применение производных фумаровой кислоты для лечения митохондриальных заболеваний

Формула изобретения

1. Применение одного или нескольких соединений из группы, состоящей из диалкиловых эфиров и моноалкиловых эфиров фумаровой кислоты в форме свободной кислоты или ее солей в качестве средства для лечения заболевания, обусловленного нарушением окислительного фосфорилирования и выбранного из группы, включающей синдром Паркинсона, болезнь Альцгеймера, хорею Хантингтона, пигментную ретинопатию и митохондриальную энцефаломиопатию.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что диалкиловый эфир фумаровой кислоты соответствует формуле

в которой R₁ является атомом водорода, С₁-С₈-алкилом;

R₂ является насыщенным или ненасыщенным алифатическим или разветвленным С₁-С₂₄-алкилом.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что радикалы R₁ и R₂ представляют собой метил, этил, н-пропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, 2-этилгексил, гексил, гептил, октил, винил, аллил.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что моноалкиловый эфир фумаровой кислоты имеет формулу:

где R₁ имеет значение, указанное в п.2;

А обозначает водород или катион щелочного или щелочноземельного металла или физиологически переносимый катион переходного металла, предпочтительно выбранный из групп, включающей Li⁺, Na⁺, К⁺, Са⁺, Мg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺ и Мn²⁺, n означает 1 или 2 в зависимости от рода катиона.

5. Применение по пп.1-4, отличающееся тем, что средство представлено в виде дозированной единицы фармацевтической композиции и содержит производное фумаровой кислоты в количестве 1-500 мг, предпочтительно 10-300 мг, и наиболее предпочтительно 10-200 мг.

6. Применение по пп.1-5, отличающееся тем, что средство представлено в виде фармацевтической композиции для перорального, парентерального, чрезкожного или ректального введения, предпочтительно для перорального введения.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что фармацевтическая композиция для перорального введения представлена в форме дозированных таблеток, микротаблеток (микрогранул), в случае необходимости инкапсулированных или помещенных в саше, или гранулята, капсул или раствора для питья.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что твердая дозированная форма снабжена устойчивым к желудочному соку покрытием.

9. Применение по пп.1-8, отличающееся тем, что производным фумаровой кислоты является одно или несколько производных фумаровой кислоты, выбранных из группы, включающей диметиловый эфир фумаровой кислоты, диэтиловый эфир фумаровой кислоты, метилэтиловый эфир фумаровой кислоты, метилфумарат кальция, этилфумарат кальция, метилфумарат магния, этилфумарат магния, метилфумарат цинка, этилфумарат цинка, метилфумарат железа и этилфумарат железа.

10. Применение по п.9, отличающееся тем, что дозированные единицы фармацевтической композиции предпочтительно содержат отдельно или в смеси 10-300 мг диалкилфумарата, в частности, диметилфумарата и/или диэтилфумарата, 10-300 мг алкилфумарата кальция, в частности, метилфумарата кальция и/или этилфумарата кальция, 0-250 мг алкилфумарата цинка, в частности, метилфумарата цинка и/или этилфумарата цинка, 0-250 мг алкилфумарат магния, в частности, метилфумарата магния и/или этилфумарата магния, причем сумма указанных количеств соответствует эквиваленту 300 мг, предпочтительно 200 мг фумаровой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к применению отдельных производных фумаровой кислоты или их смесей для приготовления фармацевтической композиции для лечения митохондриальных заболеваний, в частности для лечения синдрома Паркинсона, болезни Альцгеймера, хореи Гентингтона, пигментной ретинопатии и митохондриальной энцефаломиопатии.

Митохондрии обладают собственной генетической системой из ДНК (мтДНК) и РНК и поэтому могут сами синтезировать некоторые белки. Как гены клеточного ядра, так и митохондриальный геном кодируют компоненты окислительного фосфорилирования, а также цикла лимонной кислоты (цикла Кребса). Генетический дефект мтДНК может, следовательно, оказывать отрицательное влияние на окислительное фосфорилирование или на цикл лимонной кислоты и приводить к нарушению функций. Была установлена связь между подобными дефектами или нарушениями функций и так называемыми митохондриальными заболеваниями.

Генетические дефекты мтДНК могут возникать в результате точечных мутаций, при которых одно основание заменяется другим. Например, была установлена связь между этими точечными мутациями и нейрогенетической слабостью мышц, атаксией и пигментной ретинопатией.

Генетические дефекты мтДНК могут быть также обусловлены инсерционными или делеционными мутациями, при которых одна или несколько пар нуклеотидов вводятся в ДНК или удаляются из нее. Этот мутационный механизм обсуждается в связи с синдромом Кирнса-Сейра и синдромом Пирсона.

Мутация мтДНК играет также роль при нейродегенеративных заболеваниях, таких как синдром Паркинсона, болезнь Альцгеймера или хорея Гентингтона (Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine, Vol. 4, Ed. R.A. Meyers). Правда, до сих пор не удалось однозначно идентифицировать мутации, являющиеся причиной этих заболеваний. В качестве основы патогенеза обсуждается также накопление мутаций.

Синдром Паркинсона обнаруживает большое число симптомов, которые могут быть разделены на три группы. Двигательные нарушения выражаются плюс-симптомом повышенной мышечной ригидности (увеличением тонуса поперечно-полосатой мускулатуры) и средне-, крупноразмашистым тремором (быстро следующими друг за другом подергиваниями), а также минус-симптомом гипо- или акинезии (обеднением общей моторики, утраты установочного (статокинетического) рефлекса)). Далее наблюдают вегетативные симптомы (гиперсаливацию (слюнотечение) и дакриорею (слезотечение), "покрытое мазью" лицо и др.).

Болезнь основывается на гибели нервных клеток в областях двигательных ядер головного мозга. В Германии этой болезнью поражены приблизительно 200000 пациентов. На молекулярном уровне синдром Паркинсона среди прочего связывают с мутациями митохондриального генома. У пациентов с синдромом Паркинсона удалось обнаружить делеции мтДНК. Далее, при синдроме Паркинсона происходит обеднение определенных областей головного мозга в отношении допамина. Наблюдаемые симптомы являются выражением нарушенного равновесия между нейрогуморальными нейромедиаторными веществами (нейротрансмиттерами) ацетилхолином и допамином.

Отправными точками медикаментозной терапии являются в настоящее время ингибирование нейротрансмиссии эффективными в центральной нервной системе антихолинергическими агентами, повышение концентрации допамина введением предшественника допамина леводопа или также стимуляция рецепторов допамина в центральной нервной системе прямыми допаминергическими агонистами.

Конкретные способы терапии включают введение антихолинергических агентов или леводопа. Для того чтобы благоприятно воздействовать как на плюс-симптом, так и на минус-симптом у больных с синдромом Паркинсона, в большинстве случаев требуется комбинированная терапия, которая к тому же дополняется немедикаментозными лечебными мерами.

С другой стороны, в случае больных с синдромом Паркинсона, которые уже страдают от явных психоорганических нарушений или экзогенных психотических симптомов, терапия антихолинергическими агентами противопоказана, так как следует считаться с возможностью усиления этой симптоматики.

При терапии с использованием леводопа возникают в качестве ограничивающих терапевтическое применение побочных действий двигательные симптомы (гиперкинезии, дискинезии), вегетативные нарушения (среди прочих жалобы по поводу желудочно-кишечного тракта) и сердечно-сосудистые нарушения (например, ортостатические осложнения).

Болезнь Альцгеймера является необратимой прогрессирующей пресенильной или сенильной деменцией (слабоумием), которая отличается разрушением зон головного мозга. Наряду с влияниями митохондриальных дефектов генов более новые исследования показывают, что повышенное наличие аполипопротеинов Е₄ (апо-Е₄) связано с появлением болезни Альцгеймера. В случае наследственной формы этой болезни ген, соответствующий aпo-E₄, часто является дефектным. В отличие от ситуации с синдромом Паркинсона до сих пор нет никаких способов лечения болезни Альцгеймера за исключением лечения индометацином. Однако индометацин также вызывает значительные побочные эффекты.

Пигментная ретинопатия является в большинстве случаев наследственным, редко приобретаемым дегенеративным процессом, который связан с тесным расположением сосудов сетчатки, атрофией зрительного нерва, гибелью нервных элементов сетчатки и отложением пигментов. В качестве симптомов возникают никталопия (ночное зрение), значительное сужение поля зрения и потеря зрения.

В случае митохондриальной энцефаломиопатии речь идет о заболевании, при котором имеются нарушения митохондриальной дыхательной цепи. Типичными симптомами являются миопатия (так называемая миопатия с разлохмаченными красными волокнами), карликовый рост, деменция, эпилептические припадки, атаксия, неврологические очаговые нарушения и MELAS (митохондриальная энцефаломиопатия, лактатный ацидоз и апоплексические приступы).

Хорея Гентингтона является аутосомально-доминантным наследственным заболеванием с дефектом на коротком плече хромосомы 4, которое в большинстве случаев манифестируется между 30-м и 50-м годами жизни и связано с прогрессирующей деменцией. В качестве причины можно назвать повреждение или атрофию хвостатого ядра (Nucleus caudatus) и при определенных обстоятельствах чечевицеобразного ядра (Nucleus lentiformis). Обсуждается нарушение метаболизма нейромедиаторов, а также влияние дефектов мтДНК.

Таким образом, задача данного изобретения состоит в получении фармацевтической композиции для лечения митохондриальных заболеваний, в частности вышеуказанных болезней, и тем самым в возможности частичного до сих пор невозможного медикаментозного лечения этих заболеваний. Далее задача данного изобретения состоит в том, чтобы получить фармацевтическую композицию для лечения указанных заболеваний, которая снижает медикаментозные побочные действия существующих до сих пор терапий и не требует комбинированной терапии.

Решение поставленной задачи состоит в применении отдельных производных фумаровой кислоты или смеси производных фумаровой кислоты для приготовления фармацевтической композиции для лечения митохондриальных заболеваний, в частности для лечения болезни Альцгеймера, синдрома Паркинсона, хореи Гентингтона, пигментной ретинопатии и митохондриальной энцефаломиопатии. Объекты данного изобретения характеризуются подробно в пунктах формулы данного изобретения.

Известно, что фармацевтические композиции, которые после введения при их биологическом распаде входят в цикл лимонной кислоты (цикл Кребса) или принадлежат к этому циклу, чаще всего в более высокой дозе, приобретают все большее терапевтическое значение, так как с их использованием могут быть облегчены или излечены криптогенетически обусловленные заболевания.

Так, фумаровая кислота тормозит рост асцитных опухолей Эрлиха у мышей, уменьшает токсические действия митомицина С и афлатоксина и обладает действием против псориаза, а также антимикробным действием. Вообще лечение псориаза различными производными фумаровой кислоты у ряда пациентов уже было описано, см. , например, ЕР 188749, патенты Германии DE 2530372, DE 2621214 или ЕР 312697.

Следующее применение определенных производных фумаровой кислоты, а именно алкилгидрофумаратов, описывается в DE 19721009.6, а также в DE 19853487.6, согласно которым эти определенные производные фумаровой кислоты описываются для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, например, для полиартрита, множественного склероза и реакции "трансплантат против хозяина". Далее, в DE 19853487.6, а также в DE 19839566.3 описано применение алкилгидрофумаратов и диалкилфумаратов в трансплантационной медицине.

Неожиданно было обнаружено, что отдельные производные фумаровой кислоты или их смеси могут с успехом применяться для приготовления фармацевтической композиции для лечения митохондриальных заболеваний, в частности для лечения синдрома Паркинсона, болезни Альцгеймера, хореи Гентингтона, пигментной ретинопатии или митохондриальной энцефаломиопатии.

Предпочтительно для приготовления фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением применяют один или несколкько диалкиловых эфиров фумаровой кислоты и/или моноалкиловых эфиров фумаровой кислоты в форме свободной кислоты или в форме соли.

Диалкиловые эфиры фумаровой кислоты предпочтительно соответствуют формуле



в которой R₁ и R₂, которые при необходимости могут быть одинаковыми или различными, обозначают независимо друг от друга линейный, разветвленный, насыщенный или ненасыщенный C_1-24-алкильный остаток или С_5-50-арильный остаток и эти остатки в случае необходимости замещены галогеном (F, Cl, Вr, I), гидрокси, C_1-4-алкокси, нитро или цианогруппой.

В случае остатков R₁ и R₂ речь идет предпочтительно о метиле, этиле, н-пропиле, изопропиле, н-бутиле, втор-бутиле, трет-бутиле, пентиле, циклопентиле, 2-этилгексиле, гексиле, циклогексиле, гептиле, циклогептиле, октиле, виниле, аллиле, 2-гидроксиэтиле, 2- и/или 3-гидроксипропиле, 2-метоксиэтиле, метоксиметиле или 2- или 3-метоксипропиле.

Моноалкиловые эфиры фумаровой кислоты соответствуют предпочтительно формуле



в которой R₁ имеет определенное выше значение; А обозначает водород или катион щелочного или щелочноземельного металла или физиологически переносимый катион переходного металла, предпочтительно выбранный из Li⁺, Na⁺, К⁺, Мg²⁺ Са²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺ Mn²⁺, и n равно 1 или 2 и соответствует валентности А.

Производные фумаровой кислоты данного изобретения применяют предпочтительно в таком количестве, что фармацевтическая композиция содержит на единицу дозы количество одного или нескольких производных фумаровой кислоты, которое соответствует или эквивалентно количеству 1-500 мг, предпочтительно 10-300 мг и наиболее предпочтительно 10-200 мг фумаровой кислоты.

Предпочтительными являются применения, при которых фармацевтическую композицию вводят перорально, парентерально, ректально, трансдермально или в форме глазных капель, причем предпочтительным является пероральное введение. Композиция тогда находится в пригодной для каждого отдельного случая форме.

Если используется пероральное введение, то фармацевтическая композиция данного изобретения находится предпочтительно в форме таблеток с единичной дозой, в случае необходимости инкапсулированных или помещенных в саше микротаблеток (микрогранул) или гранулята, капсул или растворов для питья. Если речь идет о твердых дозированных формах или формах введения, они в предпочтительной форме осуществления обеспечены устойчивым к желудочному соку покрытием. Это покрытие может также обеспечиваться на инкапсулированных или помещенных в саше дозированных формах.

В соответствии с данным изобретением используют предпочтительно одно или несколько производных фумаровой кислоты, которые выбраны из группы, состоящей из диметилового эфира фумаровой кислоты, диэтилового эфира фумаровой кислоты, метилэтилового эфира фумаровой кислоты, метилгидрофумарата, этилгидрофумарата, метилфумарата магния, этилфумарата магния, метилфумарата цинка, этилфумарата цинка, метилфумарата железа, этилфумарата железа, метилфумарата кальция и/или этилфумарата кальция.

Фармацевтическая композиция данного изобретения может предпочтительно содержать 10-500 мг диалкилфумарата, в частности диметилфумарата и/или диэтилфумарата, 10-500 мг алкилфумарата кальция, в частности метилфумарата кальция и/или этилфумарата кальция, 0-250 мг алкилфумарата цинка, в частности метилфумарата цинка и/или этилфумарата цинка, 0-250 мг алкилгидрофумарата, в частности метилгидрофумарата и/или этилгидрофумарата и 0-250 мг алкилфумарата магния, в частности метилфумарата магния и/или этилфумарата магния, причем сумма указанных количеств соответствует эквиваленту 500 мг, предпочтительно 300 мг и наиболее предпочтительно 200 мг фумаровой кислоты.

Предпочтительные композиции в соответствии с данным изобретением содержат исключительно метилгидрофумарат или диметилфумарат в количестве от 10 до 300 мг.

Содержащиеся в композициях данного изобретения производные фумаровой кислоты получают, например, согласно описанному в Европейском патенте ЕР 0312679 способу.

Далее приводятся различные примеры получения предпочтительных лекарственных средств для пояснения применения в соответствии с данным изобретением.

Пример 1

Приготовление покрытых пленкой таблеток с устойчивым к желудочному соку покрытием, содержащие 100,0 мг кальциевой соли монометилфумарата, соответствующие 78 мг фумаровой кислоты

10,000 кг Са - соли монометилфумарата измельчают, интенсивно перемешивают и гомогенизируют с соблюдением соответствующих мер техники безопасности (дыхательная маска, перчатки, защитная одежда и т.д.) с использованием сита 800. Затем готовят вспомогательную смесь следующего состава: 21,000 кг производного крахмала (STA-RX 1500), 2,000 кг микрокристаллической целлюлозы (Avicel PH 101), 0,600 кг поливинилпирролидона (PVP, Kollidon25), 4,000 кг Primogel, 0,300 кг коллоидальной кремниевой кислоты (Aerosil).

Всю порошкообразную смесь соединяют с водой, перемешивают, гомогенизируют с использованием сита 200 и с 2%-ным водным раствором поливинилпирролидона (PVP, Kollidon25) обычным способом перерабатывают в гранулят связующего вещества и в сухом состоянии смешивают с внешней фазой. Эта фаза состоит из 2,000 кг так называемого FST-комплекса, содержащего 80% талька, 10% кремниевой кислоты и 10% стеарата магния.

Затем эту порошкообразную смесь обычным образом прессуют в выпуклые таблетки с весом 400 мг и диаметром 10,0 мм. Вместо этого классического способа таблетирования могут использоваться также другие способы изготовления таблеток, такие как прямое таблетирование, а также изготовление дисперсий твердых веществ по способу с использованием расплава и по способу распылительной сушки.

Устойчивость к желудочному соку

Готовят раствор 2,250 кг фталата гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР, Pharmacoat50) в смеси растворителей 2,50 л деминерализованной воды, 13,00 л ацетона Ph. Helv. VII и 13,00 л этанола (94 мас.%) и этот раствор смешивают с 0,240 кг касторового масла (Ph. Eur. II). Этот раствор в дражировочном котле стандартным образом в виде порций наносят на ядра таблеток, или распыляют на таблетки, или наносят в аппарате с псевдоожиженным слоем соответствующей конструкции.

После соответствующего высушивания наносят пленочное покрытие. Оно состоит из раствора Eudragit E 12,5%, 4,800 кг, талька Ph.Eur. II 0,340 кг, оксида титана (VI) Cronus RN56 0,520 кг, фарблака (нерастворимого органического пигмента) ZLT-2 синего (Siegle) 0,210 кг и полиэтиленгликоля 6000 Ph. Helv. VII 0,120 кг в смеси растворителей 8,200 кг 2-пропанола Ph. Helv. VII, 0,060 кг триацетата глицерина (Triacetin) и 0,200 кг деминерализованной воды. После гомогенного распределения в дражировочном котле или в псевдоожиженном слое сушат и полируют обычным образом.

Пример 2

Приготовление устойчивых к желудочному соку капсул, содержащих 86,5 мг Са-соли моноэтилфумарата и 110,0 мг диметилфумарата, соответствующих в целом 150 мг фумаровой кислоты

8,650 кг Са-соли моноэтилфумарата и 11,000 кг диметилфумарата интенсивно смешивают со смесью, состоящей из 15,000 кг крахмала, 6,000 кг лактозы Ph. Helv. VII, 2,000 кг микрокристаллической целлюлозы (Avicel), 1,000 кг поливинилпирролидона (PVP, Kollidon25), 4,000 кг Primogel и при соблюдении соответствующих мер техники безопасности (дыхательная маска, перчатки, защитная одежда и т.д.) гомогенизируют с использованием сита 800.

Всю порошкообразную смесь с 2%-ным водным раствором поливинилпирролидона (Kollidon25) обычным способом перерабатывают в гранулят связующего вещества и в сухом состоянии смешивают с внешней фазой. Она состоит из 0,350 кг коллоидальной кремниевой кислоты (Aerosil), 0,500 кг стеарата магния и 1,500 кг талька Ph. Helv. VII. Затем гомогенную смесь помещают в виде порций 500,0 мг в соответствующие капсулы, которые затем снабжают обычным способом устойчивым к желудочному соку покрытием, состоящим из фталата гидроксипропилэтилцеллюлозы и касторового масла в качестве пластификатора. Заполнение может также производиться вместо твердых желатиновых капсул в соответствующие устойчивые к желудочному соку капсулы, состоящие из смеси ацетата-фталата целлюлозы (CAP) и фталата гидроксипропилэтилцеллюлозы (НРМСР).

Пример 3

Приготовление устойчивых к желудочному соку микротаблеток в капсулах, содержащих 87,0 мг Са-соли моноэтилфумарата, 120 мг диметилфумарата, 5,0 мг Мg-соли моноэтилфумарата и 3,0 мг Zn-соли моноэтилфумарата, соответствующих в целом 164 мг фумаровой кислоты ("Forte"-таблетки)

8,700 кг Са-соли моноэтилфумарата, 12,000 кг диметилфумарата, 0,500 кг Мg-соли моноэтилфумарата, 0,30 кг Zn-соли моноэтилфумарата измельчают, интенсивно перемешивают и гомогенизируют с соблюдением соответствующих мер техники безопасности (дыхательная маска, перчатки, защитная одежда и т.д.) с использованием сита 800. Готовят вспомогательную смесь следующего состава: 18,00 кг производного крахмала (STA-RX 1500), 0,30 кг микрокристаллической целлюлозы (Avicel РН 101), 0,75 кг поливинилпирролидона (Kollidon 120), 4,00 кг Primogel, 0,25 кг коллоидальной кремниевой кислоты (Aerosil). Всю порошкообразную смесь соединяют со смесью активного компонента и гомогенизируют с использованием сита 200 и с 2%-ным водным раствором поливинилпирролидона (Kollidon K 25), обычным способом перерабатывают в гранулят связующего и в сухом состоянии смешивают с внешней фазой. Эта фаза состоит из 0,50 кг стеарата магния и 1,50 кг талька. Затем эту порошкообразную смесь обычным образом прессуют в выпуклые микротаблетки с брутто-массой 10,0 мг и диаметром 2,0 мм. Вместо этого классического таблетирования могут использоваться также другие способы изготовления таблеток, такие как прямое таблетирование, а также изготовление дисперсий твердых веществ по способу с использованием расплава и по способу распылительной сушки.

Устойчивое к желудочному соку покрытие может наноситься в классическом дражировочном котле желированием или распылением, а также в устройстве с псевдоожиженным слоем. Для достижения устойчивости к желудочному соку раствор 2,250 кг фталата гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР, Pharmacoat HP 50) растворяют в смеси следующих растворителей: ацетона 13,00 л, этанола 94 мас. %, денатурированного 2% кетоном, 13,50 л и минерализованной воды 2,50 л. К готовому раствору добавляют в качестве пластификатора касторовое масло 0,240 кг и обычным способом наносят в виде порций на центральные части таблеток.

Пленочное покрытие: Сразу же после завершения сушки в том же самом устройстве наносят суспензию следующего состава в качестве пленочного покрытия: тальк 0,340 кг, оксид титана (VI) Cronus RN 56 0,400 кг, фарблак L-Rotlack 86837 (нерастворимый органический пигмент) 0,324 кг, Eudragit E 12,5% 4,800 кг и полиэтиленгликоль 6000 рН 11 XI 0,120 кг в смеси растворителей следующего состава: 2-пропанол 8,170 кг, деминерализованная вода 0,200 кг и ацетат глицерина (триацетин) 0,600 кг.

Затем устойчивые к желудочному соку микротаблетки помещают в твердые желатиновые капсулы со вставляемыми одна в другую половинками до нетто-веса 500,0 мг и закрывают их.

Пример 4

Пример 4 показывает стимулирующее действие производных фумаровой кислоты на ферментативную активность сукцинатдегидрогеназы.

Сукцинатдегидрогеназа является компонентом митохондриальной мембраны и катализирует в цикле лимонной кислоты дегидрирование янтарной кислоты до фумаровой кислоты. Водород через флавопротеин транспорта электронов передается далее к дыхательной цепи. Таким образом, через активность сукцинатдегидрогеназы может осуществляться влияние на поток электронов цепи транспорта электронов. Последний снова сопрягается с процессом окислительного фосфорилирования, нарушение которого рассматривается как причина митохондриальных заболеваний. Таким образом, влияние на активность сукцинатдегидрогеназы может также воздействовать на окислительное фосфорилирование.

Таблица показывает оценку стимулирующего действия производных фумаровой кислоты на ферментативную активность сукцинатдегидрогеназы.