вектор для экспрессии гетерологичного белка, плазмида (варианты)
| Классы МПК: | C12N15/73 экспрессионные системы, использующие регуляторные последовательности фага лямбда |
| Автор(ы): | АСТОЛФИ-ФИЛЬЮ Спартаку (BR), ДИ ЛИМА Биатрис Долабела (BR), ТИМАНН Джозеф Эрнст (BR), ДИ СОЗА Элоиза Рибейру Тунес (BR), ВИЛЕЛА Люсиано (BR) |
| Патентообладатель(и): | УНИВЕРСИДАДИ ДИ БРАЗИЛИА (BR), БИОБРАС С.А. (BR) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
1998-07-02 публикация патента:
27.01.2004 |
Изобретение относится к получению многоцелевых векторов. Вектор для экспрессии гетерологичного белка включает последовательность, кодирующую сайт начала репликации рUC8, рестрикционный фрагмент из 
-бактериофага, содержащий последовательность промотора РL -бактериофага, последовательность, кодирующую участок Шайна-Дальгарно, последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один растрикционный сайт, предназначенный для встраивания гетерологичной ДНК, кодирующей гетерологичный белок, и последовательность, кодирующую сайт терминации трансляции. Представлена плазмида рLМТ 8.5, способная экспрессировать гетерологичный белок. Представлена плазмида рНIS для экспрессии гена проинсулина и гистидинового хвоста. Представлена плазмида рРТА 1 для экспрессии гена проинсулина. Изобретение позволяет разработать высокоэффективные экономичные способы получения человеческого инсулина, необходимого для лечения диабета. 4 с. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 33 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125
-бактериофага, содержащий последовательность промотора РL -бактериофага, последовательность, кодирующую участок Шайна-Дальгарно, последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один растрикционный сайт, предназначенный для встраивания гетерологичной ДНК, кодирующей гетерологичный белок, и последовательность, кодирующую сайт терминации трансляции. Представлена плазмида рLМТ 8.5, способная экспрессировать гетерологичный белок. Представлена плазмида рНIS для экспрессии гена проинсулина и гистидинового хвоста. Представлена плазмида рРТА 1 для экспрессии гена проинсулина. Изобретение позволяет разработать высокоэффективные экономичные способы получения человеческого инсулина, необходимого для лечения диабета. 4 с. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 33 ил.
Формула изобретения
1. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты для экспрессии по крайней мере одного гетерологичного белка, при том, что указанный вектор включает следующие функционально соединенные участки в направлении 5"
3": (i) последовательность, кодирующую сайт начала репликации pUC8; (ii) рестрикционный фрагмент из -бактериофага, содержащий последовательность промотора РL -бактериофага; (iii) последовательность, кодирующую участок Шайна-Дальгарно; (iv) последовательность, кодирующую по крайней мере один рестрикционный сайт, предназначенный для встраивания гетерологичной ДНК, кодирующей по крайней мере один гетерологичный белок; и (v) последовательность, кодирующую сайт терминации транскрипции.2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК.3. Вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая участок Шайна-Дальгарно, происходит из гена 10 фага Т7.4. Вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая селективный маркер, расположена между (i) и (v).5. Вектор по п.1, отличающийся тем, что вектор может быть экспрессирован в грамм-отрицательной бактерии.6. Вектор по п.5, отличающийся тем, что грамм-отрицательной бактерией является кишечная палочка Е. coli, участок начала репликации происходит из плазмиды pUC8, участок инициации является участком инициации трансляции, включающим синтетический участок Шайна-Дальгарно гена 10 фага Т7, промотором является промотор РL и сайт терминации транскрипции является Rho-независимым, причем указанный вектор дополнительно включает последовательность, кодирующую маркер устойчивости к тетрациклину, расположенную между (i) и (v).7. Вектор по п.1, отличающийся тем, что по крайней мере один рестрикционный сайт кодирует множественные рестрикционные сайты.8. Вектор по п.7, отличающийся тем, что множественные рестрикционные сайты представляют собой NcoI, EcoRI, StuI, PstI, BamHI и BspEI.9. Вектор по п.1, отличающийся тем, что гетерологичным белком является проинсулин.10. Вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая по крайней мере один рестрикционный сайт для встраивания гетерологичной ДНК, кодирующей по крайней мере один гетерологичный белок, является полилинкерной последовательностью.11. Вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая сайт терминации транскрипции, является Rho-независимым сайтом терминации транскрипции.12. Вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность сайта начала репликации pUC8 находится в рестрикционном фрагменте pUC8.13. Вектор по п.1, отличающийся тем, что по крайней мере один гетерологичный белок выбран из группы, состоящей из инсулина, проинсулина, инсулина с гистидиновым хвостом и проинсулина с гистидиновым хвостом.14. Вектор по п.5, отличающийся тем, что грамм-отрицательная бактерия включает репрессорный ген cI857.15. Вектор по п.5, отличающийся тем, что грамм-отрицательная бактерия представляет собой Е.coli, включающую репрессорный ген cI857.16. Вектор по п.4, отличающийся тем, что последовательность селективного маркера кодирует устойчивость к тетрациклину и находится в рестрикционном фрагменте pR4.17. Плазмида pLMT8.5, способная экспрессировать по крайней мере один гетерологичный белок, депонированная под ATCC 98474 и приведенная на фиг.5 и 5а.18. Плазмида pHIS, включающая молекулу нуклеиновой кислоты для экспрессии гена проинсулина и гистидинового хвоста, депонированная под ATCC 98476 и приведенная на фиг.13.19. Плазмида рРТА1, включающая молекулу нуклеиновой кислоты для экспрессии гена проинсулина и депонированная под ATCC 98473.
