способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека

Формула изобретения

Способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека, характеризующийся тем, что прижизненно берут сыворотку крови, прогревают ее 30 мин при 90^oС, центрифугируют для удаления свернувшихся белков, добавляют к надосадочной жидкости сингенные клетки в виде первичных или перевиваемых культур и инкубируют 72-96 ч при 37^oС в атмосфере СO₂ с последующим подсчетом клеток в камере Горяева.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии и может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни индивидуума.

В мозговой ткани стареющих млекопитающих (мышей) накапливается вещество, вызывающее активную пролиферацию клеток глии как в первично-трипсинизированных, так и в перевиваемых клеточных культурах [1-3] . Это вещество ("цитопролиферативный фактор") накапливается с возрастом животного и легко регистрируется в мозговых экстрактах уже после первой трети жизни данного вида. Концентрация этого фактора соответствует определенному этапу жизни данного организма (фиг.1). Цитопролиферативный фактор обладает видоспецифичностью (его активность регистрируется только в культуре сингенных клеток) и необычайно высокой термостабильностью (фиг.2).

Однако его определение до сих пор проводили только в мозговых экстрактах, т.е. после гибели животных.

Целью предлагаемого изобретения является прижизненное определение цитопролиферативного фактора у стареющих млекопитающих и человека.

Сущность изобретения заключается в том, что прижизненно берут сыворотку крови стареющих млекопитающих, прогревают ее в течение 30 мин при температуре 90^о С, удаляют свернувшиеся белки путем центрифугирования, добавляют взвесь культуры клеток того же вида и инкубируют 3-4 дня при 37^oС в атмосфере СО₂ с последующим подсчетом клеток в камере Горяева.

Пример 1. Пробу крови мышей или человека в стерильной центрифужной пробирке помещают в термостат при 37^oС на 30 мин, после чего образовавшийся сгусток обводят и центрифугируют при 2000 об./мин 15 мин. Сыворотку отсасывают, разводят раствором Хэнкса в 10 раз и прогревают на водяной бане при 90^о С в течение 30 мин. Свернувшиеся белки осаждают центрифугированием при 12000 об./мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и в ней определяют активность цитопролиферативного фактора на культуре клеток мышей или человека.

Пример 2. В стерильных пробирках готовят разведения уже прогретых 30 мин при 90^oС и отцентрифугированных при 12000 об./мин сывороток мышей разного возраста. В каждую пробирку добавляют взвесь культуры мышиных клеток ЭПНТ - 5 в ростовой среде следующего состава: среда Игла Д-МЕМ+10% эмбриональной телячьей сыворотки +3% глутамина + антибиотики. Взвесь клеток добавляют из расчета конечной их концентрации в пробирках по 50 тыс. в 1 мл и разливают по лункам в 24-луночные стерильные планшеты с крышками. Через 96 ч инкубации при температуре 37^oС в атмосфере СО₂ культуральную жидкость удаляют, в лунки добавляют по 1 мл 0,2% раствора версена и после пипетирования в каждой лунке подсчитывают количество клеток с помощью камеры Горяева (фиг. 3).

В прогретых сыворотках стареющих мышей обнаруживается цитопролиферативный фактор в концентрации, сходной с таковой в мозговых экстрактах старых мышей. Вместе с тем ни в сыворотке человека, ни в сыворотке кролика, ни в сыворотке молодой мыши подобная активность на клетках мышей не регистрируется.

Пример 3. В стерильных пробирках готовят разведения уже прогретых 30 мин при 90^oС и отцентрифугированных при 12000 об./мин сывороток людей разного возраста. В каждую пробирку добавляют взвесь культуры клеток человека L₄₁ в ростовой среде приведенного выше состава. Взвесь клеток добавляют из расчета конечной их концентрации в пробирках по 50 тыс. в 1 мл и разливают по лункам в 24-луночные стерильные планшеты с крышками. Через 72 ч инкубации в атмосфере CO₂ и при температуре 37^oС культуральную жидкость удаляют, в лунки добавляют по 1 мл 0,2% раствора версена и после пипетирования в каждой лунке подсчитывают количество клеток с помощью камеры Горяева (фиг.4).

В прогретых сыворотках стареющих людей постепенно накапливается цитопролиферативный фактор, проявляющийся лишь в культуре клеток человека, в то время как ни в мозговом экстракте, ни в гретой сыворотке стареющих мышей подобная активность на клетках человека не только не регистрируется, но их добавление даже вызывает некоторый ингибирующий эффект на процесс клеточного размножения ксеногенных клеток.

Таким образом, предлагаемый способ жесткого предварительного прогревания и последующего центрифугирования сывороток стареющих млекопитающих и человека позволяет удалить белки, экранирующие активность цитопролиферативного фактора, и выявить в обработанных подобным образом сыворотках (при их испытании в культуре сингенных клеток) накопление цитопролиферативного фактора, сходного с тем, который обнаруживается в мозговых экстрактах стареющих млекопитающих.

Литература

1. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П., Игнатова Н.Г., Быковская С. И. , Халанский А. С. Возможная роль пролиферативной активности глии в повреждении и гибели нейронов в процессе старения//В кн.: "Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии". Материалы Второй Российской конференции 18-20 октября 1999 г. -М., 1999.-С.45-51.

2. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П., Игнатова Н.Г., Быковская С. И. , Халанский А. С. - Накопление в стареющем мозге млекопитающих фактора, резко стимулирующего пролиферативную активность глии//Бюл. эксперим. биол. и мед.-2000.-Т.129.- 3.-С.317-320.

3. Zuev V.A., Victorov I.V., Borodina N.P., Iqnatova N.G., Khalanski A. S. - Gliosis possible main factor of the neuronal death in the brain ageing//Уcnexи геронтологии-2000.- 5.-С. 92.