рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения

Классы МПК:C12N15/70 векторы или системы экспрессий, специально приспособленные для Ecoli
C12N15/21 альфа-интерферон
C07K14/56 альфа-интерферон
C12P1/02 микробных грибков
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Пальцев Михаил Александрович (RU),
Северин Евгений Сергеевич (RU),
Киселев Всеволод Иванович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2002-10-22
публикация патента:

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Путем встройки в вектор pQE30 гена рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона и инвертированного гена htpR сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pASIF62. Также предложен способ биосинтеза рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона в клетках E.coli с последующей очисткой целевого продукта, заключающийся в том, что E. coli трансформируют плазмидной ДНК pASIF62, а культивирование проводят до достижения мутности 0,4-0,6 ОД, после чего в среду добавляют 0,1-0,3 мМ изопропил-b-тиогалактозида. Применение изобретения обеспечивает повышенный выход рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Изобретение относится к генетической инженерии, конкретно к генетической конструкции, кодирующей синтез рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона человека, и которая может быть использована для его промышленного получения в штаммах E.coli.

Интерфероны впервые привлекли внимание благодаря своей способности вмешиваться в репликацию и продукцию разного рода вирусов. Это семейство мультифункциональных цитокинов, среди которых наиболее изученными являются интерферон-альфа (IFN-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117), -бета (IFN-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117), -гамма (IFN-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117).

Все интерфероны - продукты различных генов. IFN-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117 представляет целое семейство, белки которого кодируются как минимум 23 различными генами. Это 19-23 кДа полипептиды длиной от 156 до 172 аминокислот. Все IFN-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117 высокогомологичны и различаются лишь одной-двумя аминокислотами. В белковой последовательности имеются сайты потенциального гликозилирования, однако большинство подтипов IFN-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117 негликозилированы. Пространственная структура интерферонов состоит исключительно из альфа-спиралей и относится к классу "четырехспиральный бочонок". Биологической активностью обладают мономеры этого белка.

Интерфероны обладают множеством активностей, которые способствуют активации Т-клеточного иммунитета, что необходимо для естественной защиты организма от вирусных и бактериальных инфекций. Эти цитокины активирут другие иммунокомпетентные клетки - Т-клетки, NK-клетки, активированные макрофаги, стимулируя ранний неспецифический иммунный ответ. Они усиливают экспрессию рецепторов и антигенов эффекторными клетками, регулируют транскрипцию новых генов, стимулируют экспрессию белков комплекса гистосовместимости класса II (МНС II). Интерфероны обнаруживают антипролиферативную, цитостатическую и цитотоксическую активности на некоторых опухолевых клетках.

Эти белки также принимают участие в регуляции гемопоэза, в результате чего усиливается продукция и активация нейтрофилов, моноцитов, тромбоцитов, что, в свою очередь, является ключевым событием воспалительного процесса. И это лишь малая часть активностей, которыми обладают интерфероны.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что использование экзогенных интерферонов для лечения многих заболеваний - воспалительных, опухолевых и многих других, где необходима иммуномодулирующая активность, более чем оправдано. В связи с вышеописанными свойствами интерферона многими исследователями были разработаны штаммы-продуценты для наработки рекомбинантного аналога этого белка (патенты WO 01/42301 А1, WO 01/25438 А2, WO 00/69913, WO 01/57217 A1, WO 87/06616, WO 88/09673, EP 0032134 В1, ЕР 0626448 А2, ЕР 0538300 B1, US 5710027, SU 1092176 A).

Наиболее близкой по технической сущности является рекомбинантная ДНК, ее штамм-продуцент на базе Е.соli, которые пригодны для промышленного получения рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона (US 5710027, кн. 435-69.51, 1998).

Рекомбинантная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон-гена, слитую с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида теплоустойчивого энтеротоксина E.coli, под контролем Е.соli фосфотазного промотора (phoA).

Вектор, содержащий рекомбинантную ДНК, устойчиво экспрессируется в E.coli, обеспечивает стабильную секрецию белка в преплазматическое пространство клетки и дает правильно сформированный с аутентичным N-терминаторным концом и правильными дисульфидными связями рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон (то есть биологически активный рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон) с промышленно пригодным выходом - 15-20% от общего клеточного белка.

Однако известная рекомбинантная ДНК, вектор, ее содержащий, и используемый штамм дают продукт, который требует многостадийной очистки, включающей последовательную хроматографию на силикагеле, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, катионно-обменную и анионно-обменную хроматографии.

Изобретательской задачей является повышение выхода и упрощение очистки биологически активного (то есть с сохраненными структурными особенностями, отмеченными выше) рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона.

Изобретательская задача решается тем, что предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pASIF-62, кодирующая синтез рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона, которая имеет размер 4200 т.п.о. и состоит из следующих элементов: lac-промотор, АТГ-кодон, ген рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона размером 642 нуклеотида, инвертированный фрагмент ДНК-гена htpR размером 350 нуклеотидов, ген устойчивости к ампициллину и сайты для рестриктаз Pst, Hind III, BamHI, а также содержит 18 нуклеотидных остатков, оперативно связанных с lac-промотором и геном интерферона и кодирующих 6 гистидиновых остатков.

Предлагается также способ получения человеческого рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона экспрессией его гена в составе рекомбинантной ДНК в Е.соli, отличием которого является то, что экспрессию осуществляют в рекомбинантной плазмиде pASIF-62 в ростовой среде до ее мутности 0,4-0,6 ОД, после чего в нее добавляют 0,1-0,3 мМ изопропил-b-тиогалактозида - индуктора lас-промотора (ИПТГ) и экспрессию продолжают под контролем индуцированного lac-промотора рекомбинантной плазмиды. Очистку целевого продукта, полученного в плазмидной ДНК pASIF-62 осуществляют в одну стадию методом катионно-обменной хроматографии на агарозном носителе. В способе предполагается в виде предпочтительного варианта использовать штаммы Е.соli, дефектные по гену htpR.

По предлагаемому способу экспрессия интерферона осуществляется в цитоплазматическую среду Е.соli, что создает определенные трудности в правильном фолдинге белка, а также в подборе лидера стабильной экспрессии, который не должен менять аутентичность терминаторного конца.

Другой проблемой цитоплазматической экспрессии гетерологичных белков в E.coli является проблема многостадийной очистки, требующей на первой стадии дорогостоящей очистки с помощью иммуноаффинной хроматографии (ЕР 396555).

Предложенная рекомбинантная плазмида для получения рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона и способ получения с ее использованием обходят все эти проблемы за счет использования Заявителем нового подхода, предложенного ниже и доказывающего “изобретательский уровень” предложенного изобретения.

Известно, что за агрегацию чужеродных рекомбинантных полипептидов в клетках E.coli отвечают “шапероны”, то есть белки “теплового шока” (БТШ). К их числу относятся белки DNAK, groES и groEL, которые вызывают агрегацию чужеродных полипептидов, и Lon-протеаза, осуществляющая их избирательную деградацию. Регуляция транскрипции генов, кодирующих белки “теплового шока”, осуществляется белком htpR, который является альтернативной рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117-субъединицей РНК-полимеразы и при встраивании в голофермент обеспечивает избирательную транскрипцию генов БТШ в условиях синтеза аномальных белков. Ранее нами было установлено, что в клетках E.coli, дефектных по БТШ, наблюдается более интенсивное накопление рекомбинантных белков, а из “телец включения”, полученных в этих штаммах, существенно выше выход белков с природной конформацией (с правильным фолдингом).

Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что нарушение функции шаперонов в клетках E.coli придает клеткам весьма полезные с биотехнологической точки зрения свойства, так как значительно повышается “выход” рекомбинантных продуктов.

Однако известные мутации, которые нарушают функцию шаперонов и снижают протеолитическую активность клеток, существенно нарушают ростовые свойства клеток E.coli, стимулируют образование слизи, что затрудняет промышленное культивирование рекомбинантных штаммов.

Нами предложено другое решение этой проблемы, состоящее в том, что рекомбинантная плазмида, кодирующая синтез рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона, за последовательностью гена IFN содержит короткую инвертированную последовательность гена htpR-регулятора экспрессии генов БТШ. Молекулы РНК, синтезирующиеся при транскрипции этой последовательности, имеют структуру, комплиментарную структуре mРНК гена htpR и могут выполнять функцию антисмысловой РНК, блокируя синтез БТШ посредством инактивации белка HtpR.

Сделанный Заявителем выбор лидерной последовательности из шести гистидиновых остатков отвечает в наибольшей степени основным биотехнологическим требованиям, которые могут быть к нему предъявлены.

Это, в первую очередь, надежная экспрессия слитого вместе с ним рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона, отсутствие необходимых в таких случаях точечных замен для адаптации к белоксинтезирующему аппарату клетки-хозяина, упрощение конечного выделения и очистки слитого белка, а также отсутствие препятствий для корректного фолдинга зрелого белка.

Для получения рекомбинантной ДНК был использован вектор pQE30, содержащий lac-промотор, участок инициации трансляции, область, кодирующая 6 гистидиновых остатков, и полилинкер, содержащий 6 сайтов рестрикции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Клонирование гена рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона человека.

В качестве источника генов рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона были использованы:

1. Библиотека генов человека

2. Плазмида из промышленного штамма-продуцента рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона на основе Pseudomonas Putida

3. Плазмида из промышленного штамма-продуцента рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона на основе Escherichia coli.

Фрагмент гена IFN2, соответствующий зрелой части белка, был выделен из трех выше перечисленных источников методом амплификации с помощью праймеров:

IFNA2-L gc gga tcc atg tgt gat ctg cct caa ace

IFNA2-R ccc aag ctt tea ttc ctt act tct taa.

Фрагмент был обработан рестриктазами BamHI+HindIII и клонирован между BamHI и HindIII сайгами трех типов векторов для экспрессии.

В каждом случае получено и проанализировано по 20 независимых клонов.

Индукция синтеза интерферона оценивалась в 10 мл IPTG-индуцированных культур (выращивание до OD600=0.5, внесение IPTG до 0.2 мМ, затем 3 часа при 37С на качалке). Продукция белка ожидаемого размера проверена по SDS-PAGE.

В качестве клеток-“хозяев” были использованы штаммы E.coli BL21, DLT1270, DSK-41. Штамм DSK-41 получен в лаборатории молекулярной биологии ВНЦМДЛ путем внесения мутации в ген htpR, в результате чего в штамме наблюдается пониженный уровень протеолиза, что повышает выход любых рекомбинантных белков. Другая особенность штамма DSK-41 состоит в том, что в стационарной фазе роста в этом штамме наблюдается спонтанная дерепрессия генов, находящихся под контролем lac-промотора и lac-репрессора, вероятно, за счет деградации lac-репрессора.

Праймеры:

IFNA2-L gc gga tcc atg tgt gat ctg cct caa асc

IFNA2-R ccc aag ctt tca ttc ctt act tct taa

На фиг.1 показана последовательность гена human IFNA2, где начало гена - 69 нт (ATG), конец - 635 нт (TGA), зрелая часть белка соответствует участку 138-635 нт. Начало гена, начало зрелой части и стоп-кодон подчеркнуты. Для экспрессии взята зрелая часть. Вставляли между BamHI/HindIII сайтами pQE30.

Пример 2.

Клонирование последовательности гена htpR.

Фрагмент гена htpR выделяли из плазмиды pKV3, содержащей полимеразный ген htpR из генома E.coli. Плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазами Hind III и Pst I и после фракционирования в агарозном геле выделяли фрагмент гена htpR размером 350 нуклеотидных пар. Фиг.2 представляет собой гипотетическую схему взаимодействия мРНК гена htpR с антисмысловой РНК.

Пример 3

Исследование протеолитической активности в штаммах E.coli, содержащих плазмиду pASIF62.

Для конструирования плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона, использовали вектор pQE30, куда встраивали ген IFN под контроль lас-промотора, таким образом, что на N-концевой последовательности белка синтезировались 6 остатков гистидина. Затем в 3’-концевую область гена после терминирующих кодонов встраивали фрагмент гена htpR в обратной ориентации, описанный в примере 2. Общая схема генетической конструкции представлена на фиг.3 (Рекомбинантная плазмида pASIF62).

Предполагается, что в результате индукции синтеза интерферона в клетках E.coli в присутствии IPTG будет образовываться антисмысловой транскрипт инвертированного фрагмента гена htpR, который при взаимодействии с mРНК htpR будет блокировать синтез БТШ и, следовательно, снижать уровень протеолиза в клетках E.coli.

Определение протеолитической активности штаммов

Скорости протеолитической деградации белков измеряли согласно методу Гольдберга. Бактериальные клетки выращивали при 30°С в минимальной среде М9, содержащей необходимые добавки. При достижении оптической плотности культуры при 550 нм = 0,4-0,5 в среду вносили пуромицин до конечной концентрации 300 мкг/мл и спустя 15 мин L-3Н-лейцин до конечной концентрации 0,2 Ки/мл. После этого клетки выращивали еще в течение 10 мин, собирали центрифугированием, отмывали дважды в среде М9, содержащей “холодный” лейцин в концентрации 75 мкг/мл для предупреждения повторного включения 3H-лейцина, высвобождающегося из белков. Клетки суспендировали в концентрации 2,5рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117105 мл. Скорость деградации аномальных пуромициновых полипептидов определяли по накоплению меченых свободных аминокислот в ТХУ-растворимой фракции. Как следует из результатов, представленных на фиг.4А и 4Б (скорость деградации 3H-пуромициновых полипептидов в штаммах: рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117 -BL21c плазмидой pASIF62, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117 -BL21 без плазмиды pASIF62) - в штамме Е.соli BL21, не содержащем плазмиду pASIF62, наблюдается значительное усиление протеолиза при температуре +42°С, тогда как в штамме, содержащем плазмиду, уровень протеолиза в аналогичных условиях существенно ниже.

Пример 4

Синтез рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона человека в штаммах E.coli

Уровень синтеза рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона определяли в штаммах E.coli, содержащих плазмиду pIF62 (не содержащую последовательность гена htpR и имеющую нормальный уровень протеолиза) и плазмиду pASIF62, ингибирующую синтез протеаз.

Клетки E.coli выращивали до плотности ОД-05, вносили IPTG до концентрации 0,2 мМ для индукции синтеза интерферона. Клеточные белки фракционировали в 13% SDS ПААГе.

Из данных, представленных на фиг.5, следует, что в идентичных условиях роста клетки E.coli, содержащие плазмиду pASIF62, синтезируют рекомбинантный рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон. На фиг.5 представлен электрофорез белков штаммов E.coli в полиакриламидном геле, где

1 - маркеры молекулярного веса,

2 - штамм E.coli, содержащий рекомбинантную плазмиду pIF62 с геном рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон,

3 - штамм E.coli с рекомбинантной плазмидой.

Пример 5

Выделение рекомбинантного рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона

Клетки Е.coli штамма DLT1270 трансформировали плазмидой pASIF62 и выращивали в течение ночи при 37°С в среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и глюкозы (0,2%). Затем разбавляли ночную культуру в 25 раз свежей средой LB с ампициллином и подращивали 2-3 часа до мутности около 0,5, после чего добавляли раствор ИПТГ до 0,2 мМ. Растили еще 3 часа, центрифугировали культуру при 5 тыс. об/мин 10 мин, супернатант отбрасывали.

Осадок после центрифугирования суспендировали в буфере 20 мМ трис-НСl, рН 8, 0,3 М NaCl (1 мл на осадок из 50 мл культуры) и озвучивали 6 импульсов по 15 сек. Центрифугировали 10 тыс. об/мин, 10 мин, осадок промывали тем же буфером с добавлением 0,1% Тритон Х-100 (0,5 мл), после чего суспендировали с помощью гомогенизатора в 5 мл буфера А (10 мМ трис-НСl, рН 8, 6М мочевина, 0,4М NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ имидазол). Перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, отделяли супернатант центрифугированием при 10 тыс. об/мин 10 мин, осадок отбрасывали.

Колонку с IDА-агарозой (1 мл) заряжали раствором NiSO4, уравновешивали буфером А с 5 мМ имидазолом. Супернатант наносили на колонку, промывали 5 мл буфера А, затем 10 мл буфера В (буфер А с 20 мМ имидазола). Элюцию проводили буфером С (10 мМ трис-HCl, рН 8, 2М мочевина, 0,4М NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанол, 0,3 М имидазол). Этот буфер добавляли по 0,5 мл, собирая соответствующие фракции. Обычно белки HI 6 и HI 8 обнаруживались во фракциях 1-3.

Объединенные фракции диализовали в течение ночи против 100-кратного объема буфера 10 мМ трис-HCl, рН 8, 150 mM NaCl.

Выделенный рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон был охарактеризован методом жидкостной хроматографии и электрофорезом в ПААГе. На фиг.6 представлены данные электрофоретического анализа рекомбинантного рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона в полиакриламидном геле, где М - маркеры; INF-рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферон.

На фиг.7 представлена хроматографическая характеристика рекомбинантного рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона человека.

Предлагаемое изобретение поясняется таблицей.

рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 2230117

Выход составил 30% от общей массы клеточного белка.

Как следует из представленных данных, описанный метод выделения позволяет получить гомогенный белок, лишенный дополнительных примесей.

Пример 6

Иммунохимическая характеристика рекомбинантного рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона.

С целью идентификации рекомбинантного белка были проведены иммунологические исследования методом непрямого иммуноферментного анализа, с помощью моноклональных антител к рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферону человека. В качестве стандарта был использован коммерческий препарат рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона (Интрон), производимый фирмой Шеринг-Плау (США). На фиг.8 приведены результаты экспериментов, подтверждающие полную идентичность двух белков.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pASIF62, кодирующая биосинтез человеческого рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона, которая характеризуется тем, что она имеет размер 4200 т.п.о. и представляет собой вектор рQЕ30 с lac-промотором, геном устойчивости к ампицилину и последовательностью из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в который оперативно встроены ген интерферона размером 642 нуклеотида (между сайтами для рестриктаз BamHI и HindIII) и инвертированный фрагмент ДНК гена htpR размером 350 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз HindIII и PstI).

2. Способ получения человеческого рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез   человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения, патент № 22301172-интерферона путем экспрессии его гена в составе рекомбинантного вектора в E.coli с последующей очисткой целевого белка, отличающийся тем, что экспрессию гена осуществляют в составе рекомбинантной плазмидной ДНК pASIF62, клетки E.coli культивируют до мутности 0,4-0,6 ОД, после чего в среду добавляют 0,1-0,3 мМ изопропил-b-тиогалактозида (ИПТГ) и продолжают культивирование до накопления целевого продукта.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют мутантные по гену htpR штаммы E.coli.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что очистку целевого продукта осуществляют в одну стадию методом катионно-обменной хроматографии на агарозном носителе.

Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N15/70 векторы или системы экспрессий, специально приспособленные для Ecoli

Патенты РФ в классе C12N15/70:
рекомбинантная днк, кодирующая гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (g-csf) и рекомбинантная плазмида рas017, обеспечивающая синтез g-csf в клетках escherichia coli -  патент 2529363 (27.09.2014)
рекомбинантная днк, кодирующая гибридный белок эпидермального фактора роста человека слитого последовательностью глутатион-s-трансферазы (gst-hegf) и рекомбинантная плазмида pas007, обеспечивающая синтез gst-hegf в клетках escherichia coli -  патент 2521515 (27.06.2014)
рекомбинантная плазмидная днк pg1-rm7, обеспечивающая синтез гибридного белка g1-rm7, и гибридный белок, связывающий фактор некроза опухолей и обладающий биолюминесцентной активностью -  патент 2513686 (20.04.2014)
рекомбинантная плазмидная днк pqe-p35d, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка p35d вируса оспы коров, штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка p35d вируса оспы коров и рекомбинантный белок p35d вируса оспы коров, используемый для создания тест-систем и конструирования субъединичных вакцин против ортопоксвирусных инфекций -  патент 2511037 (10.04.2014)
способ получения рекомбинантного антигена g2 хантавируса добрава в клетках e.coli -  патент 2509805 (20.03.2014)
рекомбинантный полипептид а2, селективно связывающий hsa, рекомбинантная днк pa2, кодирующая hsa-связывающую часть полипептида a2, его продуцент - рекомбинантный штамм escherichia coli m15-a2, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pqe 32-pa2, обеспечивающую получение полипептида a2 и применение полипептида а2 для диагностики микроальбуминурии и выделения hsa из сыворотки крови -  патент 2506271 (10.02.2014)
способ получения рекомбинантного антигена g2 хантавируса добрава в клетках e. coli -  патент 2495938 (20.10.2013)
система экспрессии компонентов ортогональной трансляции в эубактериальной клетке-хозяине -  патент 2467069 (20.11.2012)
штамм клеток e.coli bl21(de3)plyss, клон ptt9/asfvp30, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена ср204l вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка p30, для изготовления диагностических препаратов -  патент 2463343 (10.10.2012)
рекомбинантная плазмидная днк pтв323, кодирующая гибридный полипептид gst-дельтамрт64 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена мрт64 (мрв64), рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного полипептида gst-дельтамрт64 и рекомбинантный полипептид gst-дельтамрт64 -  патент 2458130 (10.08.2012)

Класс C12N15/21 альфа-интерферон

Патенты РФ в классе C12N15/21:
способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека -  патент 2432401 (27.10.2011)
способ микробиологического синтеза зрелого интерферона альфа-2 человека, штамм saccharomyces cerevisiae - продуцент зрелого интерферона альфа-2 человека (варианты) -  патент 2427645 (27.08.2011)
способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека -  патент 2380405 (27.01.2010)
рекомбинантная плазмидная днк pif tren, кодирующая полипептид интерферона альфа-2b человека, и штамм бактерий escherichia coli-продуцент полипептида интерферона альфа-2b человека -  патент 2326168 (10.06.2008)
раствор для инъекций, рекомбинантная плазмидная днк psx50, кодирующая синтез рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона, штамм escherichia coli sx50 - промышленный штамм-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ промышленного получения интерферона альфа-2b -  патент 2319502 (20.03.2008)
штамм escherichia coli bl21 (de3)[payc-et-(hifn- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования -  патент 2303063 (20.07.2007)
способ получения рекомбинантного интерферона альфа-2b и интерферонсодержащий препарат (варианты) -  патент 2294372 (27.02.2007)
слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, димерный слитый белок, фармацевтическая композиция, их содержащая, молекула днк (варианты) и способ адресования интерферона-альфа в ткани печени -  патент 2262510 (20.10.2005)
рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека -  патент 2258081 (10.08.2005)
способ получения рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2b, рекомбинантная плазмида и штамм продуцент для его осуществления -  патент 2242516 (20.12.2004)

Класс C07K14/56 альфа-интерферон

Патенты РФ в классе C07K14/56:
гибридный белок, обладающий пролонгированным действием, на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека (варианты), способ его получения и штамм saccharomyces cerevisiae для осуществления этого способа (варианты) -  патент 2515913 (20.05.2014)
интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение препарата и его применение -  патент 2485134 (20.06.2013)
новый функционально активный высокоочищенный стабильный конъюгат интерферона с полиэтиленгликолем, представленный одним позиционным изомером пэг-n h-ифн, с уменьшенной иммуногенностью, с пролонгированным биологическим действием, пригодный для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе -  патент 2447083 (10.04.2012)
способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека -  патент 2432401 (27.10.2011)
рекомбинантная плазмидная днк pfastbac-b17r, содержащая фрагмент генома вируса оспы коров, кодирующий альфа/бета-интерферонсвязывающий белок и штамм бакуловируса bvb17rg, продуцирующий растворимый альфа/бета-интерферонсвязывающий белок вируса оспы коров -  патент 2405824 (10.12.2010)
лекарственное средство на основе модифицированного интерферона альфа с пролонгированным терапевтическим действием -  патент 2382048 (20.02.2010)
полипептид, обладающий противовирусной, антипролиферативной и/или иммуномодулирующей активностью, выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид и их применение -  патент 2328528 (10.07.2008)
конъюгаты белка и производного полиэтиленгликоля, фармацевтическая композиция, способ борьбы с вирусной инфекцией -  патент 2298560 (10.05.2007)
способ получения рекомбинантного интерферона альфа-2b и интерферонсодержащий препарат (варианты) -  патент 2294372 (27.02.2007)
способ определения цитокинового статуса человека на генетическом уровне -  патент 2181773 (27.04.2002)

Класс C12P1/02 микробных грибков

Патенты РФ в классе C12P1/02:
способ получения нового полимерного соединения, обладающего противовирусной активностью, сополимеризацией 2,5-дигидроксибензойной кислоты и желатина с помощью фермента лакказы -  патент 2494119 (27.09.2013)
способ получения адъюванта -  патент 2493257 (20.09.2013)
ферментационная среда и способ для получения рекомбинантных белков -  патент 2491345 (27.08.2013)
пищевой продукт, содержащий специфичную к пролину протеазу, способ его производства и его применение для расщепления токсичных или аллергенных пептидов глютена -  патент 2446210 (27.03.2012)
способ экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток -  патент 2445355 (20.03.2012)
способ получения вторичных продуктов обмена веществ, меченных изотопами, а также вторичные продукты обмена веществ -  патент 2407797 (27.12.2010)
способ получения липидов (варианты) и липиды, полученные этим способом -  патент 2336307 (20.10.2008)
способ комплексной переработки вегетативной части тополя бальзамического -  патент 2322501 (20.04.2008)
штамм lecanicillium sp. 347а - продуцент комплекса биологически активных соединений -  патент 2322491 (20.04.2008)
способ подготовки к хранению цитрусовых плодов свежих специального назначения -  патент 2322040 (20.04.2008)


Наверх