способ получения корпускуляризованных аллергенспецифических диагностикумов

Формула изобретения

1. Способ получения корпускуляризованных аллергенспецифических диагностикумов, отличающийся тем, что очистку аллергенов проводят методом гель-фильтрации на сефадексе Г-50, выделяют белковую фракцию (сенситин), определяют рабочую дозу сенситина, проводят сенсибилизацию формаминизированных, танизированных эритроцитов барана при температуре 49-51°С в течение 55-65 мин, взвесь сенсибилизированных эритроцитов стандартизуют на фотоэлектроколориметре до 3%, оценивают активность и специфичность непрямым методом флуоресцирующих антител и стабилизируют путем лиофильного высушивания.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед очисткой аллергены подвергают метке флуоресцентным красителем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано при производстве диагностических препаратов на основе нерастворимых носителей.

В медицинской промышленности при изготовлении препаратов для выявления аллергии используют в качестве нерастворимых носителей полистироловые планшеты, сенсибилизированные различными аллергенами (Гервазиева В.Б., Овсянникова И. Г., Воронин Н.И., Сорочинская Н.Н., Райкис Б.Н. Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения аллер-генспецифических IgE-антител. // Ж. микробиология, 1987. - 9. - С 33-35). Х.Фримель, Г. Хольцхайдт Иммуноферментный анализ //В кн.: Иммунологические методы. Под ред. Х. Фримеля. М., Медицина, 1897. -С162-170.

Недостатки: негомогенность материалов планшета (неконтролируемый фактор) отрицательно сказывается на сорбционной способности планшета, что в свою очередь снижает чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа (Мешандин А.Г., Минасян Б.О., Ванеева Л.И., Симонов В.П., Агапкин Н.П. Оптимизация некоторых параметров, позволяющих улучшить сорбционную активность планшет для твердофазного иммуноферментного анализа. // Ж. Микробиология, 1991. - 3. - С. 60-61. Бирюков В.В., Гордова Т.И. Сравнение определения типоспецифических иммуноглобулинов Е иммуноферментным анализом и хемилюминесцентным методом множественной диагностики аллергии MAST-CLA // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. М., 2001. С 134.)

Изобретение направлено на решение задачи: получение стандартных, активных, специфичных, стабильных при хранении корпускуляризованных аллергенспецифических диагностикумов.

Указанные задачи достигаются путем очистки пищевых (гречневая крупа, говядина, свинина, курица, хек, мандарин), бытовых (библиотечная пыль, домашняя пыль, клещ домашней пыли), эпидермальных (перо подушки, шерсть кошки, шерсть собак, шерсть овцы, перхоть лошади), пыльцевых (пыльца сорных трав, тимофеевка, лебеда, полынь, подсолнечник, береза, ольха) аллергенов методом гель-фильтрации, сенсибилизации очищенными белковыми фракциями формалинизированных танизированных эритроцитов барана (ФТЭБ), стандартизации и стабилизации приготовленных корпускуляризованных аллергенспецифических диагностикумов (КАД), которые используют в непрямом методе флуоресцирующих антител (нМФА) для выявления сенсибилизации к соответствующему аллергену.

Способ осуществляют следующим образом: исследуемый аллерген очищают на колонке с сефадексом Г-50 и выделенную белковую фракцию используют для сенсибилизации ФТЭБ, приготовленный КАД стандартизируют по количеству сенсибилизированных эритроцитов с помощью фотоэлектроколориметра, оценивают активность и специфичность в непрямом методе флуоресцирующих антител (нМФА) и стабилизируют путем лиофильного высушивания.

Возможно перед очисткой аллергена пометить его флуоресцентным красителем, например изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ).

Получение корпускуляризованных аллергенспецифических диагностикумов: исследуемый аллерген наслаивают на колонку с сефадексом Г-50, уравновешенную 0,9%-ным раствором хлорида натрия и собирают элюаты по 5 мл с помощью коллектора с последующим их просмотром на спектрофотометре при длине волны 280 нм. При этом наблюдают разделение на 2-е фракции: высокомолекулярную (белоксодержащую) фракцию и низкомолекулярную (белокнегативную) фракцию. У элюатов высокомолекулярной фракции измеряют концентрацию белка и объединяют белоксодержащие пробы. Полученную фракцию аллергена (сенситин) используют для сенсибилизации ФТЭБ.

Предварительно проводят определение рабочей дозы сенситина. С этой целью в пробирках готовят последовательные двукратные разведения сенситина (1:2,1: 4, 1:8,1:16) в объеме 0,5 мл на фосфатном буферном растворе рН 6,4. В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 6%-ной взвеси ФТЭБ. Пробирки помещают в термостат и выдерживают в течение 55-65 мин при температуре (Т) 49-51^oС при периодическом перемешивании. Затем эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин, осадок 2 раза отмывают в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Затем осадок ресуспендируют в 1 мл такого же раствора, т.е. получают 1 мл 3%-ных сенсибилизированных эритроцитов (СЭ). Активность проверяют в нМФА.

Оценка качества сенсибилизации в нМФА. На предметные стекла (разграфленные на 8-10 квадратов) наносят по 5 мкл КАД в разных разведениях, высушивают на воздухе и фиксируют спиртом в течение 15 мин. Предметные стекла помещают в открытую влажную камеру и наносят на все мазки по 5 мкл стандартной сыворотки, содержащей антитела к данному аллергену. Камеру закрывают и помещают в термостат (Т 37^oС), где выдерживают в течение 20-25 мин. По истечении времени инкубации стекла с мазками достают и промывают в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с добавлением 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4 (промывающий раствор) дважды по 7 мин, затем высушивают. На все мазки наносят флуоресцирующие антивидовые иммуноглобулины, взятые в рабочем разведении, в объеме 5 мкл. Предметное стекло с мазками вновь помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 20 мин при температуре 37^oС. Затем предметные стекла с мазками вновь дважды промывают по 7 мин промывающим раствором. Стекла с мазками высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа.

При наличии в сыворотке специфических иммуноглобулинов к соответствующим аллергенам наблюдают специфическую флуоресценцию ободка у эритроцитов от 1+ до 4+.

Оценку интенсивности флуоресценции ободка эритроцитов проводят по четырехкрестовой шкале:

4+ изумрудная, зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;

3+ яркая зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;

2+ зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;

1+ слабая, едва заметная флуоресценция ободка вокруг эритроцита;

- отсутствие флуоресценции (отсутствие сенсибилизации).

Постановка реакции должна сопровождаться следующими контролями:

1. Заведомо положительный контроль: корпускуляризованный диагностикум + стандартная сыворотка к данному аллергену + флуоресцирующие антивидовые иммуноглобулины. Наличие 3+ -4+ флуоресценции.

2. Заведомо отрицательный контроль: корпускуляризованный диагностикум + сыворотка, не содержащая антител + флуоресцирующие антивидовые иммуноглобулины. Отсутствие флуоресценции.

3. Контроль конъюгата: корпускуляризованный диагностикум + флуоресцирующие антивидовые иммуноглобулины. Отсутствие флуоресценции.

За рабочее разведение принимают максимальное разведение сенситина, обеспечивающего флуоресценцию ободка у эритроцита интенсивностью не ниже чем на 3+.

Рабочее разведение используют для приготовления КАД. Диагностикум после стандартизации по количеству СЭ, его активности и специфичности стабилизируют методом лиофильного высушивания. Отконтролированный диагностикум разливают в ампулы по 200 мкл и стабилизируют путем лиофильного высушивания.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

4,5 мл аллергена клеща домашней пыли фракционируют на колонке с сефадексом Г-50, уравновешенную 0,9%-ным раствором натрия хлорида, и получают 2-е фракции: высокомолекулярную, содержащую белок, и фракцию, содержащую низкомолекулярные соединения (пигменты, фенол). Белковую фракцию аллергена (сенситин) 9 мл используют для приготовления КАД. Предварительно определяют рабочую дозу сенситина по методике, описанной выше. Рабочее разведение сенситина равно 1: 4. Для приготовления 64 мл КАД используют 8 мл сенситина в исходном разведении. К 32 мл сенситина в разведении 1:4 на фосфатном буферном растворе рН 6,4 приливают 32 мл 6% ФТЭБ и смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 55-65 мин при температуре (Т) 49-51^oС при периодическом перемешивании через каждые 15 мин. Затем нагруженные сенситином ФТЭБ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. К осадку добавляют 32 мл 0,9% раствором натрия хлорида и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок отмытых сенсибилизированных ФТЭБ ресуспендируют в 20 мл этого же раствора. СЭ стандартизуют по количеству эритроцитов на фотоэлектроколориметре до 3% и проверяют в нМФА активность и специфичность. При соответствии регламентированным параметрам КАД лиофилизируют.

Целевой продукт полученный по способу, указанному в заявке, стандартен, поскольку представляет 3%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов, обладает достаточной активностью и специфичностью, т.к. взаимодействует со стандартной сывороткой, содержащей антитела к аллергену клеща домашней пыли, и не реагирует с другими аллергенами, стабилен при хранении, т.к. лиофилизирован.

Пример 2

4,5 мл аллергена пера подушки фракционируют на колонке с сефадексом Г-50, уравновешенную 0,9%-ным раствором натрия хлорида, и получают 2-е фракции: высокомолекулярную, содержащую белок, и низкомолекулярную фракцию, содержащую (пигменты, фенол). Белковую фракцию аллергена (сенситин) 9 мл используют для приготовления КАД. Рабочее разведение сенситина равно 1:1. Для приготовления 18 мл КАД используют 9 мл сенситина в исходном разведении. К 9 мл сенситина приливают 9 мл 6% ФТЭБ и смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 55-65 мин при температуре (Т) 49-51^oС при периодическом перемешивании через каждые 15 мин. Затем нагруженные сенситином ФТЭБ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. К осадку добавляют 18 мл 0,9% раствором натрия хлорида и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок отмытых сенсибилизированных ФТЭБ ресуспендируют в 18 мл этого же раствора. СЭ стандартизуют по количеству эритроцитов на фотоэлектроколориметре до 3% и проверяют в нМФА активность и специфичность. При соответствии регламентированным параметрам КАД лиофилизируют.

Целевой продукт, полученный по способу, указанному в заявке, стандартен, поскольку представляет 3%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов, обладает достаточной активностью и специфичностью, т.к. взаимодействует со стандартной сывороткой, содержащей антитела к аллергену пера подушки, и не реагирует с другими аллергенами, стабилен при хранении, т.к. лиофилизирован.

Пример 3

4,5 мл аллергена рыбы (хек) фракционируют на колонке с сефадексом Г-50, уравновешенную 0,9%-ным раствором натрия хлорида, и получают 2-е фракции: высокомолекулярную, содержащую белок, и фракцию, содержащую низкомолекулярные соединения (пигменты, фенол). Белковую фракцию аллергена (сенситин) 7 мл используют для приготовления КАД. Рабочее разведение сенситина равно 1:2. Для приготовления 28 мл КАД используют 8 мл сенситина в исходном разведении. К 14 мл сенситина в разведении 1:2 на фосфатном буферном растворе рН 6,4 приливают 14 мл 6% ФТЭБ, смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 55-65 мин при температуре (Т) 49-51^oС при периодическом перемешивании через каждые 15 мин. Затем нагруженные сенситином ФТЭБ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. К осадку добавляют 14 мл 0,9% раствором натрия хлорида и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок отмытых сенсибилизированных ФТЭБ ресуспендируют в 10 мл этого же раствора. СЭ стандартизуют по количеству эритроцитов на фотоэлектроколориметре до 3% и проверяют в нМФА активность и специфичность. При соответствии регламентированным параметрам КАД лиофилизируют.

Целевой продукт, полученный по способу, указанному в заявке, стандартен, поскольку представляет 3%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов, обладает достаточной активностью и специфичностью, т.к. взаимодействует со стандартной сывороткой, содержащей антитела к аллергену рыбы (хека), и не реагирует с другими аллергенами, стабилен при хранении, т.к. лиофилизирован.

Пример 4

4,5 мл аллергена полыни фракционируют на колонке с сефадексом Г-50, уравновешенную 0,9%-ным раствором натрия хлорида, и получают 2-е фракции: высокомолекулярную, содержащую белок, и фракцию, содержащую низкомолекулярные соединения (пигменты, фенол). Белковую фракцию аллергена (сенситин) 6 мл используют для приготовления КАД. Предварительно определяют рабочую дозу сенситина по методике, описанной выше. Рабочее разведение сенситина равно 1: 16. Для приготовления 80 мл КАД используют 5 мл сенситина в исходном разведении. К 40 мл сенситина в разведении 1:16 на фосфатном буферном растворе рН 6,4 приливают 40 мл 6% ФТЭБ, смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 55-65 мин при температуре (Т) 49-51^oС при периодическом перемешивании через каждые 15 мин. Затем нагруженные сенситином ФТЭБ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. К осадку добавляют 40 мл 0,9% раствором натрия хлорида и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок отмытых сенсибилизированных ФТЭБ ресуспендируют в 50 мл этого же раствора. СЭ стандартизуют по количеству эритроцитов на фотоэлектроколориметре до 3% и проверяют в нМФА активность и специфичность. При соответствии регламентированным параметрам КАД лиофилизируют.

Целевой продукт, полученный по способу, указанному в заявке, стандартен, поскольку представляет 3%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов, обладает достаточной активностью и специфичностью, т.к. взаимодействует со стандартной сывороткой, содержащей антитела к аллергену полыни, и не реагирует с другими аллергенами, стабилен при хранении, т.к. лиофилизирован.

Пример 5

4,5 мл аллергена пера подушки метят флуоресцентным красителем, например изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ). Для этого к аллергену добавляют 3,38 мг ФИТЦ, растворенного в 0,5 мл карбонатно-бикарбонатного буферного раствора рН 8,6. Метку проводят при температуре +6-+10^oС в течение 16-18 ч. Затем меченый аллерген фракционируют на колонке с сефадексом Г-50, уравновешенную 0,9%-ным раствором натрия хлорида, и получают 2-е фракции: высокомолекулярную, содержащую белок, и фракцию, содержащую низкомолекулярные соединения и непрореагировавший ФИТЦ. Рабочее разведение 1:1. Меченую белковую фракцию аллергена (сенситин) 9 мл используют для приготовления КАД. Для приготовления 18 мл КАД используют 9 мл сенситина в исходном разведении. К 9 мл сенситина приливают 9 мл 6% ФТЭБ, смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 55-65 мин при температуре (Т) 49-51^oС при периодическом перемешивании через каждые 15 мин. Затем нагруженные сенситином ФТЭБ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. К осадку добавляют 18 мл 0,9% раствором натрия хлорида и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок отмытых сенсибилизированных ФТЭБ ресуспендируют в 18 мл этого же раствора. СЭ стандартизуют по количеству эритроцитов на фотоэлектроколориметре до 3% и проверяют в нМФА активность и специфичность. При соответствии регламентированным параметрам КАД лиофилизируют.

Целевой продукт, полученный по способу, указанному в заявке, стандартен, поскольку представляет 3%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов, обладает достаточной активностью и специфичностью, т.к. взаимодействует со стандартной сывороткой, содержащей антитела к аллергену пера подушки, и не реагирует с другими аллергенами, стабилен при хранении, т.к. лиофилизирован. Препарат может быть использован для оценки иммунного статуса человека, а именно фагоцитоза, специфических антител в сыворотке крови в нМФА и определения В-клеток, продуцирующих специфические антитела.

Положительный эффект. Способ позволяет получать стандартные, специфичные, активные, стабильные при хранении КАД к широкому спектру аллергенов для выявления сенсибилизации к бытовым, пищевым, пыльцевым и эпидермальным антигенам в непрямом методе флуоресцирующих антител.

При использовании меченого аллергена способ позволяет расширить спектр диагностики, т. к. помимо выявления сенсибилизации к аллергенам в нМФА возможно определение функциональной активности фагоцитов и определение В-клеток, продуцирующих специфические антитела к аллергенам.