способ получения поверхностных антигенных белков из вирусов гриппа, противогриппозная вакцина

Формула изобретения

1. Способ получения поверхностных антигенных белков из вирусов гриппа, размноженных на культуре животных клеток, предусматривающий последовательные стадии: а) обработка содержащей цельные вирусы жидкости, полученной из культуры клеток, расщепляющим ДНК ферментом и б) добавление катионного детергента с последующим выделением поверхностных антигенных белков.

2. Способ по п. 1, в котором обработку расщепляющим ДНК ферментом проводят во время размножения вирусов гриппа в культуре клеток.

3. Способ по п. 1, в котором в качестве главного соединения катионного детергента используют соединение общей формулы



где R₁, R₂ и R₃ являются одинаковыми или разными и каждый - алкил или арил, или R₁ и R₂ вместе с атомом азота, с которым они соединены, образуют 5- или 6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, а R₃ - алкил или арил, или R₁, R₂ и R₃ вместе с атомом азота, с которым они соединены, обозначают 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, ненасыщенное при атоме азота;

R₄ - алкил или арил;

Х - анион.

4. Способ по п. 1, где в качестве главного соединения катионного детергента используется бромид цетилтриметиламмония.

5. Способ по п. 1, в котором катионный детергент используют в сочетании с неионным детергентом.

6. Способ по п. 1, в котором вирусы гриппа размножают на линии животных клеток.

7. Способ по п. 1, в котором вирусы гриппа размножают на клетках MDCK.

8. Противогриппозная вакцина на основе поверхностных антигенов, получаемых способом по пп. 1-7, имеющая содержание ДНК клеток-хозяев, равное (или меньшее) 25 пг на дозу.

9. Противогриппозная вакцина на основе поверхностных антигенов по п. 8, имеющая содержание ДНК клеток-хозяев менее 10 пг на дозу.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к противогриппозным вакцинам на основе поверхностного антигена, полученным приготовлением из вирусов гриппа, размноженных на культуре живых клеток, и к способу получения поверхностных антигенных белков вирусов гриппа, размноженных на культуре животных клеток.

Частица вируса гриппа имеет размер приблизительно 125 нм и состоит из кора рибонуклеиновой кислоты (РНК), связанной с нуклеопротеином, окруженного оболочкой вируса с липидной двухслойной структурой. Внутренний слой оболочки вируса состоит преимущественно из белков матрикса, а наружный слой содержит большей частью происходящий из хозяина липидный материал.

Так называемые "поверхностные белки", нейраминидаза (NA) и гемагглютинин (НА), видны в виде заостренных стержней на поверхности тела вируса.

Большинство коммерчески доступных инактивированных противогриппозных вакцин представляют собой так называемые "расщепленные вакцины" или "субъединичные вакцины".

"Расщепленные вакцины" получают обработкой цельного вируса гриппа солюбилизирующими концентрациями детергентов и последующим удалением детергента и основной массы вирусного липидного материала.

"Субъединичные вакцины" против гриппа в отличие от "расщепленных вакцин" не содержат все вирусные белки. Вместо этого "субъединичные вакцины" обогащены поверхностными белками, ответственными за индукцию желательных нейтрализующих вирус (следовательно, защищающих) антител при вакцинации.

Большинство коммерчески доступных противогриппозных вакцин получены из вирусов гриппа, культивированных на куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. Однако широко признается, что получение вируса гриппа из яиц для целей приготовления вакцин имеет несколько недостатков:

1. Такой способ получения является довольно уязвимым вследствие варьирования (микро)биологического качества яиц.

2. Такой способ полностью лишен приспособляемости (гибкости) в случае неожиданного увеличения спроса, т.е. в случае серьезной эпидемии или пандемии, вследствие проблем материально-технического обеспечения, связанных с недоступностью больших количеств пригодных для этого способа яиц.

3. Полученные таким способом вакцины противопоказаны для лиц с известной аллергией на белки кур и/или яиц.

Решение этих проблем может быть найдено в получении вируса гриппа из культур ткани. Предполагается, что такой способ получения имеет многие преимущества:

1. Клеточные линии культур ткани доступны в хорошо известных системах банков клеток, не содержащих (микро)биологических примесей, вследствие чего можно значительно улучшить постоянство от серии к серии и получить продукт более высокого качества.

2. Этот способ будет увеличивать шансы иметь достаточное количество доступной вакцины в случае серьезной угрозы эпидемии или пандемии.

3. Полученный материал вируса гриппа будет более пригоден для альтернативных путей введения (перорального, назального введения, введения ингаляцией).

4. С точки зрения WHO, эта технология позволит отсрочить ежегодную рекомендацию относительно состава вакцин (с середины февраля на середину марта), что увеличит пригодность вакцины для циркулирующих штаммов.

Несмотря на это, в отношении культуры ткани для вируса гриппа остается также важная проблема, так как в этой вакцине может присутствовать генетический материал из непрерывных клеточных линий.

Подобная проблема создает опасность, которая, если ее не устранить, может привести к тому, что регулирующие ведомства отклонят запросы на разрешение относительно продажи для таких противогриппозных вакцин по соображениям безопасности. Например, U. S. Food and Drug Administration требует, чтобы биотехнологические продукты для человека не содержали более 100 пг ДНК клетки-хозяина на одну дозу.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ получения поверхностного антигена вируса гриппа для целей приготовления вакцин, который является безопасным и не содержит неприемлемых количеств вредного генетического материала и удовлетворяет требованиям, установленным регулирующими ведомствами. Однако считалось желательным и неожиданно также достижимым приготовление противогриппозных вакцин с содержанием ДНК клетки-хозяина, значительно более низким, чем 100 пг на дозу.

Таким образом, данное изобретение относится к противогриппозной вакцине на основе поверхностного антигена, полученной приготовлением из вирусов гриппа, размножаемых на культуре животных клеток, и имеющей содержание ДНК клеток-хозяев, равное 25 пг на дозу или меньшее 25 пг на дозу.

В характерном варианте данное изобретение обеспечивает способ получения поверхностных антигенных белков, применимых для приготовления такой противогриппозной вакцины с низким содержанием ДНК, из вирусов гриппа, размножаемых на культуре животных клеток, предусматривающий последовательные стадии:

а. Обработки содержащей цельный вирус жидкости, полученной из культуры клеток, расщепляющим ДНК ферментом и

б. Добавления катионного детергента, с последующим выделением поверхностных антигенных белков.

Способ согласно данному изобретению может быть применен в ходе получения вакцин, содержащих разнообразные штаммы вирусов гриппа, такие как вирусы, типичные для гриппа человека, гриппа свиней, гриппа лошадей и гриппа птиц.

Культура животных клеток в соответствии с данным изобретением может содержать либо эмбриональную клетку, такую как фибробласты куринового эмбриона (CEF), либо непрерывную клеточную линию, такую как клетки почек собак (Madin Darbi Canine Kidney Cells, MDCK), клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки Vero.

Обработку содержащей цельный вирус жидкости расщепляющим ДНК ферментом можно проводить непосредственно в ферменторе, необязательно во время процесса культивирования клеток и размножения вируса.

Подходящими примерами расщепляющих ДНК ферментов являются ДНКаза (например, классифицированная как ЕС 3.1.21 и ЕС 3.1.22) и нуклеазы (например, классифицированные как ЕС 3.1.30 и ЕС 3.1.31).

Подходящими катионными детергентами в соответствии с данным изобретением являются преимущественно соединения общей формулы



где

R₁, R₂ и R₃ являются одинаковыми или разными и каждый обозначает алкил или арил,

или R₁ и R₂ вместе с атомом азота, с которым они соединены, образуют 5- или 6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо,

и R₃ обозначает алкил или арил,

или R₁, R₂ и R₃ вместе с атомом азота, с которым они соединены, обозначают 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, ненасыщенное при атоме азота, и

R₄ обозначает алкил или арил, и

Х обозначает анион.

Примерами таких катионных детергентов являются цетилтриметиламмониевые соли, такие как бромид цетилтриметиламмония (С.Т.А.В.), и миристилтриметиламмониевая соль. Подходящими детергентами являются также липофектин, липофектамин, DOTMA.

Необязательно, к этим катионным детергентам может быть добавлен неионный детергент, такой как Твин.

Выделение поверхностных катионных белков после стадии обработки детергентами может, например, включать в себя стадии:

1. Отделение РНП-частицы (тела вируса) от поверхностных антигенных белков, например, центрифугированием или ультрафильтрацией, и

2. Удаление детергента из поверхностных антигенных белков, например, гидрофобным взаимодействием детергента с подходящей смолой (такой как Amberlite XAD-4) и/или ультра(диа)фильтрацией.

Неожиданно, способ данного изобретения дал продукт, который имеет чрезвычайно низкое содержание происходящей из животных клеток ДНК. Легко достигаются концентрации ДНК, такие низкие, как 25 пг на дозу, а во многих случаях даже такие низкие, как 10 пг на дозу.

Поверхностные антигенные белки могут быть обработаны для приготовления противогриппозной вакцины, например, добавлением буфера (например, ЗФР) и/или смешиванием с антигенами из других серотипов вируса гриппа.

Необязательно, может потребоваться концентрирование поверхностного антигена для последующего приготовления вакцины.

Пример 1

А. Размножение вируса

1. Вирус гриппа с антигеном типа B/Yamagata размножают на клетках MDCK (Madin Darbi Canine Kidney, ATCC CCL34) в ферменте путем инкубирования посевного вирусного материала с клетками в течение двух дней при 35^oС.

2. Затем рН жидкости фермента повышают до 8 добавлением разбавленного гидроксида натрия и добавляют нуклеазу Бензона (Benzon) до конечной концентрации 1000 единиц (1 мкг) на 1 л.

3. Инкубирование продолжают при 35^oС еще в течение 4 ч.

В. Выделение вируса

1. Жидкость фильтруют через глубинный фильтр с номинальным размером пор 0,5 мкм для удаления клеточных остатков (дебриса).

2. Затем вирус гриппа концентрируют и очищают ультрафильтрацией с применением мембраны с отсечением молекулярной массы 300000.

3. К концентрату добавляют сахарозу до конечной концентрации 30% (м/об), после чего добавляют формальдегид до конечной концентрации 0,015% (м/об). Эту смесь перемешивают при 2-8^oС в течение 72 ч.

4. Затем вирусный концентрат разбавляют в 5 раз забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) и наносят на аффинную колонку, содержащую Amicon Cellufine Sulphate. После удаления примесей промыванием забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) вирус элюируют раствором 1,5 М хлорида натрия в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР). Элюат концентрируют и обессоливают ультрафильтрацией с использованием мембраны с отсечением молекулярной массы 300000.

С. Выделение субъединиц.

1. Добавляют неионный детергент Твин-80 до конечной концентрации 300 мкг/мл и бромид цетилметиламмония до конечной концентрации 750 мкг/мл. Эту смесь перемешивают при 4^oС в течение 3 ч, после чего РНП-частицы отделяют от поверхностных антигенных белков центрифугированием.

2. Супернатант перемешивают с Amberlite XAD-4 в течение ночи при 2-8^oС для удаления детергентов. Амберлит удаляют фильтрованием и затем фильтрат подвергают стерильному фильтрованию через фильтр 0,22 мкм.

В ходе вышеописанного процесса содержание ДНК клеток-хозяев в пробах анализируют в соответствии со стандартным тестом, основанным на слот-блот-гибридизации с использованием ³²Р-меченого ДНК-зонда собаки.

Результаты этого теста ДНК, выполняемого после различных стадий, представлены в таблице (количество ДНК на iv-дозу выражено в пикограммах на 50 мкг НА).

Пример 2

Размножение, очистку, инактивацию и расщепление вируса выполняют, как в Примере 1.

Обработку нуклеазой Бензона жидкости ферментера во время последних часов размножения вируса (Стадии А2 и A3), с использованием рН среды для размножения (Стадия A1), дает одинаковые результаты в отношении удаления ДНК.

ДНКаза 1, хотя и требующаяся в более высоких концентрациях, равным образом эффективна в удалении ДНК клеток-хозяев (во время Стадий А1-А3). Сходные результаты могут быть получены с использованием других эндонуклеаз.

Пример 3

Процесс проводят, как в Примерах 1 и 2, за исключением того, что удаление клеточных остатков (дебриса) (Стадия В1) осуществляют центрифугированием.

Пример 4

Процесс проводят, как в Примерах 1, 2 или 3, за исключением того, что вирус концентрируют и очищают (Стадия В2) из жидкого ферментера центрифугированием в проточной зональной центрифуге непрерывного действия, например Electro-Nucleonics (model RK), с использованием сахарного градиента, например, в забуференном фосфатом солевом растворе.

Пример 5

Процесс выполняют, как в Примерах 1-4, за исключением того, что добавление раствора бромида цетилтриметиламмония в Стадии С1 заменяют добавлением раствора бромида цетилпиридиния, бромида миристилтриметиламмония, хлорида бензетония, хлорида метилбензетония, хлорида декаметония или бромида стеарилдиметилбензиламмония. Получены сходные результаты в отношении удаления ДНК клеток-хозяев.

Пример 6

Процесс выполняют, как описано в Примере 1, за исключением того, что добавление сахарозы выполняют после аффинной колоночной хроматографии и формальдегид добавляют до максимума 0,05% (м/об) в течение 120 ч.

Пример 7

Способы согласно Примерам 1, 2, 3, 4 или 6 применимы также успешно для приготовления вакцин с низким содержанием ДНК из вирусов гриппа штаммов B/Harbin, B/Panama, A/Texas (H1N1), A/Taiwan (H1N1), A/Johannesburg (H3N2) и A/Wuhan (H3N2).