Демидова Е.М. Привычный выкидыш (Патогенез, акушерская тактика): Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук. СПб - 1993. – 42 стр.

2. Кузнецова А.В. Хронический эндометрит. Архив патологии, 2000, N3, стр.48-52.

3. Кузнецова А.В., Пауков С.В., Волощук И.Н., Демидова Е.М., Казарян С.М. Морфологические особенности хронического эндометрита. Архив патологии, 2001, N5, стр.8-13.

4. Савельева Г.М. и др. Гистероскопия/ Савельева Г.М., Бреусенко В.Г., Каплушева Л.М.-М.: ГЗОТАР Медицина, 1999. – 176 с.

5. Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. - 2-е издание. - СПб., 1995. - Кн.2. - С.46-52.

6. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука, 2001. – 390 с. - (Т.3; Т.4; Т.5).

7. Хмельницкий O.K. Патоморфологическая диагностика гинекологических заболеваний. - СПб: Сотис., 1994. - С.136-144.

8. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистохимия (методические рекомендации), Санкт-Петербург, 2002, стр.1-36.

9. Эллиниди В.Н., Калинина Н.М. Иммуноморфология эндометрия. Лечение бесплодия: нерешенные проблемы. Саратов, 2001. - стр.158-162.