способ получения рекомбинантного антигена fe.granulosus

Формула изобретения

Способ получения рекомбинантного антигена F Echinococcus granulosus, предусматривающий выделение эукариотической геномной ДНК из протосколексов паразита, получение препаративных количеств фрагмента ДНК F эхинококка с помощью ПЦР, получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды pQE, конструирование рекомбинантной плазмиды pQE-F Е. granulosus, трансформацию клеток рекомбинантной плазмидой, скрининг положительных клонов, экспрессию гибридного белка рекомбинантной плазмидой и его очистку, определение диагностической эффективности полученного рекомбинантного антигена EgF, отличающийся тем, что размер клонированного фрагмента ДНК эхинококка составляет 450 н.п. и представлен в SEQ ID NO1, аминокислотная структура получаемого рекомбинантного антигена EgF представлена в SEQ ID NO2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к генной инженерии, в частности к способу получения оригинальной нуклеотидной последовательности EgF, которая, будучи клонированной в экспрессирующую векторную систему pQE-SG 13009, позволяет получать неограниченное количество антигена эхинококка E.granulosus, используемого в качестве основного компонента иммуноферментного диагностикума для прижизненного выявления больных людей и животных ларвальным гидатидозом.

Ларвальный гидатидоз является тяжелым паразитарным заболеванием человека и с/х животных, вызываемым личиночной стадией эхинококка и приводящим к гибели заболевших. К сожалению, единственным радикальным методом лечения этого заболевания остается хирургический, зачастую малоэффективный на поздних стадиях развития инвазии.

Поэтому ранняя диагностика ларвальных эхинококкозов у больных может существенно помочь консервативному лечению данной категории пациентов (Клименко В.В. и др., АС №1363564 от 1.09.1987 г.). Однако производство антигена для соответствующей диагностики затруднено ввиду труднодоступности исходного материала для его получения обычными биохимическими методами, а качество последнего далеко не всегда обеспечивает стандартность и его высокую диагностическую эффективность.

Цель изобретения заключается в использовании генно-инженерной методики получения стандартизированного антигена EgF E.grariulosus в неограниченном количестве.

Наиболее близким прототипом является работа Smith D.B., Kevin S. and Johnson R.S. 1988. В качестве вектора авторами была выбрана фагмида /ZAP. Клонирование фрагмента кДНК эхинококка в данный вектор проводилось по сайтам EcoRl и Xhol. Субклонирование фрагмента ДНК E-granulosus осуществлялось в вектор pGEX с глутатион-S-трансферазой.

Недостатками прототипа являются недоступность и дороговизна используемых реагентов в условиях России.

Наша работа отличается тем, что клонированный фрагмент ДНК эхинококка размером 450 п.н. является оригинальным и отсутствует в каталоге секвенированных последовательностей E.granulosus в мировом банке генов (Gen Bank).

SEQ ID NO1 Первичная структура фрагмента F кДНК E.granulosus.

Размер фрагмента составляет 453 основания, подчеркнуты области затупленных Eco RI сайтов, мелким шрифтом выделены части сайта, по которому было проведено клонирование в полилинкер плазмиды pUC19. Нумерация начинается с конца EcoRI-линкера.

Ниже приводится аминокислотная структура получаемого рекомбинантного антигена EgF:

SEQ ID NO2

Аминокислотная структура белка Echinococcus granulosus, транслируемого с последовательности клона F. Мелким шрифтом выделены EcoRI линкеры.

Для создания банка ДНК паразита протосколексы эхинококка получали из гидатидозных цист, собранных на мясокомбинатах (хозяин - овцы, крупный рогатый скот), в охотохозяйствах (хозяин лось, кабан) и в 7-м хирургическом отделении Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (операционный материал от людей).

Протосколексы подвергали замораживанию в жидком азоте, растирали до порошкообразного состояния и суспендировали в 1 мл раствора, содержащего 4М гуанидинизотиоционата, цитрата натрия и 5% саркозила.

Очистку и переосаждение нуклеиновых кислот проводили стандартным методом (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984, стр.109).

Конструирование кДНК библиотеки проводили по стандартным методам с помощью вектора gt11.

Была получена кДНК библиотека в векторе gt11. Матрицей для синтеза кДНК послужила роlу(А)РНК, выделенная из протосколексов E.granulosus из печени овцы.

Библиотека скринирована с использованием авидин-биотиновой системы с применением белков сыворотки крови людей с подтвержденным диагнозом “эхинококкоз”. Предварительно белки сыворотки крови очищались от антител к белкам Е coli, которые присутствуют в любой сыворотке крови человека. Очистка сывороток проводилась при помощи аффинной хроматографии на колонках с CH-Sepharose 4В, к которой были пришиты тотальные белки E.coli (Остерман, 1985).

Библиотеки в gt11 высевались на чашки диаметром 95 мм, полученные клоны переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые окрашивали в реакции dot-ELISA.

В результате было получено несколько рекомбинантных клонов gt11, которые продуцировали белки, обладавшие антигенными свойствами эхинококка.

Схема клонирования фрагментов кДНК эхинококка в фаг gt11.

Lac-Z - область фага, кодирующая -галактозидазу. Горизонтальной стрелкой обозначено направление транскрипции. Вертикальной стрелкой - место лигирования по сайту Есо RI.

Таким образом, был проклонирован экспрессирующийся фрагмент ДНК эхинококка, представляющий собой кДНК копию информационной РНК, транскрибирующий уникальный ген E.granulosus.

С целью получения препаративных количеств гибридного антигена EgF было осуществлено субклонирование вставки кДНК E.granulosus в экспрессирующую векторную систему pQE-SG 13009.

Способ получения гибридного антигена EgF включает следующие этапы:

1) выделение эукариотической геномной ДНК E.granulosus из

протосколексов паразита;

2) получение препаративных количеств фрагмента ДНК F эхинококка с помощью ПЦР;

3) получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды pQE;

4) конструирование рекомбинантной плазмиды pQE-F E.granulosus;

5) проведение реакции трансформации клеток E.coli рекомбинантной плазмидой и скрининг положительных клонов;

6) экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой и его очистка;

7) определение диагностической эффективности полученного рекомбинантного антигена EgF.

Выделение эукариотической геномной ДНК Е. granulosus из протосколексов паразита

К 50 мкг отмытых в физиологическом растворе протосколексов эхинококка добавляют 10 мл лизисного буфера следующего состава: 100 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 50 мМ ЭДТА. Суспендируют на шейкере 2-3 минуты, после чего вносят додецилсульфат Na до конечной концентрации 1% и протеиназу К в количестве 1 мг на 1 мл буферного раствора.

Инкубацию проводят при 37С в течение 6 часов и при 56С.

Депротеинизацию нуклеиновых кислот проводят стандартным фенол-хлороформовым методом (см. руководство Маниатиса, 1989 г.), вплоть до исчезновения интерфазы.

Освобожденную от протеинов ДНК осаждают 3 объемами этилового спирта, инкубируют при - 20С 15 минут и центрифугируют 10 минут при 7000 об/мин. Полученный осадок последовательно отмывают в 70, 80 и 96%-ном этаноле, центрифугируя после каждого этапа по 5 минут при 10000 об/мин.

Осадок ДНК лиофильно высушивают и растворяют в ТЕ-буфере (10 мМ ТРИС-НС1, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА).

Дальнейшую очистку ДНК осуществляют следующим образом: к раствору ДНК добавляют LiCl до конечной концентрации 5М, осторожно перемешивают и инкубируют при 0С в течение 10 минут.

Затем проводят центрифугирование при 5 тыс. оборотах в течение 30 минут при 4С. Образовавшийся супернатант переносят в чистые пробирки Эппендорф и помещают на инкубацию в водяную баню на 10 минут при 65С. Последующее 40-минутное центрифугирование при 17000 об/мин позволяет осадить остатки протеинов и полисахаридов. Супернатант переносят в новую пробирку и осаждают 3 объемами этанола. Полученный осадок тщательно высушивают, растворяют в воде и сохраняют при +4С.

Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды рQЕ

Оборудование: центрифуга Bekman-J2-21, микролаборатория Эппендорф (центрифуга, миксер, термостат, автоматические пипетки), водоструйный насос, ФЭК-56М, термостат, РН-метр, прибор для электрофореза, диализные мембраны, хроматоскоп, необходимая стеклянная и пластиковая посуда.

Реактивы: трис-ОН, ЭДТА, глюкоза, лизоцим, среда LB, бромистый этидий, SDS, ацетат калия, фенол, хлороформ, 70 и 96% этанол, рибонуклеаза, агароза, изопропиловый спирт, ампициллин, хлористый литий.

Засевают 5 мл среды LB в пробирке отдельной колонией бактерий, содержащей плазмиду. Инкубируют 30 минут при 37С и добавляют соответствующий антибиотик (ампициллин 50 мг/мл). Далее ночную культуру инкубируют в том же температурном режиме при интенсивном встряхивании 16 часов. Бактериальные клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок бактерий ресуспендируют в 2 мл охлажденного раствора: 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-НСl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, лизоцим 5 мг/мл. Время инкубации при 20С - 5 минут. Затем в пробирки добавляют 4 мл раствора, содержащего 1% SDS и 0,2N NaOH, и ставят на 10 минут в лед. Периодически проводят перемешивание суспензии. Не вынимая пробирки из ледяной бани, добавляют 3 мл холодного раствора 5М ацетата калия, перемешивают содержимое и инкубируют при С в течение 10 минут.

Центрифугируют в роторе Becman JS-13 при 13000 об/мин в течение 30 минут. Бактериальная ДНК и обломки клеток на дне пробирки образуют плотный осадок, надосадочная жидкость, содержащая плазмидную ДНК, полностью прозрачна. Ее переносят в чистые пробирки и добавляют по 0,6 объема изопропанола, инкубируя при комнатной температуре не менее 20 минут. Плазмидную ДНК осаждают центрифугированием при 13000g при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученный осадок подсушивают под вакуумом, несколько раз промывают 70%-ным и 1 раз 96%-ным этанолом, спирт тщательно сливают, а осадок до полного высыхания помещают в термостат при 56С. Высушенный осадок растворяют в 200 мкл деионизированной воды. Очистку плазмидной ДНК осуществляют 10М раствором хлористого лития, добавляя равный объем в каждую пробирку. Инкубация во льду длится не менее 20 минут, центрифугирование при 1200 об/мин - 10 минут. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, с помощью водоструйного насоса переносят в чистые пробирки и добавляют по 1 мл 96% этанола, инкубируют 15 минут при - 20С, после чего центрифугируют при 12000 об/мин 5 минут.

Анализирующий электрофорез проводят в 1% агарозном геле.

Проведение реакции амплификации гомологичных фрагментов из генома эхинококка синтезированными олигонуклеотидными праймерами

В специальные пробирки Эппендорф объемом 0,5 мл добавляют последовательно 35 мкл Н₂О, 5 мкл 10х полимеразного буфера (трис-HCl, рН 8.8, КСl 0,5 М, MgCl₂ 15 мМ, желатина 0,01%), 8 мкл смеси всех четырех трифосфатов в концентрации 50 мМ, специфические олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры, 0,5 мкл фермента Taq DNA полимеразы, 25 нг геномной ДНК, 20 мкл минерального масла.

Устанавливают следующий цикл амплификации:

94С - 1-2 минуты, 72С - 1-5 минут. Количество циклов 25-30.

В последнем цикле время инкубации при 72С - 15 минут.

Режим амплификации геномной ДНК эхинококка:

Т1-95С – 5 минут

Т2-50С - 2 минуты 2 цикла

Т3-72С - 1 минуту

Т1-95С - 30 секунд

Т2-50С - 2 минуты 30 циклов

Т3-72С - 1 минута

Т1-95С-30 секунд

Т2-50С - 2 минуты 1 цикл

Т3-72С - 5 минут

Весь цикл амплификации длится около 4 часов. После остановки ПЦР амплификатора пробирки извлекаются из штатива и, не нарушая верхнего слоя минерального масла, берутся аликвоты ДНК в количестве 10-15 мкл для последующего проведения электрофореза в 2% агарозном геле.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pQE-F E. granulosus

Полученные в ПЦР фрагменты имеют на концах участки узнавания для рестриктаз Bam H1 и Hind III, что делает их удобными для клонирования в векторную молекулу со стандартным полилинкером.

Выделенную и очищенную векторную ДНК рестрицируют ферментом (EcoR-1, Bam H-1) в течение 1,5 часов при 37С. Лианеризованную ДНК подвергают очистке от протеинов фенолом и хлороформом по стандартной методике, затем двукратно переосаждают этанолом. Полученный осадок подсушивают под вакуумом и растворяют в 50 мкл ТЕ буфера. К векторной ДНК добавляют согласно общепринятой методике (Маниатис, 1986 г.) эквимолярное количество наработанного в ПЦР фрагмента F ДНК эхинококка, 10х лигазный буфер, затем проводят отжиг при 68С в течение 10 минут, после чего реакционную смесь охлаждают во льду и добавляют 1 мкл 100 мМ раствора АТФ и 10 единиц фермента ДНК-лигазы фага Т-4. Собственно реакция лигирования (сшивания in vitro ДНК векторной молекулы и фрагмента гена эхинококка) длится 16 часов при температуре 8-10С.

Проведение реакции трансформации клеток Е.соli рекомбинантной плазмидой

Проведение реакции трансформации компетентных клеток Е.соli лигирующей смесью позволяет оценить жизнеспособность рекомбинантной конструкции.

В качестве контроля используют ДНК нативной векторной плазмиды для трансформации тех же компетентных клеток. Эффективность трасформации дикой плазмидой составляет 10⁵ или 10⁶ колоний на 1 мкг векторной ДНК, рекомбинантной - 10² или 10³ колоний на 1 мкг конструированной ДНК.

Скрининг положительных клонов

Скрининг рекомбинантных клонов осуществляют по модифицированному методу Ледерберга и Коэна (1986 г.). Отобранные с чашек рекомбинантные клоны повторно проверяют на наличие в них вставки ДНК эхинококка на молекулярном уровне, проводя реакции рестрикции соответствующими ферментами и электрофорез в 0,8% агарозном геле.

Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой и его очистка

Засеивают 80 мл среды LB клетками, содержащими гибридную плазмиду.

Наращивают до плотности D₆₀₀=0,5, отбирают 1 мл, центрифугируют и разбавляют клетки SDS-PAGE буфером.

Добавляют IPTG до концентрации 0,3 мМ, инкубируют 2 часа при 37С. Отбирают 0,5 мл осадка клеток и делят на 2 пробирки.

Культуру центрифугируют при 4000 об/мин 10 минут. Удаляют супернатант, осадок замораживают при -20С.

Из клеточного лизата белки высаливают сульфатом аммония. Фракции собирают в интервале от 35% до 65% насыщения. Далее проводят гель-фильтрацию на сефакриле S-300 на колонке диаметром 2 см и длинной 1 метр. При проведении хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе используют колонку диаметром 2 см и длиной 20 см. Элюция белков-антигенов осуществляется градиентом хлористого натрия в концентрации от 0 до 0,7 М.

Диагностическую эффективность полученного рекомбинантного антигена проверяют в ИФА.

Определение диагностической эффективности полученного рекомбинантного антигена F

Пример 1. Диагностическую эффективность рекомбинантного антигена F оценили с 87 пробами сывороток крови людей, в том числе зараженных: E.granulosus - 46 проб, другими гельминтозами - 21, клинически здоровых доноров - 20.

Результаты испытаний представлены в таблице 1.

Пример 2. Диагностическую эффективность рекомбинантного антигена F оценили с 96 сыворотками людей, больных как эхинококкозом (53 пробы), так и другими инвазиями (43 пробы).

Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Пример 3. Диагностическую эффективность рекомбинантного антигена F сравнили в комиссионном испытании в ИФР "ELISA" с коммерческим антигеном “Эхинококк IgG стрип” ЗАО “Вектор-Бест” г. Новосибирск.

Результаты испытаний представлены в таблице 3.

Анализ данных по оценке диагностической эффективности рекомбинантного антигена "F" в ИФР "ELISA" свидетельствует о его достаточно высокой чувствительности и специфичности. Это дает основание применять антиген "F" в качестве диагностикума при эхинококкозе человека и животных.

Источники информации

1. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии, М.: Мир, 1984.

2. Клименко В.В., Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В. Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа, АС №1363564, 1987.

3. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ./Под ред. Д.Гловера. - М.: Мир, 1988. - 538 с.

4. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Болдырев Е.Ф. Быстрый метод сборки ДНК из синтетических олигонуклеотидов. Доклады АН СССР, 1994 г., т.278, №5, - с. 1250-1253.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование - М.: Мир, 1984.

6. Новое в клонировании ДНК. Методы: Пер. с англ. /Под ред. Д.Гловера. - М.: 1989, - 368 с.

7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981.

8. Плазмиды. Методы: Пер. с англ./Под ред. К.Харди, М.: Мир, 1989. - 267 с.

9. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA//Nucl.Acids Res. – 1979 -Vol.7, N6, p. 1513-1522.

10. Smith D.B. and Johnson R.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione-S-transferase//Gene, 1988, 67, 31-40.