способ лечения заболеваний животных, вызванных бактериями (варианты), и способ изготовления лекарственного средства

Формула изобретения

1. Способ лечения заболеваний животных, вызванных бактериями, выбранными из группы, включающей Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, отличающийся тем, что животному вводят эффективное количество соединения формулы I, (см. графическую часть):

в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соединение формулы I вводится свинье, которая нуждается в таком лечении.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соединение формулы I вводится совместно по крайней мере с одним приемлемым для ветеринарии носителем.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соединение формулы I в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли вводится свинье для лечения колита свиней, вызванного Serpulina pilosicoli.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соединения формулы I в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли вводится свинье для лечения илеита, вызванного Lawsonia intracellularis.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соединение формулы I в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли вводится ягнятам, овцам и крупному рогатому скоту для лечения пневмонии, связанной с заражением Pasteurella haemolytica.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заболевания выбраны из группы, включающей колит свиней, илеит свиней, вторичную пневмонию свиней и пневмонию ягнят, овец и крупного рогатого скота.

8. Способ лечения инфекций у животных, вызванных бактериями, выбранными из группы, включающей Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis, отличающийся тем, что животному вводят эффективное количество соединения формулы I, (см. графическую часть):

в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли.

9. Способ изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний животных, вызванных бактериями, выбранными из группы, включающей Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, отличающийся тем, что соединения формулы I, (см. графическую часть):

в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли смешивают в эффективном количестве по крайней мере с одним приемлемым для ветеринарии носителем или разбавителем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к производным плевромутилина. В частности, оно относится к применению в ветеринарии соединения формулы I



т. е. 14-О-[1-[(R)-2-амино-3-метилбутириламино]-2-метилпропан-2-илтиоацетил] мутилина в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли в терапии ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, что далее в настоящем описании коротко называется "применением по изобретению".

Соединение формулы I в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли (Econor) далее в настоящем описании коротко называется "агент по изобретению". Предпочтительно оно представлено в форме соли, прежде всего в форме гидрохлорида. В этой форме оно известно под общим названием гидрохлорид валнемулина.

Следует отметить, что понятие "терапия" относится к обработке как в профилактических, так и в лечебных целях.

Соединение формулы I в форме свободного основания или в форме соли, приемлемой для хемотерапии или ветеринарии, известно, например, из ЕР 153277, а эквивалентные ему соединения, например, из US 4675330, в частности соединения, описанные в примере 12 указанного документа.

Из приведенных литературных источников известно также, что это соединение обладает:

ингибирующим действием in vitro в отношении различных бактерий в концентрациях приблизительно 0,008-25 мкг/мл,

ингибирующим действием in vitro в отношении микоплазм и хламидий обычно в концентрациях приблизительно 0,008-0,5 мкг/мл,

ингибирующим действием in vivo в отношении различных бактериальных штаммов при использовании мышей в качестве хозяев и в отношении штаммов микоплазм при использовании кур в качестве хозяев в дозах приблизительно 12-50 мг/кг веса тела,

антипаразитарным действием, в частности, in vivo в отношении кокцидий домашней птицы в дозах 20-150 мг/кг корма и

стимулирующим рост действием в отношении кур и свиней in vivo в дозах 10-50 мг/кг корма,

что делает это соединение в целом пригодным в качестве антибиотика с антибактериальной активностью и в качестве ветеринарного агента, в частности для хемотерапевтического лечения кокцидиоза у домашней птицы, а также в качестве стимулятора роста кур и свиней.

Неожиданно было обнаружено, что агент по изобретению особенно эффективен для лечения ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, таких как энзоотическая пневмония свиней, вызываемая заражением Mycoplasma hyopneumoniae, дизентерия свиней, вызываемая заражением Serpulina (прежнее название Treponema) hyodysenteriae, колит свиней (воспаление толстой кишки), связанный с заражением Serpulina pilosicoli, илеит свиней (пролиферативная энтеропатия свиней, интенстинальный аденоматоз свиней), связанный с заражением Lawsonia intracellularis, хроническое респираторное заболевание и артрит у домашней птицы, связанные с заражением Mycoplasma gallisepticum, вторичная пневмония свиней, связанная с заражением Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis, пневмония ягнят, овец и крупного рогатого скота (транспортная пневмония, транзитная лихорадка, телячий респираторный комплекс, бычий пневмонический пастереллез), связанная с заражением Pasteurella haemolytica, и полиартрит свиней, связанный с заражением Mycoplasma hyosynoviae.

Кроме того, также неожиданно было обнаружено, что индукция устойчивости к лекарству является чрезвычайно низкой.

Таким образом, изобретение предназначено для применения в ветеринарии, как указано выше.

Изобретение далее относится к применению агента по изобретению для изготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в терапии ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота.

Изобретение также относится к способу лечения ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, включающему введение терапевтически эффективного количества агента по изобретению животному, нуждающемуся в таком лечении.

Изобретение также относится к ветеринарному агенту, предназначенному для применения в терапии ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, включающему соединение формулы I в форме свободного основания или в форме, приемлемой для ветеринарии соли вместе по крайней мере с одним приемлемым для ветеринарии носителем или разбавителем.

В изобретении, кроме того, предлагается способ изготовления лекарственного средства, предназначенного для описанного выше применения, который включает смешение агента по изобретению по крайней мере с одним приемлемым для ветеринарии носителем или разбавителем.

Животное, страдающее от ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, например, возможно еще не подвергалось лечению от бактериального заражения с помощью агента по изобретению или не получало агент по изобретению для стимуляции роста.

А) Заражение Mycoplasma hyopneumoniae

Заражение Mycoplasma hyopneumoniae может быть диагностировано общепринятым методом, например, как это описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D.J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 164-165. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Активность in vitro

В опыт включено десять природных изолятов, полученных при вспышках энзоотической пневмонии в различных стадах, и типовой штамм "J". Изоляты клонируют на фильтре, идентифицируют с помощью реакции задержки роста с использованием диска и используют 7-10 пассажей. Тест по определению минимальной ингибирующей концентрации (МИК) проводят в жидкой среде (Friis N.F. и др., Acta Vet. Scand. 32 [1991] 425-429) в пробирках объемом 1,8 мл, содержащих двукратную концентрацию валнемулина и бифумарата тиамулина. Микоплазмы вносят в 10-кратно разбавленной среде и рост культур определяют визуально, используя пробирки, засеянные 10²-10⁴ цветообразующих единиц. Первичную оценку проводят через 2-4 дня, а последнюю оценку через 10-14 дней, когда уже больше не происходит прогрессирующего изменения цвета. МИК определяют как наименьшую концентрацию тестируемого соединения, вызывающую ингибирование роста по сравнению с контролем (Friis N.F. и Szancer J., Acta Vet. Scand. 35 [1994] 389-394).

Результаты приведены в таблице 1

Все изученные штаммы М. hyopneumoniae оказались высокочувствительными к действию валнемулина, причем значения МИК оказались в 10-40 раз ниже, чем для тиамулина, как при начальной, так и при конечной оценках, что делает соединение особенно интересным с точки зрения применения для лечения клинических случаев в зараженных стадах.

2. Активность in vitro

Образцы ткани получают из легких свиней из стад, пораженных различными энзоотическими пневмониями свиней (ЭПС). Для культивирования образцы перевозят на сухом льду. М. hyopneumoniae получают из свежепрепарированной ткани легкого путем прямого культивирования на агаре типа Mycoplasma Experience. Этот способ позволяет при клонировании отличить и легко отделить характерные колонии М. hyopneumoniae от других более быстро растущих видов микоплазм, таких как Mycoplasma hyorhinis, часто присутствующих в образцах ЭПС-легких. Изоляты субкультивируют и выявляют по зоне задержки роста с использованием диска, применяя специфическую кроличью антисыворотку, индуцированную штаммом М. hyopneumoniae NCTC 10110.

Культуры, предназначенные для оценки антибиотического контрольного заражения, получают из бульона типа Mycoplasma Experience, который инкубируют в аэробных условиях при 36^oС.

Для выделения М. hyopneumoniae из ткани легкого применяют имеющуюся в продаже твердую среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.). Для определений МИК применяют жидкую среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.), содержащую фенол красный и глюкозу (рН 7,6).

Маточные растворы тестируемого соединения готовят в концентрации 1 мг/мл в деионизированной воде, стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм (фирма Sartorius Minisart, N) и хранят при -20^oС. Для применения в опытах по определению МИК маточные растворы разбавляют жидкой средой до концентраций, превышающих в 2 раза требуемые конечные концентрации. Опыты по определению МИК проводят согласно методу Tanner и Wu, Avian Diseases 36 (1992), 714-717. Активно растущие культуры для контрольного заражения получают либо из аликвот объемом 1 мл бульонных культур, хранившихся при -70^oС, либо из культур, хранившихся на агаре при -70^oС. Культуры для контрольного заражения разбавляют, получая нужный титр 10³-10⁵ цветоизменяющих единиц/мл. Аликвоты инокулята для контрольного заражения объемом 0,1 мл смешивают с аликвотами объемом 0,1 мл разведений антибиотика в лунках титрационного микропланшета. Каждый титрационный микропланшет содержит неинокулированную среду с рН 6,8 (Mycoplasma hyopneumoniae) (контроль для конечной точки) и инокулированные, не содержащие антибиотик контроли заражения. Все планшеты запечатывают клейкой лентой и инкубируют в аэробных условиях при 36^oС. МИК определяют, когда изменение цвета в лунках с контрольным заражением соответствует значению рН в контроле для конечной точки. МИК представляет собой наименьшую концентрацию, при которой отсутствует изменение цвета.

В таблице 2 приведены результаты, полученные для валнемулина и двух эталонных соединений тиамулина и энрофлоксацина.

Было установлено, что все штаммы обладают высокой чувствительностью к валнемулину. Большинство штаммов обладает очень высокой чувствительностью к энрофлоксацину, но для отдельных штаммов значение МИК валнемулина оказалось по крайней мере в 5 раз ниже даже по сравнению с теми штаммами, которые чувствительны к концентрации энрофлоксацина в 0,0025 мкг/мл. Эти результаты подтверждают тот факт, что природные изоляты чрезвычайно чувствительны к валнемулину.

3. Развитие устойчивости

Эталонный штамм Mycoplasma hyopneumoniae NCTC 10110 (из Национальной коллекции типовых культур, Лондон, Великобритания) и применяемый в данном исследовании природный изолят (MEVT G23) выращивают в аэробных условиях при 36^oС в глюкозном бульоне для Mycoplasma, который содержит фенол красный, до тех пор пока происходит обусловленное образованием кислоты изменение цвета. После добавления стерильного глицерина (5 об. %) культуры разделяют на аликвоты объемом 1 мл и замораживают при -70^oС. Эти культуры применяют для получения дополнительных бульонных культур, которые титруют, получая после инкубации (36^oС) большое количество цветоизменяющих единиц (ЦИЕ) в титрационных микропланшетах. Репликация позволяет осуществить контрольное заражение с заранее определенными количествами ЦИЕ разведений антибиотиков в опытах по определению минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и в первичном пассаже в опытах по привыканию.

Применяют имеющуюся в продаже среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.), содержащую глюкозу и фенол красный (MEGB) с рН 7,6.

Маточные растворы тестируемого соединения готовят в концентрации 1000 мкг/мл в деионизированной воде. После встряхивания растворы стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм (фирма Sartorius Minisart, N). Для применения в опытах по определению МИК маточные растворы разбавляют бульоном для микоплазм до концентраций, превышающих в 2 раза требуемые конечные концентрации. В опытах по привыканию маточные растворы разделяют на аликвоты объемом 1 мл и замораживают при -20^oС. Их подвергают оттаиванию и применяют с интервалами 5-7 дней для приготовления серий концентраций лекарства (серии с дублированием) в MEGB в виде аликвот объемом 1,9 мл, концентрации которых перекрывают значения МИК для обоих штаммов М. hyopneumoniae. В каждом опыте применяют свежеприготовленный гидрохлорид окситетрациклина. Диапазоны разведений постепенно изменяют от пассажа к пассажу, что обусловливает развитие у микоплазм устойчивости.

Методы тестирования

Опыты по определению МИК согласно методу Tanner и Wu, Avian Diseases 36 (1992), 714-717, проводят до исследования привыкания (см. ниже) и после 10-го пассажа аликвоты объемом 0,1 мл разведений соединения смешивают с аликвотами объемом 0,1 мл инокулята для контрольного заражения, содержащего 10³-10⁵ цветоизменяющих единиц (ЦИЕ) на мл, в лунках титрационного микропланшета. Каждый титрационный микропланшет содержит неинокулированную среду с рН 6,8 (контроль для конечной точки) и инокулированные, не содержащие лекарства контроли заражения. Все планшеты запечатывают и инкубируют в аэробных условиях при 36^oС. МИК определяют, когда изменение цвета в зараженных лунках соответствует значению рН 6,8 в контроле (оранжево-желтый цвет). МИК представляет собой наименьшую концентрацию, при которой отсутствует изменение цвета.

Изучение привыкания (развитие устойчивости)

В эксперименте с использованием первичного пассажа аликвоты объемом 1,9 мл растворов антибиотиков, концентрации которых перекрывают значение МИК для тестируемого штамма М. hyopneumoniae, инокулируют 0,1 мл бульонной культуры, содержащей от 10³ ЦИЕ/мл до 10⁵ ЦИЕ/мл. В качестве контроля роста применяют не содержащий лекарства бульон, инокулированный М. hyopneumoniae, и в эксперимент с использованием каждого пассажа в качестве контроля включают неинокулированную среду. После инкубации в течение 7 дней (36^oС) объединяют две самые высокие концентрации содержащего лекарство бульона, при которых наблюдается обусловленное образованием кислоты изменение цвета, и используют для инокуляции свежих серий разведений лекарства в бульон для микоплазм (0,1 мл культуры вносят в 1,9 мл содержащего лекарство бульона). Этот процесс повторяют каждые 5-7 дней, используя до 10-ти пассажей. Когда штаммы микоплазмы приобретают устойчивость к конкретным антибиотикам или после 10-го пассажа, каждый штамм еще раз пересевают в содержащий лекарство бульон и определяют значения МИК.

Результаты

Значения МИК штамма "J" М. hyopneumoniae и природных изолятов до и после селекции антибиотиками приведены в таблице 3.

Было установлено, что до начала селекции оба штамма были высокочувствительными к валнемулину, а значения МИК составляли 0,0025 мкг/мл для эталонного штамма и 0,001 для природного изолята. Эти уровни активности валнемулина были в 50-100 раз выше по сравнению с активностью тилозина и окситетрациклина. Эти значения МИК использовали при выборе диапазонов разведений лекарств в эксперименте по привыканию.

После 10 циклов селекции валнемулином уровень приобретенной устойчивости оказался минимальным для обоих штаммов М. hyopneumoniae, a значения МИК возросли с 0,0025 мкг/мл до 0,005 мкг/мл и с 0,001 мкг/мл до 0,0025 мкг/мл для эталонного штамма и природного изолята соответственно. В отличие от этого у обоих штаммов М. hyopneumoniae развилась заметная устойчивость к тартрату тилозина. У эталонного штамма устойчивость появилась после 4-5 пассажей в содержащем тилозин бульоне, а к 8 пассажу значение МИК повысилось до >500 мкг/мл, что свидетельствует о более чем 2000-кратном увеличении уровня устойчивости к этому антибиотику (таблица 3). Выраженная устойчивость к тилозину развилась у природного изолята после 8 пассажей, а значение МИК повысилось в 500 раз и составило 62,5 мкг/мл. Этот уровень устойчивости сохранился после 10-11 пассажей в содержащем тилозин бульоне. У обоих штаммов М. hyopneumoniae развился 4-кратный уровень устойчивости к окситетрациклину в течение 10 циклов селекции, а значения МИК повысились с 0,25 мкг/мл до 1 мкг/мл.

Эти результаты свидетельствуют о том, что валнемулин существенно более активен в отношении М. hyopneumoniae по сравнению как с тилозином, так и с окситетрациклином, и, кроме того, он не индуцирует у штаммов М. hyopneumoniae развитие выраженной устойчивости.

4. Предупреждение экспериментально индуцированной энзоотической пневмонии in vivo

Для оценки потенциальной активности валнемулина по предупреждению развития болезни применяют экспериментальную модель энзоотической пневмонии, используя пассированный материал легкого, полученный путем заражения М. hyopneumoniae гнотобиотических свиней. Проводят три серии опытов: в опытах 1 и 2 получают данные по титрованию нового соединения с использованием стандартного контрольного заражения М. hyopneumoniae, а в опыте 3 определяют эффективность соединения в концентрации 200 част./млн в корме в отношении второго контрольного заражения штаммом. Используют особей мужского пола больших белый свиней породы Landrace 6-7 недельного возраста из стада, не зараженного М. hyopneumoniae. Материал для контрольных заражений представляет собой зараженные пневмонией легкие, содержащие М. hyopneumoniae, при этом заражение гомогенатом проводят интраназально в течение трех последовательных дней. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) валнемулина в отношении штамма, присутствующего в материале, который используют в опытах 1 и 2, составляет 0,016 мкг/мл, а для штамма, выделенного из материала, который используют в опыте 3 составляет 0,0078 мкг/мл. Материал для контрольного заражения получают путем заражения М. hyopneumoniae гнотобиотических свиней и последующего пассирования в линии свиней, свободной от особых патогенов (SPF-линии), и хранят при температуре ниже -70^oС.

Опыт 1: Медикаментозное лечение гидрохлоридом валнемулина с помощью желудочного зонда (принудительный откорм) один раз в день в концентрации 0 (контроль), 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/кг веса тела в день. Шесть особей в группе.

Опыт 2: Медикаментозное лечение гидрохлоридом валнемулина в концентрации 0, 100, 200, 300 или 400 част./млн в корме (эквивалентно 0, 5, 10, 15 и 20 мг/кг веса тела/день). Шесть особей в группе.

Опыт 3: Медикаментозное лечение гидрохлоридом валнемулина в концентрации 0 или 200 част. /млн в корме (эквивалентно 0 и 10 мг/кг веса тела/день). Восемь особей в группе. Медикаментозное лечение проводили с первого дня контрольного заражения вплоть до гибели животных, приблизительно через 3 недели после контрольного заражения. Болезнь оценивали количественно по повреждениям легких [Cambridge lung lesion scoring system (Goodwin R.F.W. и Whittlestone P., J. Hyg. [1971] 391-397), в которой балл представляет собой приблизительное значение процента повреждения легкого пневмонией], по оценке соотношения веса легкого/весу тела и путем выделения М. hyopneumoniae из легких.

Результаты приведены в таблице 4.

В опыте 1 зараженные свиньи, которых не подвергали лечению, имели средний балл повреждения легких 13,2. Лечение валнемулином в дозах 7,5 и 10 мг/кг снизило повреждения на 71% и 87% соответственно, в то время как дозы 2,5 и 5 мг/кг/день оказались несколько менее эффективными в отношении уменьшения повреждений. М. hyopneumoniae удалось повторно выделить из меньшего количества свиней, подвергавшихся лечению дозой 10 мг/кг, по сравнению с тем вариантом, когда свиней лечили, используя дозу 2,5 мг/кг (1 особь по сравнению с 4 особями).

В опыте 2 зараженные свиньи, которые не подвергались лечению, имели средний балл повреждения легких 22,1. Лечение валнемулином в концентрациях 200, 300 или 400 част. /млн снизило повреждения на 46%, 43% и 71% соответственно. На вес легких, который может отражать как микроскопические повреждения, так и крупные повреждения, воздействие оказалось более выраженным, причем заметное снижение действия происходило после применения концентрации 200 част. /млн. Не выявлено уменьшение повреждений у свиней, которых лечили концентрацией 100 част./млн. При посмертном обследовании трупов М. hyopneumoniae удалось повторно выделить из всех свиней, которых не подвергали медикаментозному лечению, но возбудитель не был повторно выделен из свиней, которых лечили валнемулином в концентрациях 400 или 300 част./млн. Возбудитель был повторно выделен из 3 и 4 свиней, которых лечили концентрациями 200 или 100 част./млн соответственно.

В опыте 3 свиньи, которые не подвергались лечению, имели средний балл повреждения 10,8, а лечение валнемулином в концентрации 200 част./млн в корме снизило балл повреждения на 79%. Не обнаружено различия в титрах М. hyopneumoniae, обнаруженных при исследовании трупов между животными, которых подвергали и не подвергали медикаментозному лечению.

Таким образом, в различных экспериментах с использованием зараженного материала, содержащего два различных штамма М. hyopneumoniae, подтверждена эффективность валнемулина для предупреждения экспериментально индуцированной энзоотической пневмонии свиней.

Следовательно, агент по изобретению пригоден для терапии энзоотической пневмонии свиней, вызываемой заражением Mycoplasma hyopneumoniae. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретно использованной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия, при этом, например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг веса животного, при этом целесообразно использовать разделенные дозы, которые вводят 2-4 раза в день, или форму с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 100 мг до приблизительно 1000 мг, предпочтительно от приблизительно 100 мг до приблизительно 500 мг, один или два раза в день. Предпочтительно валнемулин может использоваться в виде единственного терапевтического средства.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,01 до 0,05% маc. /об. , в частности от 0,01 до 0,025%, а в корме - от 100 до 400 част./млн (г/метрическую тонну), предпочтительно от 100 до 200 част./млн (г/метрическую тонну).

Б) Заражение Serpulina hyodysenteriae

Заражение Serpulina hyodysenteriae может быть диагностировано общепринятым методом, например, как это описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D.J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 143-144. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Определение МИК

В опыт включено девять природных изолятов, полученных при вспышках дизентерии свиней, и типовой штамм АТСС 31212 и штамм АТСС 29796 (Serpulina innocens, группа 3 (Fellstrom C. Res. Vet. Sci. 59 [1995] 1-4)). Идентификация основана на гемолизе в ТСА (тритиказный соевый агар) с 5% бычьей крови, на пробе на индол и на гидролизе гиппурата (диагностические таблетки типа Rosco Diagnostic Tablets, фирма Taastrup, Дания). Бактерии переносят из агаровых планшетов в 0,9%-ный физиологический раствор и значение бактериальной мути доводят до 1 по шкале Макфарланда до инокуляции агаровых планшетов, содержащих двукратные концентрации гидрохлорида валнемулина, бифумарата тиамулина, диметридазола, гидрохлорида линкомицина и тилозина, по 10 мкл каждого изолята. Рост и гемолиз определяют после культивирования в течение 4 дней в анаэробных условиях и определяют МИК как наименьшую концентрацию антибиотиков, при которой спирохеты не растут.

Результаты определения МИК для S. hyodysenteriae приведены в таблице 5.

Все изученные штаммы S. hyodysenteriae проявили высокую чувствительность к действию валнемулина, причем значения МИК оказались в 2-32 раза ниже, чем для тиамулина. Высокая чувствительность S. hyodysenteriae к валнемулину делает это соединение интересным с точки зрения применения для лечения клинических случаев в зараженных стадах.

2. Определение МИК

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) определяют в отношении 10 штаммов S. hyodysenteriae, выделенных из экскрементов свиней, методом разведений на агаре. Во всех опытах по определению МИК в качестве контролей используют NCTC-штаммы (Национальная коллекция типовых культур) или эталонные штаммы. Агаровая среда для S. hyodysenteriae состоит из ВАВ2 (Unipath CM271), содержит 7% полной дефибринированной стерильной овечьей крови. Все противомикробные агенты тестируют в двукратных разведениях. Приготовленные разведения антибиотиков добавляют в соответствующий объем МН-агара, предварительно охлажденного до 50^oС, смешивают и разделяют на аликвоты объемом 20 мл. Все инкубации S.hyodysenteriae проводят в анаэробной рабочей станции при 37^oС (0,5^oС) (фирма Don Whitley Scientific), которая обеспечивает строгую анаэробную атмосферу, состоящую из 80% азота, 10% водорода и 10% двуокиси углерода. Все другие инкубации проводят при 37^oС. Все штаммы инкубируют в аэробной атмосфере при 37^oС в течение 24 ч. Количество организмов доводят до оптической плотности (ОП), эквивалентной 110⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл, используя в качестве контроля МН-бульон. Содержащие антибиотик планшеты инокулируют с дублированием, используя многоточечный инокулятор (фирма Denley Instruments), который позволяет нанести на каждое пятно всех штаммов приблизительно 1 мкл взятого с планшета инокулята, содержащего 10⁴-10⁵ КОЕ (Amon, J. Antimicrob. Chemother. 21 [1988] 701-710; Ericsson и др., Acta Pathol. Microbiol. et Immunol. Sсnd. 217 [1971] (В) Suppl., 1-90). Контрольные планшеты инкубируют в тех же условиях, что и опытные планшеты. Значения МИК определяют через 24 и 48 ч, и последнее определение является окончательным. МИК определяют как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не наблюдается рост, не учитывая отдельную колонию или легкую муть, вызванную инокулятом, в соответствии с требованиями национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (National Committee for Clinical Laboratory Standarts [1989] , Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLC Publications SCS, Villanova, PA, США).

Значения МИК (в мкг/мл) в отношении Serpulina hyodysenteriae составляют для валнемулина 0,1, для тиамулина 0,3, для линкомицина 50,0, для тилозина 200,0 и для диметридазола 30,0. Все штаммы S. hyodysenteriae обладали чувствительностью к валнемулину, который оказался самым активным из изученных агентов, превосходя остальные по активности в 3-600 раз.

3. Опыт по контрольному заражению

Проведено два опыта, в которых сравнивают эффективность валнемулина и эффективность тиамулина в отношении предупреждения дизентерии свиней при включении в корм в различных концентрациях. Серьезность заболевания оценивают по клиническим симпомам болезни, которые определяют на основе клинических показателей состояния организма, консистенции и состава экскрементов. Также определяют выделение Serpulina hyodysenteriae с экскрементами, повреждения при исследовании трупов, скорость роста и конверсию корма.

В первом опыте результаты, полученные с использованием гидрохлорида валнемулина, включенного в корм в концентрации 20, 30 и 40 част./млн, сравнивают с результатами, полученными для бифумарата тиамулина, включенного в корм в концентрации 30 част./млн, и с необработанными контролями. Для каждой группы, в которой проводят обработку, используют по пять групп из 9 свиней, выращенных в обычных условиях (5-6-недельного возраста). Свиней содержат на корме без лекарства в течение 14 дней, затем проводят контрольное заражение стандартным штаммом S. hyodysenteriae (Р18А). Контрольное заражение проводят оральным путем в течение двух последовательных дней. Корм с включенным в него лекарством дают через день после второго контрольного заражения. Во втором опыте проводят аналогичную процедуру, за исключением того, что используют 4 группы, состоящие приблизительно из 9 свиней каждая. Им скармливают гидрохлорид валнемулина в концентрации 5, 10 и 20 част./млн и сравнивают с необработанными контролями. В этом опыте используют свиней из стада на выгульном содержании и их заражают штаммом S. hyodysenteriae, выделенным из стада на выгульном содержании, для которого ранее показана способность вызывать дизентерию свиней. В обоих опытах клинические данные о состоянии болезни оценивают ежедневно и определяют клинические симптомы, ректальные мазки берут дважды в неделю для выделения S. hyodysenteriae и всех свиней взвешивают через определенные промежутки времени. Также оценивают поглощение корма. Посмертное обследование трупов проводят через 21 день после контрольного заражения и обследуют толстую кишку на наличие повреждений. Также берут соскобы со слизистой оболочки из 4-х областей толстой кишки и культивируют для выявления S. hyodysenteriae.

В первом опыте клинические симптомы дизентерии свиней сначала проявились в контрольной необработанной группе через 8 дней после контрольного заражения, причем было поражено 8 свиней из 9. Клинические симптомы болезни также обнаружены у 1 свиньи в группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 30 част./млн, и у 2 животных из 9 в группе, которую содержали на корме с тиамулином. Симптомы болезни не обнаружены в группах, которые обрабатывали валнемулином в концентрациях 20 и 40 част./млн. В контрольной группе обнаружен средний клинический показатель на особь, равный 36, в то время как для группы, обработанной тиамулином, этот показатель составил 6. Различия между показателями, полученными для всех обработанных и контрольных групп, оказались статистически достоверными (р<0,001). S. hyodysenteriae выделяли из ректальных мазков, взятых у всех свиней в контрольной группе, а также у 2 пораженных свиней из группы, обработанной тиамулином. S. hyodysenteriae также выделяли из 2 свиней, которые получали корм с валнемулином в концентрации 30 част. /млн, что совпадает с клиническими симптомами дизентерии свиней, которые проявились в результате случайного заражения в этой группе. S. hyodysenteriae не были выделены из групп, обработанных 20 и 40 част. /млн. Во всех группах, которые получали корм с лекарством, обнаружены незначительные различия в приросте массы или индексе конверсии корма. Посмертное обследование свиней из контрольной и обработанной тиамулином групп, у которых были обнаружены клинические симптомы болезни, показало присутствие типичных для дизентерии свиней повреждений, состоящих в наличии клейкой слизи и некрозе слизистой поверхности толстой кишки. Повреждения также обнаружены у одной свиньи из группы, обработанной тиамулином, и у свиньи из контрольной группы, причем у обеих ранее не было выявлено клинических симптомов дизентерии свиней. S. hyodysenteriae выделяли из соскобов слизистой, взятых у всех пораженных возбудителем животных. У одной свиньи из группы, содержащейся на корме с концентрацией валнемулина 30 част./млн, также обнаружены повреждения, характерные для дизентерии свиней, но S. hyodysenteriae не были выделены из соскобов слизистой. В группах, которые содержали на корме с концентрациями валнемулина 20 и 40 част./млн, при посмертном обследовании повреждения не обнаружены.

Во втором опыте клинические симптомы дизентерии свиней сначала проявились в контрольной необработанной группе через 5 дней после контрольного заражения, а затем все 9 свиней в группе оказались пораженными болезнью и 6 из них пришлось умертвить вследствие серьезности заболевания. В группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, клинические симптомы дизентерии свиней проявились через 8 дней после контрольного заражения, а затем 5 животных из 10 оказались пораженными болезнью. Однако количество пораженных животных в группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, оказалось достоверно меньшим по сравнению с контролями (р<0,05). Клинические симптомы заболевания не выявлены в группах, которые содержали на корме с концентрацией валнемулина 10 или 20 част. /млн. Средний клинический показатель, равный 11 для группы, обработанной 5 част. /млн валнемулина, оказался существенно более низким по сравнению с показателем, равным 77 для контрольных групп (р<0,005). S. hyodysenteriae выделены из ректальных мазков, взятых в процессе опыта у всех свиней в контрольной группе. Однако из 5 пораженных болезнью животных из группы, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, S. hyodysenteriae выделены только у 2 свиней. Животные, которых содержали на корме с различными концентрациями валнемулина, в конце опыта имели достоверно больший вес (5 част. /млн, р=0,05; 10 и 20 част./млн, р<0,05 соответственно). Посмертное обследование свиней показало наличие типичных для дизентерии свиней повреждений в слизистой оболочке толстой кишки у 3 свиней, оставшихся в живых в контрольной группе. В группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, из 5 свиней, которые вначале имели симптомы болезни, только у 2 обнаружены повреждения при посмертном обследовании, но S. hyodysenteriae не были выделены из этих животных. Однако S. hyodysenteriae выделены из соскобов слизистой, взятых у 2 других животных, которые к моменту обследования имели типичные повреждения, но в то же время не проявляли клинических симптомов болезни. Повреждения не обнаружены у свиней, которые получали корм с концентрациями валнемулина либо 10, либо 20 част./млн, и S. hyodysenteriae не были выделены из этих групп.

Таким образом, валнемулин при включении в концентрации до 10 част./млн эффективен в отношении предупреждения появления клинических симптомов дизентерии свиней, и он снижает количество уничтоженных спирохет в экскрементах и наличие повреждений, выявляемых при посмертном обследовании. При концентрации 30 част./млн у нескольких свиней обнаружены клинические симптомы дизентерии свиней, но это связано со случайным заражением, которое может влиять на поглощение антибиотика. Воздействия конкурентного заболевания на поглощение антибиотика и на заболеваемость дизентерией свиней ранее было описано, например, у Burch D.G.S, Vet. Rec. 110 [1982], 244-246. Анализ данных о приросте массы показал отсутствие различий между обработанными группами, свидетельствуя о том, что антибиотик не влияет на поедаемость корма. Валнемулин в концентрации 5 част./млн не полностью предотвращал клинические симптомы болезни или распространение спирохет, но выявлены достоверные уменьшения клинических показателей и распространения спирохет по сравнению с контролями. В этом опыте тимулин при концентрации в корме 30 част./млн не предупреждал дизентерию свиней, но снижал частоту заболеваемости по сравнению с контрольной группой, а также уменьшал клинические показатели. Однако в этом опыте лечение с использованием включенного в корм валнемулина в концентрации 10 част./млн безусловно оказалось более эффективным по сравнению с лечением тиамулином в концентрации 30 част./млн в отношении предупреждения дизентерии свиней.

4. Дополнительный опыт по контрольному заражению

Группу из 60 свиней, выращенных в обычных условиях (3,5-4-недельного возраста), содержат на корме без лекарства в течение 14 дней, а затем оральным путем проводят контрольное заражение стандартным штаммом S. hyodysenteriae (Р18А). Когда проявляются клинические симптомы болезни, свиней разделяют на 6 групп по 8 свиней в группе, которые подвергают обработке, и содержат на корме с антибиотиком в течение 10 дней, а затем на корме без лекарства в течение еще 14 дней. Результаты, полученные с использованием гидрохлорида валнемулина, включенного в корм в концентрации 50, 75, 100 и 150 част. /млн, сравнивают с результатами, полученными для бифумарата тиамулина, включенного в корм в концентрации 100 част./млн, и с необработанными контролями. В каждую обрабатываемую группу включают свиней с широким диапазоном клинических симптомов болезни. После разделения на обрабатываемые группы клинические симптомы болезни оценивают ежедневно и определяют клинический показатель, ректальные мазки берут дважды в неделю для выделения S. hyodysenteriae и всех свиней взвешивают через определенные промежутки времени. Также оценивают поглощение корма. Посмертное обследование проводят через 24 дня после контрольного заражения и толстую кишку каждой свиньи оценивают на наличие повреждений. Также берут соскобы слизистой из 4-х областей толстой кишки и культивируют с целью выявления S. hyodysenteriae.

После контрольного заражения и до разделения на группы клинические признаки дизентерии свиней были обнаружены через 7 дней после заражения и первые 2 обрабатываемые группы (контрольная и обрабатываемая тиамулином) были сформированы через 8 дней после контрольного заражения. Через 12, 15, 20 и 28 дней после контрольного заражения сформировали следующие другие группы: группы, получающие корм с концентрацией валнемулина 75, 50, 100 и 150 част. /млн. В каждую группу входили свиньи, у которых в экскрементах обнаружена кровь и/или слизь, а также животные, которые имели только слабо выраженные клинические симптомы, например жидкий стул. На 4 день опыта у всех свиней из необработанной контрольной группы обнаружены серьезные симптомы болезни и их умерщвляли. Во время периода лечения в группе, которую содержали на корме с тиамулином, всего 3 животных либо погибли, либо нуждались в эйтаназии (умерщвлении безнадежно больных животных) из-за серьезности симптомов дизентерии свиней. Все свиньи, обработанные валнемулином, остались живыми до конца опыта. В группе, которую содержали на корме с разными концентрациями валнемулина, клинические симптомы болезни быстро исчезли, и клиническое проявление заболевания не было обнаружено к 5 дню опыта. К 8 дню это улучшение также обнаружено у выживших свиней, которых содержали на корме с тиамулином. Средние клинические показатели для групп, обработанных валнемулином, находились в диапазоне от 4 до 10, в то время как средний показатель для группы, обработанной тиамулином, составлял 30. Статистический анализ клинических показателей для 3-10 дней показал, что существует достоверное различие между всеми группами, которых содержали на корме с валнемулином, и группой, обработанной тимулином (р<0,001). Все свиньи, которые получали корм с валнемулином, продолжали прибавлять в весе в течение периода обработки и все имели больший суточный прирост живой массы (СПЖМ) по сравнению с группой, обработанной тиамулином (диапазон 0,4-0,9 по сравнению с 0,1). Индексы конверсии корма (ИКК) были существенно более высокими для группы, обработанной тиамулином (6,4), по сравнению с группами, обработанными валнемулином (диапазон от 1,9 до 2,5), в течение периода лечения. S. hyodysenteriae выделены из большинства свиней в каждой обрабатываемой группе во время разделения. Через 5 дней после разделения S. hyodysenteriae не могли быть обнаружены в ректальных мазках, взятых у свиней из любой обрабатываемой группы.

В период после обработки у одной свиньи в группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 50 част./млн, обнаружены клинические симптомы болезни через 4 дня после прекращения введения лекарства с кормом, а у одной свиньи в группе, которую содержали на корме с тиамулином, также обнаружена дизентерия свиней в последний день опыта. Однако из экскрементов этих свиней S. hyodysenteriae не были выделены. В этот период после обработки незначительное, но заметное выявляемое различие обнаружено в показателях СПЖМ и ИКК между всеми обрабатываемыми группами. При посмертном обследовании в конце опыта повреждения, характерные для дизентерии свиней, не обнаружены ни у одной из свиней, которые получали корм с валнемулином в концентрации 75, 100 или 150 част./млн. В группе, которую содержали на корме с валнемулином в концентрации 50 част. /млн, у одной свиньи обнаружены клинические признаки дизентерии свиней и одновременно еще у одной свиньи в этой группе обнаружено некоторое покраснение толстой кишки. S. hyodysenteriae также выделены из соскобов слизистой у этих 2 свиней и еще у 3 других животных в этой группе, которые не имели повреждений, характерных для дизентерии свиней. У одной свиньи в группе, которую содержали на корме с валнемулином в концентрации 75 част./млн, также были выделены S. hyodysenteriae из соскобов слизистой, хотя у этой свиньи не обнаружено никаких клинических признаков дизентерии свиней.

Таким образом, валнемулин в концентрации 50, 75, 100 и 150 част./млн приводил к уменьшению количества дней, необходимых для устранения клинических симптомов дизентерии свиней, по сравнению с тиамулином. Кроме того, в этих группах, обработанных валнемулином, животные не погибали или не нуждались в эйтаназии. Обнаружено достоверное различие (р<0,001) в клинических симптомах между группами, обработанными валнемулином, и группами, обработанными тиамулином. Выделение S. hyodysenteriae с экскрементами также предотвращалось при использовании всех концентраций валнемулина после прекращения введения лекарства с кормом. Однако S. hyodysenteriae выделены из соскобов слизистых свиней, которые получали валнемулин в концентрациях 50 и 75 част. /млн. Установлено, что при использовании тиамулина в концентрации 35 и 40 част./млн S. hyodysenteriae отсутствуют в экскрементах, но такая обработка не приводит к отсутствию возбудителя в соскобах слизистой (Taylor D.J., Vet. Rec. 106 [1980] 526-528). При использовании тиамулина в концентрации 100 част./млн были получены положительные результаты в экспериментальных условиях (Taylor D.J., Proc. 7th IPVS Congress Mexico [1982] 47) при лечении дизентерии свиней у животных, которые были не столь серьезно поражены, чтобы потерять аппетит. В этом опыте тиамулин в концентрации 100 част./млн уменьшил смертность по сравнению с не подвергавшимися медикаментозному лечению контролями, но в некоторых случаях не предотвратил нескольких случаев гибели, что, вероятно, являлось следствием серьезности болезни, вызванной таким экспериментальным контрольным заражением.

Таким образом, в этом опыте валнемулин при включении в корм в концентрациях 50, 75, 100 и 150 част./млн оказался способен успешно вылечить полученную в экспериментальных условиях дизентерию свиней, причем это лекарство предотвратило падеж и устранило клинические симптомы. Выделение S. hyodysenteriae прекратилось в процессе лечения, причем рецидив после лечения обнаружен только у одного животного, обработанного концентрацией 50 част. /млн. Валнемулин в концентрациях 50 и 75 част./млн не полностью устранил S. hyodysenteriae у всех свиней, но концентрация 100 част./млн оказалась более эффективной.

Следовательно, агент по изобретению является пригодным для терапии дизентерии свиней, вызванной заражением Serpulina hyodysenteriae. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия, при этом, например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг веса животного, причем целесообразно использовать разделенные дозы, которые вводят 2-4 раза в день или дают ad libitum в корме либо воде, или форму с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 400 мг, например от приблизительно 10 мг до приблизительно 200 мг для предупреждения болезни или от приблизительно 20 мг до приблизительно 400 мг для лечения, и ее дают в корме или воде ad libitum один или два раза в день.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,001 до 0,05% мас. /об. , в частности от 0,001 до 0,005%, а в корме от 20 до 100 г/метрическую тонну, предпочтительно от 20 до 75 г/метрическую тонну.

В) Колит свиней, вызванный заражением Serpulina pilosicoli

Колит может быть диагностирован общепринятым методом, например, как описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D.J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 148-149. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Определение МИК

В опыт включено девять природных изолятов WBHS, полученных при вспышках дизентерии свиней из стад с диареей и без диареи, и штамм АТСС 29796 (Serpulina innocens, группа 3 (Fellstrom C. Res. Vet. Sci. 59 [1995] 1-4)). Идентификация основана на гемолизе в ТСА (тритиказный соевый агар) с 5% бычьей крови, на пробе на индол и на гидролизе гиппурата (диагностические таблетки типа Rosco Diagnostic Tablets, фирма Taastrup, Дания). Из девяти штаммов спирохет, дающих слабый бета-гемолиз, один относился к группе 2, четыре к группе 3 и пять к группе 4 (Fellstrom, см. выше). Бактерии переносят из агаровых планшетов в 0,9%-ный физиологический раствор и значение бактериальной мути доводят до 1 по шкале МакФарланда до инокуляции агаровых планшетов, содержащих двукратные концентрации следующих противомикробных препаратов: гидрохлорида валнемулина, бифумарата тиамулина, диметридазола, гидрохлорида линкомицина и тилозина, по 10 мкл каждого изолята. Рост и гемолиз определяют после культивирования в течение 4 дней в анаэробных условиях и определяют МИК как наименьшую концентрацию антибиотиков, при которой спирохеты не растут.

Результаты определения МИК для WBHS приведены в таблице 6. В целом все штаммы WBHS оказались чувствительными ко всем пяти противомикробным препаратам. Между тремя группами WBHS не обнаружено различия в чувствительности к любому из изученных противомикробных препаратов. Полученные значения МИК для валнемулина являются самыми низкими для 9 из 10 штаммов, при этом они существенно выше для подавляющего большинства штаммов по сравнению со всеми 4 эталонными соединениями.

Высокая чувствительность к валнемулину и WBHS делает его интересным с точки зрения применения для лечения клинических случаев в зараженных стадах.

Таким образом, агент по изобретению является пригодным для терапии колита свиней, вызванного заражением Serpulina pilosicoli. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия, при этом, например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг веса животного, причем целесообразно использовать разделенные дозы, которые вводят 2-4 раза в день или которые животные получают ad libitum в корме либо в воде, или в виде формы с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 400 мг, например от приблизительно 10 мг до приблизительно 200 мг для предупреждения болезни или от приблизительно 20 мг до приблизительно 400 мг для лечения, и ее дают в корме или воде ad libitum или один или два раза в день.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,001 до 0,05% маc. /об. , в частности от 0,001 до 0,005%, а в корме от 20 до 100 г/метрическую тонну, предпочтительно от 20 до 75 г/метрическую тонну.

Г) Илеит свиней, вызванный заражением Lawsonia intracellularis

Заражение Lawsonia intracellularis может быть диагностировано общепринятым методом, например, как описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor d.j. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, на стр. 154-157. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Активность in vitro

В целом исследование проводили согласно методу Lawson G.H.K. и др., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142, с некоторыми модификациями (стандартные методы Kirby-Bauer, основанные на использовании диска, не применимы для внутриклеточных бактерий).

Клетки: Монослои клеточных культур энтероцитов крысы IEC-18 (АТСС CRL 1589) получают и поддерживают с помощью стандартных методов культуры клеток. Для заражения в день 0 на стеклянных покровных стеклах в небольших культуральных флаконах (типа Tracs) получают однодневные монослои делящихся клеток (приблизительно 30%-ная конфлюэнция).

Инокулят: В качестве инокулята готовят группы из трех штаммов Lawsonia intracellularis. Их получают из кишечника свиней, страдающих такими формами пролиферативной энтеропатии, как пролиферативная геморрагическая энтеропатия (ПГЭ) и кишечный адемонатоз свиней (КАС), и переносят в культуры клеток, как описано в указанной выше работе Lawson. Два ПГЭ-штамма частично тестируют в отношении патогенности для свиней согласно методу McOrist S. и др., Infect. Immun. 61, (1993) 4286-4292. Группы инокулятов собирают после нескольких пассажей клеток и хранят в замороженном виде при -70^oС в пробирках объемом 1 мл. В предварительных опытах определяют соответствующие разведения содержимого оттаявших пробирок, которые должны дать в результате различимые заражения клеток на 5-й день опытов.

Антибиотики для каждого опыта готовят в виде маточных растворов 100-кратной крепости. Активность антибиотиков в каждой партии определяют стандартными методами Kirby-Bauer, основанными на использовании диска, с помощью лабораторного штамма Escherichia coli.

Заражения: Для использования в четырех группах (1-4) в день 0 пробирку с каждым штаммом подвергают оттаиванию, разбавляют культуральной средой в соотношении от 1/8 до 1/32.

Для группы 4 (группа непрерывной обработки) перед добавлением к клеткам этот инокулят инкубируют в течение одного часа при 37^oС в культуральной среде, содержащей различные концентрации антибиотика.

Для группы 3 (внеклеточная активность) этот инокулят готовят в культуральной среде, содержащей антибиотик в различных концентрациях, добавленный непосредственно перед добавлением клеток.

Для групп 1 (контроль) и 2 (внутриклеточная активность) инокулят готовят в культуральной среде без антибиотиков и добавляют к клеткам. Культуральные флаконы (типа Tracs) с клетками, к которым добавлен инокулят (антибиотики) в полном объеме среды 0,5 мл, помещают в стальные сосуды, откачивают воздух до 40% атмосферы (8% O₂), выдерживают 2 мин, повторно накачивают водород и в конце добавляют 10% СО₂. Флаконы типа Tracs затем удаляют из этих сосудов и помещают в термостат с влажной атмосферой, содержащей 8% О₂, 8,8% CO₂, остальное - азот, и выдерживают при 37^o С.

На день 1 и 2 все флаконы удаляют и повторно заполняют свежей средой, либо содержащей антибиотики, группы 2 и 4, либо не содержащей антибиотики, группы 1 и 3, и вновь помещают в термостат. На день 5 все покровные стекла удаляют и окрашивают для внутриклеточного определения Lawsonia непрямым иммунопероксидазным красителем, включающим специфическое моноклональное антитело. В качестве усредненной величины заражения используют количество клеток на каждом покровном стекле, сильно зараженных внутриклеточными Lawsonia (>30 на клетку, сильно зараженные клетки, СЗК). Также определяют количество очагов СЗК и общее количество клеток. Количество СЗК в контроле (группа 1), в опыте по определению внутриклеточной активности антибиотика (группа 2), в опыте по определению внеклеточной активности антибиотика (группа 3) и в опыте по определению активности при непрерывной обработке (группа 4) сравнивают в трехкратной повторности, используя каждый раз до 3 штаммов. Некоторые опыты повторяют с различными титрами инокулята. Процентные соотношения рассчитывают путем деления на среднее значение СЗК в контролях, соответствующих тестируемой группе. Среднее значение СЗК в контроле представляет собой общее количество СЗК в контрольных флаконах Tracs, деленное на количество зараженных контрольных Tracs. Процентное соотношение тестируемых Tracs затем рассчитывают путем деления их значения СЗК на среднее значение СЗК в контроле и умножения на 100, получая при этом требуемое значение в процентах. При этом опытные Tracs, в которых антибиотики неактивны, должны иметь процентное соотношение, близкое к 100, а для тех, в которых антибиотики полностью ингибируют рост, соотношение должно быть равно 0.

Результаты, полученные с использованием гидрохлорида валнемулина, представлены в таблице 7, в которой приведен процент клеток, оставшихся незараженными после обработки.

Эти результаты показывают, что минимальная концентрация гидрохлорида валнемулина, вызывающая значительное ингибирование роста Lawsonia intracellularis (рост <1%), составляет <2 мкг/мл.

2. Опыты по контрольному заражению

В один и тот же день проводят контрольное заражение тридцати пяти поросят-отъемышей вирулентным инокулятом Lawsonia intracellularis (штамм LR189/5/83), изолятом агента, вызывающим пролиферативную энтеропатию свиней, полученным путем культивирования в линии клеток энтероцитов крысы IEC-18 (АТСС CRL 1589) согласно методу, описанному Lawson и др., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142. Семь контрольных свиней обрабатывают буферным раствором. Семь из 21 зараженного животного оставляют без обработки. Через три недели после контрольного заражения эти семь свиней имели пониженные приросты массы, и у всех развились повреждения, характерные для пролиферативной энтеропатии, выявленные на срезах кишечника, полученные при вскрытии трупов. Через 2 недели после контрольного заражения у шести из этих 7 свиней обнаружены хорошо заметные повреждения, у трех обнаружена диарея от слабой до средней тяжести. С целью тестирования стратегии "превентивной" обработки двум другим группам зараженных свиней вводили оральным путем гидрохлорид валнемулина в концентрациях 25 част./млн и 75 част./млн соответственно (т.е. 1,25 мг/кг и 3,7 мг/кг) в виде премикса, который давали за 2 дня до контрольного заражения и продолжали лечение до эйтаназии. С целью тестирования "лечебной" стратегии двум другим группам зараженных свиней оральным путем вводили валнемулин в концентрациях 25 част./млн и 75 част./млн соответственно в виде премикса, который давали в течение 7 дня после контрольного заражения и продолжали лечение до эйтаназии.

Никаких повреждений, характерных для пролиферативной энтеропатии, в срезах кишечника, взятых при вскрытии трупов, не обнаружено у 3 из 7 свиней в группе, которую подвергали превентивной обработке, и у 5 из 7 свиней в группе, которую подвергали лечебной обработке. Контрольные свиньи сохранили нормальные характеристики. Таким образом, валнемулин обладал способностью предупреждать или лечить болезнь у большой части зараженных свиней даже в случае применения указанных низких доз лекарственного средства.

Таким образом, агент по изобретению является пригодным для терапии илеита свиней, вызванного заражением Lawsonia intracellularis. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия, при этом, например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 6,5 мг/кг веса животного, которую животные получают ad libitum в воде или в корме, или в виде разделенных доз, которые вводят 2-4 раза в день, или в виде формы с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 1000 мг, предпочтительно от приблизительно 15 мг до приблизительно 500 мг, которую дают один или два раза в день.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,001 до 0,05% мас. /об. , в частности от 0,001 до 0,005%, а в корме от 20 до 400 г/метрическую тонну, предпочтительно от 20 до 200 г/метрическую тонну.

Д) Хроническое респираторное заболевание и артрит домашней птицы, вызванные Mycoplasma gallisepticum

Заражение может быть диагностировано общепринятым методом, например, для заражения Mycoplasma gallisepticum можно использовать руководства по ветеринарии, такие как Diseases of Poultry, 8-е изд. (1984), ред. Hofstad и др., Iowa State University Press, стр. 196-198. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Активность in vitro: МИК

Противомикробное действие гидрохлорида валнемулина определяют с помощью метода стандартных серийных микроразведений в сравнении с тилозином (раствор тилана) и бифумаратом тиамулина.

12,8 мг тестируемого соединения растворяют в 100 мл дистиллированной воды, получая маточный раствор, который хранят при -20^oС до применения. В качестве эталонных штаммов Mycoplasma gallisepticum используют Х96, S6 Holland, S6 Bench (Великобритания), MS-16 (Япония), МК-7 (Япония) и 1226, а также используют различные свежеполученные природные изоляты.

Чувствительность штаммов к антибиотикам оценивают с помощью модифицированного метода микроразведений бульона (Stipkovits и др., Vet. Microbiol. 15 [1987] 65-70). Тестируемую среду (100 мкл) добавляют во все лунки титрационного микропланшета, используя двукратные разведения антибиотиков. Инокулят (100 мкл) содержит 10⁵ КОЕ/мл. Планшеты запечатывают с помощью прозрачной клейкой ленты и инкубируют при 37^oС в течение 3 дней. Самая низкая концентрация антибиотика, при которой полностью прекращается изменение цвета среды при анализе на третий день, представляет собой минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Лунки, в которых не произошло изменение цвета, анализируют на жизнеспособность микоплазм путем их последующего переноса на агар. Все штаммы Mycoplasma размножают в 10 мл среды В (Егпо Н. и Stipkovits L., Acta Vet. Scand. 14 [1973] 436-449). После инкубации при 37^oС до достижения ранней логарифмической фазы роста аликвоты объемом 1 мл культуры помещают в пробирки в качестве культур для посева и хранят при -20^oС. Ферментирующие глюкозу штаммы Mycoplasma выявляют в модифицированной среде Bg, дополненной 1% глюкозы (рН 7,8), штаммы, гидролизующие аргинин, выявляют в среде Ва (Erno H. и Stipkovits L., выше, 450-463), содержащей 1% аргинина (рН 7,3), а глокозо- и аргинин-негативные штаммы выявляют в среде В, включающей 1% трифенилтетраз олийхлорид.

Рассчитывают средние значения МИК для различных групп штаммов и антибиотиков с учетом их разведений.

Значения МИК эталонных штаммов приведены в таблице 8, а изолятов Mycoplasma представлены в таблице 9.

Результаты, полученные с эталонными штаммами микоплазмы, свидетельствуют о том, что три соединения обладают более или менее одинаковым спектром активности. Однако значение МИК природных изолятов, полученных из птиц, свидетельствуют о заметном различии между тестируемыми соединениями: в то время как изоляты обладает одинаково высокой чувствительностью к валнемулину (0,03-0,06 мкг/мл), их чувствительность к тиамулину является несколько более низкой (0,06-1 мкг/мл), а в отношении тилозина штаммы даже проявляют устойчивость (0,06-32 мкг/мл).

2. Опыты по контрольному заражению

2.1. Предупреждение

Группы петушков бройлерных цыплят заражают вирулентным штаммом Mycoplasma gallisepticum (MG) и каждую группу соответственно подвергают медикаментозному лечению с использованием одного из следующих препаратов: валнемулин (концентрации 0,00312, 0,00625, 0,0125 и 0,025%), тиамулин (0,00625, 0,0125 и 0,025%) и тилозин (0,05%). Заражение проводят на день 2 путем инъекции в каждое легкое 0,1 мл культуры Mycoplasma gallisepticum, содержащей приблизительно 10⁶ КОЕ жизнеспособных организмов (Jordan F.T.W., The Veterinary Record 127 [1990] 502), и медикаментозное лечение начинают приблизительно через 1 ч после заражения и продолжают в течение 3 последовательных дней. В опыте также используют зараженную необработанную группу и незараженную группу.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предупреждение клинических симптомов и смертности оказались достаточно близкими для групп, которых лечили с использованием двух наиболее высоких доз валнемулина (0,0125 и 0,025%), трех доз тиамулина и с использованием указанной концентрации тилозина. У нескольких цыплят обнаружены повреждения, которые оказались менее серьезными при использовании (в порядке убывания) тилозина, далее тиамулина, а затем с использованием двух наиболее высоких доз валнемулина (0,0125 и 0,025%). В этом плане 2 более низкие дозы валнемулина оказались менее эффективными. Наиболее высокий прирост массы обнаружен для групп, подвергавшихся лечению с помощью тилозина; следующий по величине, но достоверно более низкий (р<0,05) прирост массы обнаружен в группе незараженных птиц, которых лечили тиамулином и которых лечили с использованием всех, кроме самой низкой дозы валнемулина. Самые низкие приросты массы получены для групп, которые лечили с использованием самой низкой дозы валнемулина, и для зараженной группы, которую не подвергали лечению, однако различия между ними оказались недостоверными. MG не были выделены при жизни или после вскрытия трупов из незараженной группы, а именно из цыплят, которые получали наиболее высокую дозу тиамулина, и которых лечили тилозином, и были выделены только из одной птицы из группы, которую лечили наиболее высокой дозой валнемулина. Большая часть MG была выделена из всех других зараженных групп. Результаты серологического исследования не полностью отражали данные, полученные с использованием тилозина, поскольку в этой группе обнаружен относительно высокий процент позитивных реакций.

Таким образом, установлено, что две наиболее высокие дозы валнемулина обладают эффективностью на уровне эталонных соединений в отношении предупреждения заражения Mycoplasma gallisepticum у молодых цыплят.

2.2. Лечение

Группы петушков бройлерных цыплят заражают вирулентным штаммом Mycoplasma gallisepticum (MG) и каждую группу подвергают соответственно медикаментозному лечению с использованием валнемулина в концентрации 0,0125%, 0,025% и 0,05%, тиамулина в таких же концентрациях, тилозина в концентрации 0,05% и линкоспектина, комбинация на основе спектиномицина (Linco-Spectin), в концентрации 0,083%. В опыте также оставляют одну зараженную группу необработанной и также используют незараженную группу. Цыплят заражают в возрасте 2 дней путем инъекции 3,4х10⁵ микроорганизмов в каждое легкое. Введение лекарств с питьевой водой начинают через 24 ч и продолжают в течение 3 последовательных дней за исключением варианта с Linco-Spectin, лечение с помощью которого продолжают в течение 5 дней.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что контроль смертности до уровня, не превышающего 5%, оказался наиболее хорошим при использовании всех 3 концентраций валнемулина и при использовании тиамулина в концентрации 0,05%. Повреждения не обнаружены у цыплят, которых лечили с использованием самой высокой и самой низкой дозы валнемулина, и только незначительные повреждения выявлены при использовании тиамулина и тилозина. Приросты массы в группах, которые лечили с использованием всех концентраций валнемулина, оказались выше по сравнению с приростами в группах, которые обрабатывали тиамулином, и одинаковыми с таковыми для группы, которую лечили тилозином. Микоплазмы не были выделены после окончания эксперимента на 23-й день из трех групп птиц, которых лечили валнемулном и которым давали тилозин. В то же время результаты серологического исследования показали наличие некоторых позитивных реакций во всех группах зараженных птиц.

С учетом данных о смертности, приросте массы, выделении MG и результатов тестов по агглютинации сыворотки две наиболее высокие дозы (0,025% и 0,05%) валнемулина, вводимые с водой для питья, дают столь же хорошие или даже лучшие результаты по сравнению с тиамулином в дозе 0,05% или тилозином в дозе 0,05% и существенно более хорошие по сравнению с Linco-Spectin.

Таким образом, агент по изобретению является пригодным для терапии хронического респираторного заболевания и артрита домашней птицы, вызванного заражением Mycoplasma gallisepticum. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия, при этом, например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в воде для питья в дозах от приблизительно 0,005 до приблизительно 0,05% мас. /об. , предпочтительно 0,01-0,03%, а в корме от 20 до 400 г/метрическую тонну, предпочтительно от 20 до 200 г/метрическую тонну.

Е) Вторичная инфекция, вызванная заражением Pasteurella multocida. Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis

Вторичная инфекция, вызванная заражением Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis, может быть диагностирована общепринятым методом, например, как описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D.J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 185-187, 188-194 и 194-197. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют, например, следующим образом.

Определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) гидрохлорида валнемулина в отношении полученных в настоящее время изолятов Pasteurella multocida, Haemophilus pleuropneumoniae и Haemophilus parasuis, выделенных из материала дыхательных путей свиней, и сравнивают с тиамулином. Используют культуры бактериальных изолятов, включающие 10 изолятов Р. multocida, 10 изолятов Н. pleuropneumoniae и 3 изолята Н. parasuis, выделенные в течение последних 5 лет из больных свиней при посмертных обследованиях. Три изолята Pasteurella представляли собой токсигенные штаммы Pasteurella multocida. Для Н. pleuropneumoniae и Н. parasuis за 1 день до тестирования одну петлю каждой культуры используют для инокуляции 10 мл бульона Todd и Hewitt (Unipath CM190), содержащего 1% донорской телячьей сыворотки и 2 мг/мл никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Для Р. multocida в день тестирования одну петлю каждой культуры используют для инокуляции 10 мл питательного бульона 2 (Unipath CM67), содержащего 1% донорской телячьей сыворотки. Каждую из приготовленных бульонных культур инкубируют в течение 18 ч при 37^oС в атмосфере 10% СО₂. После инкубации и в день тестирования концентрацию в препарате 23 бульонных культур доводят до 10⁵-10⁶ микроорганизмов/мл в стерильном физиологическом растворе в препарате для инокуляции культуральной среды для определения МИК. Для каждого тестируемого соединения также применяют стандартные контрольные культуры Oxford Staphylococcus aureus NCTT 6571 с целью подтверждения результатов тестов по определению МИК. В каждом случае бульонные культуры, полученные из контрольных организмов, идентичны культурам организмов, применяемых в опыте. Валнемулин используют в форме гидрохлорида, а тиамулин применяют в форме бифумарата. В дни опытов готовят маточные растворы в дистиллированной воде тестируемых соединений, содержащие 3,2 мг/мл действующего вещества. Затем дополнительно готовят девять двукратных разведений в стерильной дистиллированной воде, получая диапазон концентраций каждого антибиотика от 320 мкг до 1,25 мкг/мл, которые предназначены для включения в среду для определения МИК. Сенсибилизированный агар (Oxoid CM409), содержащий лизированную лошадиную кровь (Oxoid SR50), готовят согласно рекомендациям производителя и при необходимости доводят значение рН до 7,4. Для всех групп МИК-среды, изготовленной для опытов по определению значений МИК в отношении двух видов Haemophilus, с целью введения необходимого фактора роста добавляют 2 мг/мл НАД. 18 мл расплавленного агара (50^oС) смешивают с 2 мл (разведение 1/10) каждого из приготовленных разведений тестируемого соединения в чашках Петри диаметром 90 мм. Каждое разведение распределяют на 4 чашки для получения четырех повторностей. Для каждого опыта по определению МИК также в 4 повторностях готовят чашки, которые содержат 18 мл агара и 2 мл стерильной дистиллированной воды, которые выступают в качестве индикаторов роста.

Высушенные чашки для определения МИК инокулируют 0,2 мкл полученных тестируемых организмов, в случае Р. multocida инкубируют в нормальной атмосфере при 37^oС в течение 18 ч, а в случае Н. pleuropneumoniae и Н. parasuis инкубируют при 37^oС в течение 18 ч в атмосфере 10% СО₂. После инокуляции рост организмов оценивают сначала визуально, а затем проводят микроскопическое обследование с помощью стереомикроскопа с переменным фокусным расстоянием. Значение МИК определяют как наименьшую концентрацию тестируемого соединения, при которой при микроскопическом обследовании рост не может быть обнаружен в месте инокуляции на всех 4 чашках.

Полученные результаты представлены в таблице 10.

Из полученных данных следует, что активность валнемулина в среднем в 2,5 раза выше активности тиамулина в отношении Р. multocida, в 5,5 раз выше в отношении Н. pleuropneumoniae и в 3 раза выше в отношении Н. parasuis.

Таким образом, агент по изобретению является пригодным для терапии вторичной пневмонии свиней, вызванной заражением Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия; например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг веса животного, которую целесообразно вводить ad libitum в воде или в корме, или в виде разделенных доз, которые вводят 2-4 раза в день, или в виде формы с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 100 мг до приблизительно 1000 мг, предпочтительно от приблизительно 100 мг до приблизительно 500 мг, и ее дают один или два раза в день.

Может оказаться предпочтительным использовать его в качестве единственного терапевтического агента.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,01 до 0,05% мас. /об. , в частности от 0,01 до 0,025%, а в корме от 100 до 400 част./млн (г/метрическую тонну), предпочтительно от 100 до 200 част./млн.

Ж) Пневмония ягнят, овец и крупного рогатого скота, вызванная заражением Pasteurella haemolytica

Заражение Pasteurella haemolytica может быть диагностировано общепринятым методом, например, как описано в руководствах по ветеринарии, таких как Veterinary Medicine, 8-е изд. (1994), под ред. Radostits O.M., Blood D. C. и Gay С.С., Publ. Bailliere Tindall, London, Великобритания, стр. 748-770. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют in vivo, например, следующим образом.

Клиническую эффективность двух композиций гидрохлорида валнемулина при лечение пневмонии телят, полученной в результате контролируемого заражения Pasteurella haemolytica A1, определяют следующим образом.

За 6 дней до обработки (день -6) 24 теленка, у которых брали назальные мазки и у которых обнаружено отсутствие Р. haemolytica A1, взвешивают и разделяют на 4 группы с различным режимом обработки по 6 особей в группе, сбалансированных по живому весу, а также по распределению полов в каждой группе. Телят содержат в индивидуальных загонах в обычных боксах для выращивания молодняка, где они акклиматизируются в течение 33 дней до разделения на группы. На стадии до опыта дважды берут образцы крови для анализа антитела к лейкотоксину, что является возможным индикатором на присутствие Р. haemolytica A1 до начала обработки.

Лечение начинают в день -1, приблизительно за 27 ч до времени контрольного заражения:

группа 1 - контроль,

группа 2 - лечение 2,5% инъецируемым раствором гидрохлорида валнемулина (2,5 мг/кг дважды в день),

группа 3 - лечение 10%-ным премиксом гидрохлорида валнемулина, оральным путем через заменитель цельного молока для телят (5,0 мг/кг дважды в день).

Всех телят заражают в день 0 путем эндобронхиального нанесения 30 мл бульонной культуры Pasteurella haemolytica Al (M4/1/3, Moredun Research Institute, 1,25l0⁷ КОЕ/мл) с помощью оптоволоконного бронхоскопа. Клинические обследования проводят один раз в день в дни -3 и -2 и дважды в день со дня -1 по день 3. Клинические показатели определяют для каждого из 4 параметров: ректальная температура, частота дыхания, природа дыхания и поведение. Также обследуют места инъекций. Любых лежачих телят и/или телят, которые находятся в состоянии депрессии, и/или телят, у которых обнаружен респираторный дистресс, или телят, которые имеют общий клинический показатель выше 5 при одном из обследований в дни 0-3, немедленно подвергают гуманной эйтаназии путем внутривенного введения летальной дозы фенобарбитона натрия ВР (Vet) 20% мас./об. и через 24 ч производят вскрытие трупа. Телят, которые выжили в течение 4 дней после контрольного заражения Р. haemolytica, подвергают эйтаназии на 4 день, применяя такую же процедуру, как и для эйтаназии, которую проводят в дни 0-3. У всех телят удаляют легкие и визуально обследуют в отношении общих повреждений и плевральных сращений. Образцы ткани легкого вырезают из 8 стандартных участков и тестируют в отношении присутствия Р. haemolytica для определения значения индекса выделения. У телят, которые внезапно погибают, берут мазки сердечной крови и тестируют на присутствие Р. haemolytica.

Все следующие параметры рассчитывают для отдельного теленка и группы в целом, определяют средние значения для группы и медианы для группы: общий клинический показатель, общий балл повреждения, индекс выделения, балл плеврита и общий балл. Все параметры рассчитывают для отдельного теленка и группы в целом, определяют средние значения для группы и медианы для группы для всех категорий, определяющих общий клинический показатель: ректальная температура, частота дыхания, природа дыхания и поведение. Основной анализ с помощью теста Kruskal-Wallis (Minitab 9) применяют для определения того, имеются ли различия между показателями в любой группе для каждого из параметров: общий клинический показатель, общий балл повреждения, индекс выделения, балл плеврита и общий балл. Результаты теста Kruskal-Wallis показывают, что группы не являются полностью одинаковыми, но они и не являются полностью различными. С целью определить, какие группы являются различными, пары групп тестируют, используя тест Mann-Whitney (Minitab 9).

Установлено, что по сравнению с необработанными телятами (группа 1) общие клинические показатели (р=0,013) оказались достоверно более низкими для телят, которых лечили, вводя 10% премикса валнемулина из расчета 5,0 мг/кг/дозу дважды в день орально с помощью заменителя цельного молока для телят в течение 5 дней, начиная лечение за 27 ч до контрольного заражения Р. haemolytica A1.

Общие клинические показатели также оказались пониженными, но различие не было статистически достоверным для телят, которых обрабатывали внутримышечно 2,5%-ным инъецируемым раствором валнемулина из расчета 2,5 мг/кг/дозу дважды в день в течение 5 дней, начиная лечение за 27 ч до контрольного заражения Р. haemolytica A1.

При сравнении общих клинических показателей не обнаружено достоверных различий между группами, которые подвергали лечению.

Таким образом, агент по изобретению является пригодным для терапии пневмонии ягнят, овец и крупного рогатого скота, вызванной заражением Pasteurella haemolytica. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия; например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг веса животного, которую целесообразно давать ad libitum в корме, или в виде разделенных доз, которые вводят 2-4 раза в день, или в виде формы с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 250 мг до приблизительно 3000 мг, предпочтительно от приблизительно 250 мг до приблизительно 1000 мг, и ее дают один или два раза в день или вводят ad libitum в корме.

3) Полиартрит у свиней, вызванный заражением Mycoplasma hyosynoviae

Заражение Mycoplasma hyosynoviae может быть диагностировано общепринятым методом, например, как описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D. J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 172-173. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют, например, следующим образом.

1. Активность в тканевых изолятах in vitro (определение МИК)

Образцы ткани получают из легких свиней из различных стад пораженных энзоотической пневмонией свиней (ЭПП). Образцы перевозят на сухом льду для культивирования. Четыре изолята из образцов легких, первоначально выделенных для получения Mycoplasma hyopneumoniae, повторно анализировали на присутствие Mycoplasma hyosynoviae после того, как в представленных для рассмотрения образцах легких (повторно замороженных и хранящихся при -70^o) было обнаружено, что в процессе культивирования М. hyopneumoniae некоторые образцы дают пышный рост колоний, имеющих типичные морфологические признаки Mycoplasma hyosynoviae. Из других представленных образцов легких выделено 3 дополнительных изолята. Все изоляты выявляли серологически по зоне задержки роста с использованием диска со специфичной кроличьей антисывороткой, индуцированной в ответ на иммунизацию Mycoplasma hyosynoviae. Для выделения М. hyosynoviae из ткани легкого используют имеющуюся в продаже твердую среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.). Для определения МИК используют жидкую среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.), содержащую фенол красный и аргинин (рН 7,0).

Маточные растворы тестируемого соединения готовят в концентрации 1 мг/мл в деионизированной воде, стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм (фирма Sartorius Minisart, N) и хранят при -20^oС. Для применения в опытах по определению МИК маточные растворы разбавляют жидкой средой до концентраций, превышающих в 2 раза требуемые конечные концентрации. Опыты по определению МИК проводят согласно методу Tanner и Wu, Avian Diseases 36 (1992) 714-717. Активно растущие культуры для контрольного заражения получают либо из аликвот объемом 1 мл бульонных культур, хранившихся при -70^oС, либо из культур, хранившихся на агаре при -70^oС. Культуры для контрольного заражения разбавляют, получая нужный титр 10³-10⁵ цветоизменяющих единиц/мл. Аликвоты объемом 0,1 мл инокулята для контрольного заражения смешивают с аликвотами объемом 0,1 мл разведения антибиотика в лунках титрационного микропланшета. Каждый титрационный микропланшет содержит неинокулированную среду с рН 7,6 (контроль для конечной точки) и инокулированные, не содержащие антибиотика контрольные заражения. Все планшеты запечатывают клейкой лентой и инкубируют в аэробных условиях при 36^oС. МИК определяют, когда изменение цвета в лунках контрольного заражения соответствует значению рН в контроле для конечной точки. МИК представляет собой наименьшую концентрацию, при которой отсутствует изменение цвета.

Полученные результаты приведены в таблице 11 для гидрохлорида валнемулина и двух соединений-эталонов, бифумарата тиамулина и энрофлоксацина.

Чувствительность семи природных изолятов Mycoplasma hyosynoviae к валнемулину существенно выше, чем к двум другим соединениям, свидетельствуя о том, что современные природные изоляты обладают исключительно высокой чувствительностью к валнемулину.

Таким образом, агент по изобретению является пригодным для терапии полиартрита свиней, вызванного заражением Mycoplasma hyosynoviae. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретной примененной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия; например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг веса животного, которую целесообразно давать ad libitum в воде или в корме, или в виде разделенных доз, которые вводят 2-4 раза в день, или в виде формы с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 100 мг до приблизительно 1000 мг, предпочтительно от приблизительно 100 мг до приблизительно 500 мг, и ее дают один или два раза в день.

Может оказаться предпочтительным использовать его в качестве единственного терапевтического агента.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,01 до 0,05% мас. /об. , в частности от 0,01 до 0,025%, а в корме от 100 до 400 част./млн (г/метрическую тонну), предпочтительно от 100 до 200 част./млн (г/метрическую тонну).

Для всех указанных целей соединение может применяться в форме свободного основания и в форме приемлемой для ветеринарии соли, например четвертичной соли, или особенно предпочтительно в форме кислотно-аддитивной соли. Эти формы соли обладают таким же уровнем активности, что и форма свободного основания. Примерами приемлемых кислотно-аддитивных солей являются бифумарат, фумарат, нафталин-1,5-сульфонат и прежде всего гидрохлорид.

Агент по изобретению может вводиться орально, местно или парентерально и в смеси с общепринятыми хемотерапевтическими приемлемыми разбавителями и носителями и необязательно с другими эксципиентами и может вводиться в виде таких форм, как таблетки, капсулы или инъецируемые препараты. Он также может представлять собой прекрасную добавку для кормовых смесей (в виде премикса) или для воды для питья.

Предпочтительные приемлемые для ветеринарии носители включают, например, обычно применяемые фармацевтические эксципиенты, такие как сахар, кукурузный крахмал, лактоза, целлюлоза, а также системы носителей на основе зерна и побочных продуктов переработки зерен типа размолотой рисовой шелухи, пшеничных отрубей и соевой муки, а также включают твердые разбавители типа размолотого известняка, сульфата натрия, карбоната кальция и каолина, или жидкие вещества типа приемлемых для ветеринарии масел (растительных или минеральных масел), пропилен- и полиэтиленгликоля. Эти композиции можно вводить животному орально, предпочтительно в смеси с кормом, или в форме кормовой муки или медицинских кормовых гранул.

Для использования в воде для питья применяют водные растворы с добавлением растворителей, таких как этанол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, принятые жидкие поверхностно-активные вещества и сорбит, или без дополнительных растворителей.

С целью применения, например, для внутримышечной инъекции композицию обычно готовят в виде раствора в воде, который может включать растворители типа этанола или пропиленгликоля, или в приемлемом для ветеринарии масле. Примерами приемлемых масел являются кунжутное масло, триглицериды со средней длиной цепи (например, Миглиол), изопролпилмиристат и этилолеат. Композиция может содержать консерванты, буферы и другие общепринятые эксципиенты.

Ветеринарные композиции для применения по настоящему изобретению могут быть получены смешением ингредиентов в необходимых пропорциях. Затем композицию упаковывают в соответствующий контейнер, готовый для применения.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примере.

Ингредиент, г/100 мл:

Гидрохлорид валнемулина - 10,0

Фенол - 0,5

Миглиол 840 - До 100 мл

Агент по изобретению является хорошо переносимым. Острую токсичность для крыс соединения формулы I в форме гидрохлорида определяли с использованием однократных доз 1000 мг/кг и 2000 мг/кг при оральном введении 5 самцам и 5 самкам крыс для каждой из этих доз. Гибель животных происходила через 1-8 дней. Полученное значения LD₅₀ составляет >1000 мг/кг перорально.