носитель чужеродной генетической информации для генной терапии

Формула изобретения

1. Применение лактоферрина в качестве носителя чужеродной генетической информации для генной терапии.

2. Носитель чужеродной генетической информации, представляющий собой конъюгат лактоферрина с ДНК конденсирующими поликатионами или с ДНК конденсирующими поликатионами и фиколом или декстраном.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к лечению заболеваний, связанных с различными генетическими нарушениями, приобретенными больным в течение жизни или вызванными наследственной патологией.

Известны многочисленные средства доставки генетического материала в виде рекомбинантных генов в эукариотические клетки. При этом используют две принципиально разные группы средств:

1. Вирусные частицы (упаковка целевых генов в вирусные частицы) [1].

2. Плазмиды (бактериальные автономно реплицирующиеся частиц со встроенными целевыми генами) [2].

При доставке с помощью вирусов достигается очень высокая эффективность встраивания целевых генов в клетки реципиента. Однако при этом организм может отвечать на введение вирусных частиц иммунной реакцией и постоянно существует опасность реверсии вируса до патогенного состояния. Кроме того, наработка вирусных частиц с целевыми генами технологически весьма сложна. Использование плазмид в качестве средств доставки имеет ряд преимуществ, так как не вызывает иммунизации организма, что позволяет плазмиды вводить повторно на протяжении длительного времени. Это особенно важно, например, при коррекции генетических дефектов. Вместе с тем не ограничивается размер экзогенного гена, встраиваемого в плазмиду. Кроме того, производство плазмид определенного состава и свойств высоко технологично (быстрое размножение плазмид в легко культивируемых бактериальных клетках). Поэтому разработка невирусных средств доставки генетического материала в эукариотические клетки целостного организма является весьма актуальной.

Невирусные способы можно условно разделить на следующие группы:

1. механические - прямое введение материала в ядра клеток (может использоваться только для введения генетического материала в клетки вне организма) [3].

2. физические - электропорация (внедрение плазмид в клетки под действием электрического поля), бомбардировка тканей микрочастицами [4].

3. химические (биологические) - использование для переноса ДНК липосом [5], катионных липидов [6] и других соединений.

Недостатком невирусных способов коррекции заболеваний, связанных с генетическими нарушениями, является отсутствие тканеспецифичности доставки экзогенного генетического материала в клетки реципиента. Для достижения тканеспецифического транспорта полинуклеотидов используют носители чужеродного генетического материала, включающие в свой состав специальные компоненты, которые обеспечивают транспорт целевого генетического материала в клетки-мишени. Например, лиганды интернализующих клеточных рецепторов. Такими лигандами могут выступать: железотранспортный белок плазмы крови - трансферрин [7] , асиалогликопротеины или галактозильные производные катионных полимеров [8], а также некоторые другие лиганды.

Задача изобретения - разработать эффективное тканеспецифическое неимунногенное средство доставки (носитель) чужеродного генетического материала в эукариотические клетки, которое можно получать с высокой воспроизводимостью простым технологическим путем.

Поставленная задача реализуется применением лактоферрина (ЛФ) в качестве носителя чужеродной генетической информации для генной терапии. Причем можно применять в качестве носителя чужеродной генетической информации ЛФ в виде конъюгатов с ДНК-конденсирующими агентами и/или высокомолекулярными соединениями.

ЛФ - железопереносящий белок молока и нейтрофилов млекопитающих (структурный гомолог трансферрина плазмы крови) (9). В большом количестве этот белок содержится в молозиве и грудном молоке. Этот белок состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой ~80 кДa. Определение первичной структуры показало, что полипептидная цепь состоит из 680-700 аминокислот и может быть разделена на 2 гомологичные части, каждая из которых очень прочно связывает 2 иона Fe³⁺ [10]. На сегодняшний день используют только иммунопротекторные, антибактериальные и/или противовоспалительные свойства этого белка [11, 12]. Из описанных ранее свойств ЛФ явным образом не вытекает возможность использования его в качестве носителя генетической информации для генной терапии.

Примеры осуществления изобретения:

Для лечебных целей мы использовали комплексы исходного немодифицированного ЛФ с целевыми ДНК. Лечебный эффект наблюдали после трансфекции в интервале от 2 до 60 дней при стандартном содержании лабораторных животных. Для выявления лечебного эффекта определяли степень экспрессии целевого гена по накоплению синтезируемого белкового продукта [13] или по специфической активности этого продукта [14].

Пример 1.

Перед каждым введением 1 животному 1-50 мкг плазмидной ДНК смешивали с 0,1 мкг - 4 мг очищенного исходного ЛФ (конечная концентрация ЛФ в пробе 0,01-60 мкг/мкл) в буфере, содержащим 0,14 М NaCl и 0,01 М NaHPO₃ и в объеме 5-100 мкл.

Анализ взаимодействия плазмидной ДНК с немодифицированным ЛФ осуществляли при помощи электрофореза в 0,8% агарозном геле, содержащем бромистый этидий [15] . Оптимальные соотношения для образования комплекса ДНК с ЛФ оценивали по уменьшению электрофоретической подвижности ДНК. Фиг. 1 представляет электрофорез в агарозе некомплексированной плазмиды pDMDl (часть А, дорожка 1), комплексов немодифицированного ЛФ в возрастающих количествах и плазмиды pDMDl (часть А, дорожки 2-4).

Пример 2.

Трансфекция мышечных волокон беспородных мышей плазмидами с экспрессируемым геном бактериальной бета-галактозидазы при помощи комплексов на основе ЛФ.

В качестве гена-репортера использовали ген бактериальной бетагалактозидазы под эукариотическим промотором в составе плазмиды pCMVLacZ. Конструкции плазмидной ДНК в комплексе с немодифицированным ЛФ (приготовление см. пример 1) вводили от 1 до 5 раз в течение 2 недель в четырехглавую мышцу бедра (musculus quadriceps femori). Под нембуталовым наркозом животных фиксировали на специальном столике, разрезали кожу над мышцей и под контролем бинокулярной лупы при помощи инсулинового шприца вводили 5-100 мкл раствора за 1 раз, содержащего испытуемые соединения или некомплексированную плазмиду в качестве контроля. Животных забивали через 2-60 дней после введения комплексов. После проведения гистохимической окраски на выявление бетагалактозидазной активности для установления характера и локализации окраски мышцы, обработанные X-gal, заливали парафином по стандартной методике и готовили гистологические препараты [16]. Участки ткани с бетагалактозидазной активностью выявляли по появлению специфичного сине-зеленого окрашивания.

В результате получили, что в мышце введения комплексов ДНК с интактным ЛФ отчетливо прокрашиваются тяжи, соответствующие трансфицированным волокнам. Фиг.2 представляет результаты цитохимического выявления активности гена бета-галактозидазы на гистологических срезах musculus quadriceps femori в контралатеральной мышце (А), в мышце введения (Б) после внутримышечного введения мышам плазмиды pCMVLacZ в комплексе с немодифицированным ЛФ. Анализ природы и характера полученной окраски на парафиновых срезах подтвердил соответствие окрашенных участков мышечным волокнам. В одноименной мышце контралатеральной конечности и в других мышцах передних и задних конечностей окраски не наблюдали. В контрольных экспериментах не выявляли окрашенных мышечных волокон, содержащих активную бета-галактозидазу - продукт экспрессии маркерного экзогенного гена.

Таким образом, комплексы на основе интактного ЛФ и плазмидной ДНК проникли в мышечные волокна и обеспечили экспрессию содержащихся в плазмиде экзогенных генов.

Пример 3.

Трансфекция мышечных волокон мышей линии mdx (модель миодистрофии Дюшенна) рекомбинантной плазмидой, содержащей ген дистрофина человека, при помощи интактного ЛФ человека.

Исследование проводили на самцах мышей F1 гибридов CBAxC57BL110J +/+ и на C57BL6J mdx/mdx (биологических моделях миодистрофии Дюшенна) в возрасте около 3 месяцев и весом до 25 г. В качестве маркера использовали кДНК-копию (12 т. п. н.) гена дистрофина человека в плазмиде pDMDl (16 т.п.н.) (вектор pJ4 с экспрессирующимся в эукариотических клетках геном дистрофина под контролем промотора MoMuLTR). Комплексы ЛФ-плазмидная ДНК готовили и вводили животным как указано в примере 1.

Через 5-60 дней после введения мышей забивали дислокацией шейных позвонков, извлекали четырехглавые мышцы опытной и контралатеральной конечностей, а также другие мышцы, фиксировали их в жидком азоте и готовили серийные криостатные срезы толщиной 5-10 мкм. Иммуноцитохимическую окраску на наличие дистрофина осуществляли путем инкубации срезов с кроличьими поликлональными антителами к С-концевому участку дистрофина человека и далее в среде с овечьими противокроличьими антителами, содержащими флуоресцентную метку. Подсчет дистрофинположительных мышечных волокон проводили на флуоресцентных микроскопах фирм "Leitz" и "Axioscope" ("Opton") при 240-1200-кратном увеличении. После регистрации числа дистрофин-положительных волокон срезы отмывали и окрашивали гематоксилин-эозином. Подсчитывали среднее число волокон на один срез. На поперечных криосрезах мышечных волокон, окрашенных специфичными к дистрофину антителами, наблюдались кластеры дистрофин-положительных мышечных волокон, которые не обнаруживались в мышцах мышей mdx. Фиг. 3 представляет результат иммунохимической окраски криостатных срезов musculus quadriceps femori на дистрофии: мышь mdx на 21 день после внутримышечной трансфекции комплексом pDMDl + немодифицированный ЛФ (А), интактная мышь mdx (Б), мышь CBAxC57B110J +/+ - положительный контроль (В). Характерной особенностью трансфекции кДНК гена дистрофина являлся отчетливый полиморфизм локализации дистрофина человека в мышечных волокнах мыши. Были выявлены 3 основных варианта внутриклеточного распределения дистрофина:

1) типичные кластеры дистрофин-положительных мышечных волокон с четкой присарколемной локализацией дистрофина;

2) волокна с фрагментами присарколемного дистрофина;

3) волокна с диффузной окраской миоплазмы на дистрофии.

По визуальной оценке большинство дистрофин-положительных волокон относятся к первым двум типам.

Введение некомплексированной ("голой") плазмиды pDMDl приводит к появлению от 2,1 до 3,3% дистрофин-положительных мышечных волокон. Введение комплексов ЛФ с pDMDl в зависимости от длительности экспозиции индуцирует появление от 5,5 до 14,4% дистрофин-положительных мышечных волокон. При этом наблюдали увеличение числа дистрофин-положительных мышечных волокон как в мышце введения, так и в одноименной мышце контралатеральной лапы и в мышцах других конечностей. По числу дистрофин-положительных мышечных волокон мышцы разных конечностей существенно не различались, однако максимальный эффект наблюдали в мышцах контралатеральной лапы.

Таким образом, отчетливо проявляется способность ЛФ стимулировать проникновение и экспрессию гена дистрофина человека в лишенных дистрофина мышечных волокнах мутантных особей мышей.

Для лечебных целей мы также использовали комплексы целевых ДНК с различными производными ЛФ, например конъюгатами ЛФ с ДНК-конденсирующими поликатионами (полилизин, полиэтиленимин и др.), высокомолекулярными полимерами (фиколл, декстран и др.) и другими соединениями, обеспечивающими специальные функции конечных комплексов. Лечебный эффект наблюдали после трансфекции в интервале от 2 до 60 дней при стандартном содержании лабораторных животных. Для выявления лечебного эффекта определяли степень экспрессии целевого гена по накоплению синтезируемого белкового продукта [13] или по специфической активности этого продукта [14].

Белок-полинуклеотидные частицы, включающие в свой состав конъюгаты ЛФ, получали последовательно. Сначала синтезировали различные конъюгаты ЛФ, которые затем связывали при определенных условиях с целевым геном.

Пример 4.

Синтез конъюгатов на основе ЛФ и полилизина осуществляли добавлением к очищенному ЛФ 1-50-кратный молярный избыток ангидрида йодуксусной кислоты, смесь инкубировали при постоянном перемешивании 1 ч при комнатной температуре, избыток низкомолекулярного реагента отделяли диализом. Аналогично ангидридом йодоуксусной кислоты обрабатывали полилизин (мол. м. 2 - 150 кДa). Далее к активированному полилизину добавляли 50-100-кратный (по отношению к начальному количеству ангидрида йодоуксусной кислоты) избыток дитиотреитола и смесь после часовой инкубации при комнатной температуре диализовали против физиологического раствора. Модифицированные таким образом полилизин и ЛФ смешивали в количественном соотношении 1:1 - 1:15 соответственно.

Пример 5.

Синтез конъюгатов на основе носителя фикол-400 осуществляли по схеме: 50-500 мг фикола-400 растворяли в 3-30 мл 50% водного ацетона и добавляли 0,15-1,5 мл ацетонового раствора BrCN (100 мг/мл) и 0,15-1,5 мл ацетонового раствора триэтиламина (150 мг/мл). Смесь инкубировали 5 мин при температуре -20^oС. Далее активированный фикол осаждали ацетоном с добавлением 0,2 н. НСl и промывали 1-5 раз. Затем к аликвоте растворенного в воде фикола добавляли 10-100-кратный молярный избыток восстановленного глутатиона и рН раствора доводили до 7,5-9,4 при помощи NaHCO₃ - Na₂CO₃. Смесь инкубировали в течение 12 часов при комнатной температуре. Избыток непрореагировавшего реагента отделяли путем ультрафильтрации. К тиоловому производному фикола добавляли 1-15-кратный молярный избыток полилизина, модифицированного йодацетатом и 1-50-кратный молярный избыток ЛФ, также модифицированного йодацетатом.

Для доказательства получения конъюгатов использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [17]. Изменение электрофоретической подвижности исследуемой пробы в отличие от электрофоретической подвижности немодифицированного ЛФ подтверждало образование химической связи. Вместе с тем проводили иммунологическую характеристику конъюгатов методом ракетного иммунофореза [18], иммуноблоттинга [19]. Предлагаемый способ синтеза производных ЛФ действительно дает возможность получить частицы, включающие в свой состав как ЛФ, так и дополнительные компоненты специального назначения (поликатионы, фикол и др.).

Пример 6.

Полученные конъюгаты соединяли с плазмидными ДНК путем постепенного добавления раствора конъюгата к раствору ДНК при температуре 0 - +4^oС, при постоянном перемешивании и содержании NaCl в растворах в количестве 0,15-1,5 М.

Анализ взаимодействия плазмидной ДНК с конъюгатами ЛФ осуществляли при помощи электрофореза в 0,8% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. К 1 мкг ДНК добавляли возрастающие количества конъюгата (пример 4 или 5) в объеме, равном объему раствора ДНК. После 15-минутной инкубации при комнатной температуре пробы подвергали электрофорезу в трис-боратной системе рН 8,0 [15] . Оптимальные соотношения для образования комплекса ДНК с ЛФ и с конъюгатами оценивали по уменьшению электрофоретической подвижности ДНК. Фиг. 1 представляет электрофорез в агарозе некомплексированной плазмиды pCMVLacZ (часть Б, дорожка 1), комплексов конъюгата ЛФ, выполненного как показано в примере 4, в возрастающих количествах и плазмиды pCMVLacZ (часть Б, дорожки 2-5).

Пример 7.

Трансфекция мышечных волокон мышей линии mdx (модель миодистрофии Дюшенна) рекомбинантной плазмидой, содержащей ген дистрофина человека, при помощи конъюгатов ЛФ человека.

Белок-полинуклеотидные частицы, включающие в свой состав конъюгаты ЛФ, получали, как описано в примере 6.

Экспрессию гена дистрофина в мышечных волокнах мутантных мышей оценивали, как указано в примере 2. Найдено, что производные ЛФ, так же как и исходный ЛФ, стимулируют продукцию дистрофина в мышечных волокнах с появлением до 6,8% дистрофин-положительных мышечных волокон.

Подбор оптимального тканеспецифического носителя (немодифицированный ЛФ или конъюгаты на его основе) чужеродной генетической информации устанавливается в каждом случае отдельно, что связано с природой используемой нуклеотидной последовательности.

Отличительные особенности и преимущества генно-терапевтических комплексов на основе носителя ЛФ или его конъюгатов связаны со следующими свойствами белка:

1. Устойчивостью фрагмента, связывающегося с собственными рецепторами ЛФ, к протеолитической деградации трипсиноподобными ферментами.

2. Устойчивостью к воздействию лизосомальных ферментов.

3. Наличием сигнала ядерной транслокации (обеспечивает транспорт ЛФ-содержащих комплексов непосредственно в ядро клетки).

4. Отсутствием иммунного ответа при введении особям того же вида, что и источник данного белка. Поэтому введение комплексов на основе ЛФ может осуществляться повторно, что важно при лечении, например, наследственных заболеваний, когда необходима постоянная, на протяжении всей жизни коррекция нарушенной функции гена.

5. Низкая начальная концентрация ЛФ в плазме крови не вызывает конкуренции между свободным ЛФ организма и вводимыми комплексами ДНК с ЛФ. Вместе с тем ЛФ может быть легко получен из молока или в виде рекомбинантного белка в бактериальной культуре.

Перечень фигур

Фиг.1. Электрофорез в агарозном геле комплесов плазмидных ДНК с немодифицированным ЛФ (часть А) и с конъюгатом ЛФ (часть Б).

Фиг. 2. Цитохимическое выявление активности гена бета-галактозидазы на гистологических срезах musculus quadriceps femori в контралатеральной мышце (А), в мышце введения (Б) после внутримышечного введения мышам плазмиды pCMVLacZ в комплексе с немодифицированным ЛФ.

Фиг. 3. Иммунохимическая окраска криостатных срезов musculus quadriceps femori на дистрофии: мышь mdx на 21 день после внутримышечной трансфекции комплексом pDMD 1 + не модифицированный ЛФ (А), интактная мышь mdx, мышь CBAxC57B110J +/+ - положительный контроль (В).

Источники информации

1. Biotechnology, 1995, 13, pp. 222-225.

2. J. Mol. Med., 1995, 73, 10, pp. 479-486.

3. Cell, 1980 22, (2 Pt 2), pp. 479-488.

4. Science, 1990, 250, pp. 1421-1423.

5. J. Biol. Chem., 1980, 255, pp. 10431-10435.

6. Hum. Gene Therapy, 1996, 7, pp. 1437-1446.

7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, pp. 8850-8854.

8. Bioconjugate Chem., 1995, 6, pp. 401-410.

9. Acta Chem. Scand., 1960, 14, pp. 510-512.

10. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, pp. 1769-1763.

11. Заявка на патент РФ 94035529, опубликованная 20.09.96.

12. Заявка на патент РФ 95102930/14, опубликованная 27.08.97.

13. Генетика, 1998, т. 34, 7, с. 876-882.

14. Cell, 1984 (part 2), 39, pp. 653-662.

15. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY), 1989. V. 3.

16. Микроскопическая техника. М.: Советская наука, 1957, 137 с.

17. Nature, 1970, 227, рр. 680-685.

18. Anal. Bioch, 1966, 15, 1, pp. 45-52.

19. Anal. Biochem., 1981, 112, pp. 195-203.