защищенные пептиды кальцитонина

Формула изобретения

Защищенные пептиды общей формулы

Х¹-Ley-His-Lys(R¹)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R²)-Pro-Y,

где Х¹= H-, A¹O-CO-, H-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-, A¹O-CO-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-;

Y= -OH, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂;

А¹ есть треть-бутил;

R¹ - защитная группа формулы В¹О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys;

R² - защитная группа В²О-СО- для гидроксильной группы остатка Туr;

R³ - защитная группа формулы В³О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys;

В⁴ - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,

причем В¹, В², В³ и В⁴ могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения кальцитонина лосося и его аналогов, а именно к защищенным пептидам общей формулы

X¹-Leu-His-Lys(R¹)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R²)-Pro-Y,

где Х¹ - Н-, А¹O-СО-, H-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-, A¹O-CO-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-;

Y - -ОН, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂;

А¹ - трет-бутил;

R¹ - защитная группа формулы В¹O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

R² - защитная группа формулы В²O-СО- для гидроксильной группы остатка Тyr,

R³ - защитная группа формулы В³O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

В⁴ - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,

причем В¹, В², В³ и В⁴ могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.

Гипокальциемический гормон кальцитонин является важнейшим лекарственным средством, применяемым для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме: гиперкальциемии различного происхождения, острой дистрофии костей, остеопороза, болезни Паже, замедленного сращивания костей после переломов или хирургических операций. В медицинской практике наибольшее применение находит кальцитонин лосося, по биологической активности более чем в 40 раз превосходящий кальцитонины человека и млекопитающих.

Кальцитонин лосося представляет собой полипептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков, содержащий дисульфидный мостик между остатками цистеина в положениях 1 и 7 и амидированный С-концевой остаток пролина:



Основным источником кальцитонина медицинского назначения является химический синтез. Для химического синтеза кальцитонина используются два основных подхода, существующих в химии пептидов: твердофазный, или синтез на нерастворимом полимерном носителе, и жидкофазный, или синтез в растворе. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, твердофазный синтез по-прежнему остается мало приспособленным для получения пептидов в больших количествах, требуемых для клинических испытаний и серийного производства лекарственных средств. В этом отношении к недостаткам твердофазного синтеза можно отнести: а) необходимость применения полной постоянной защиты три функциональных аминокислот; б) использование больших избытков защищенных аминокислот, как правило, не подлежащих регенерации; в) ограниченные возможности контроля хода синтеза, невозможность очистки промежуточных продуктов; г) трудность масштабирования; д) опасность загрязнения целевого пептида близкими по структуре примесями, трудоемкость и многостадийность очистки конечного продукта; е) высокую стоимость исходных материалов - защищенных аминокислот, реагентов и полимеров.

Поэтому жидкофазный синтез, несмотря на относительно высокую трудоемкость, является основным методом пилотного и промышленного производства пептидов, так как он обеспечивает тактическую гибкость в выборе схем защиты (от минимальной до полной) и методов конденсации, полный контроль хода синтеза, возможность очистки промежуточных продуктов, а также возможность масштабирования всего процесса. Однако эффективность процесса, выходы и качество конечных продуктов существенным образом зависят от оптимальности тактической схемы синтеза.

Синтез кальцитонина в растворе осуществляют путем сборки его полной последовательности из соответствующим образом защищенных пептидных сегментов, удаления защитных групп, последующей очистки и выделения целевого продукта. Защищенные пептидные сегменты, в свою очередь, синтезируют из защищенных аминокислот и/или более коротких пептидных сегментов. Аминокислотные последовательности сегментов, природа и расположение в их структуре защитных групп, порядок и способы сборки из сегментов полной последовательности кальцитонина определяются выбранной тактической схемой синтеза. Чтобы схема была эффективной и масштабируемой, при ее разработке необходимо следовать некоторым общим правилам: а) разбиение на сегменты нужно проводить таким образом, чтобы риск рацемизации при конденсации сегментов в единую цепь был минимальным; б) сегменты должны быть достаточно длинными, чтобы уменьшить число последовательных стадий при сборке молекулы кальцитонина; в) постоянные и временные защитные группы сегментов должны, с одной стороны, обеспечить необходимый уровень защиты от побочных реакций при синтезе сегментов и последующей их конденсации в единую цепь, с другой стороны, легко удаляться на финальной стадии процесса без повреждения структуры целевого продукта; г) защищенные пептидные сегменты должны быть хорошо растворимы в растворителях, используемых для конденсации сегментов. Эти требования во многом являются противоречащими друг другу, поэтому добиться их полного выполнения на практике очень трудно.

Структурной особенностью молекулы кальцитонина лосося является наличие всего трех аминокислотных остатков (кроме двух остатков Cys), требующих обязательной постоянной защиты, - Lys¹¹, Lys¹⁸ и Glu¹⁵, высокое содержание гидроксиаминокислот, а также наличие остатков His и Arg, постоянная защита которых при жидкофазном синтезе не является строго обязательной. Это открывает возможности для осуществления синтеза кальцитонина с применением разнообразных схем защиты - от минимальной до полной.

Известны способы получения кальцитонина лосося и его аналогов из пептидных сегментов с полной постоянной защитой бензильного типа (патент Швейцарии 624660, Cl. C 07 C 103/52) и трет-бутильного типа (патент Японии 0616694, Cl. C 07 K 7/06; Европейский патент 606816, Cl. C 07 K 001/06). Полная защита позволяет минимизировать возможные побочные реакции при сборке последовательности кальцитонина. Вместе с тем, отщепление большого числа защитных групп кислотными реагентами по окончании синтеза само по себе часто является источником побочных реакций. Кроме того, растворимость полностью защищенных пептидов в органических растворителях существенно снижается с увеличением их длины. Это затрудняет проведение синтеза и делает почти невозможными очистку и контроль чистоты промежуточных продуктов. Тем самым теряется одно из основных преимуществ жидкофазного синтеза пептидов.

Схемы синтеза кальцитонина и его аналогов из пептидных сегментов с минимальной постоянной защитой трет-бутильного типа, описанные, например, в статье Guttmann S., Pless J., Huguenin R.L., Sandrin E., Bossert H., Zehnder K. Helv. Chim. Acta, 1969, v. 52, p.1788-1795, в патентной заявке Германии 2025791, Cl. C 07 C, а также промежуточные (неполные) варианты постоянной защиты (например, патент Японии 0616694, Cl. C 07 К 7/06) позволяют улучшить ситуацию с растворимостью синтезируемого полипептида. Отщепление в мягких условиях небольшого числа защитных групп на финальной стадии процесса дает высокий выход целевого продукта, который не требует многостадийной очистки. Однако применение в качестве постоянной защиты кислотолабильных групп трет-бутильного типа исключает возможность одновременного использования групп аналогичного типа (например, трет-бутоксикарбонильной и трет-бутильной) в качестве высокоэффективных временных защитных групп для -амино- и -карбоксильных групп защищенных пептидных сегментов. Это существенно усложняет синтетические подходы к получению пептидных сегментов, перекрывающих область с 11-го по 23-й аминокислотный остаток последовательности кальцитонина лосося.

Таким образом, разработка эффективной и масштабируемой схемы жидкофазного синтеза кальцитонина является, по существу, разработкой набора оптимально защищенных пептидных сегментов и способов их соединения в единую аминокислотную последовательность.

Задачей изобретения является изыскание новых защищенных пептидов, которые можно было бы использовать в качестве исходных соединений для эффективного и масштабируемого синтеза кальцитонина лосося.

Поставленная задача достигается тем, что предлагаются новые соединения, а именно защищенные пептиды кальцитонина общей формулы

X¹-Leu-His-Lys(R¹)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R²)-Pro-Y,

где Х¹ - Н-, А¹O-СО-, H-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-, A¹O-CO-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-;

Y - -ОН, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂;

А¹ - трет-бутил;

R¹ - защитная группа формулы В¹O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

R² - защитная группа формулы В²O-СО- для гидроксильной группы остатка Тyr,

R³ - защитная группа формулы В³O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

В⁴ - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,

причем В¹, В², В³ и В⁴ могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.

Предметом изобретения, таким образом, являются пептидные сегменты 16-23, 11-23, 16-32 и 11-32 (I-IV) последовательности кальцитонина лосося, имеющие защитные группы на боковых радикалах аминокислотных остатков Lys¹¹, Lys¹⁸, Glu¹⁵ и Тyr²² (табл.1).

Сегменты I-IV могут иметь свободную -аминогруппу (X² - Н) либо блокированную уретановой защитной группой (X² - А¹O-СО-), предпочтительно трет-бутоксикарбонильной (А¹ - трет-бутил). Боковые защитные группы R¹-R³, В⁴ представляют собой удаляемые основаниями группировки 2-алкил- или 2-арилсульфонилэтильного типа: карбаматные (уретановые) для остатков Lys¹¹ и Lys¹⁸ (R¹ - В¹O-СО-, R³ - В³O-СО-); карбонатные для остатка Тyr²² (R² - В²O-СО-); сложноэфирные для остатка Glu¹⁵ (В⁴). Применение защитных групп 2-алкил- и 2-арилсульфонилэтильного типа для блокирования функциональных групп аминокислот описано в литературе. 2-Алкил(арил)сульфонилэтильные заместители В¹-В⁴ в соединениях I-IV могут присутствовать в различных сочетаниях, быть одинаковыми или разными.

Пептидные сегменты I-IV являются новыми, не описанными ранее веществами.

Для синтеза пептидных сегментов I-IV могут быть использованы приемы и методы пептидного синтеза, описанные в литературе. Сегмент I (16-23) можно синтезировать методом ступенчатого наращивания пептидной цепи от С-конца к N-концу с использованием N-защищенных аминокислот. В качестве временной N-защиты в данном случае можно применять группу, удаляемую каталитическим гидрогенолизом, например карбобензоксигруппу, либо мягким ацидолизом, например трет-бутоксикарбонильную или 4-метоксибензилоксикарбонильную. Для постоянного блокирования С-концевой карбоксильной группы синтезируемого пептида можно использовать сложноэфирную защиту, например, в виде бензилового или 2,2,2-тригалогенэтилового эфира. Для активации карбоксильных групп аминокислотных остатков, вводимых в пептидную цепь, можно использовать разнообразные методы, описанные в литературе, например метод активированных эфиров, метод смешанных ангидридов, азидный метод, карбодиимидный метод. Полученный сегмент 16-23 имеет защищенные -амино- и -карбоксильную группы.

Для синтеза сегмента II (11-23) с полученного N,C-защищенного сегмента 16-23 удаляют N-защитную группу и наращивают его далее ступенчато до последовательности 11-23, как описано выше, либо конденсируют его известными способами с предварительно синтезированным сегментом 11-15 общей формулы

X²-Lys(R³)-Leu-Ser-Gln-Glu(B⁴)-OH (V),

где Х² есть уретановая защитная группа, предпочтительно трет-бутоксикарбонильная, а R³ и В⁴ принимают значения, указанные выше. Удаление C-защиты с полученного N,C-защищенного сегмента 11-23 дает целевой N-защищенный сегмент II.

Для синтеза сегмента III (16-32) с N,C-защищенного сегмента 16-23 удаляют C-защитную группу, и полученный N-защищенный сегмент I конденсируют известными способами с описанным в литературе сегментом 24-32 формулы

H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (VI).

Сегмент IV (11-32) можно синтезировать двумя путями: 1) N-эащищенный сегмент II конденсируют с сегментом VI; 2) сегмент III со свободной -аминогруппой конденсируют с сегментом V.

Очевидно, что практически осуществимо получение сегментов I-1V с любыми сочетаниями заместителей В¹-В⁴ при указанных выше значениях В¹-В⁴. В качестве защитных групп R¹-R³, В⁴ для сегментов I-1V могут, в частности, использоваться группы, выбранные из числа описанных в литературе (табл.2).

Описанные выше сегменты I-IV могут быть использованы в качестве полупродуктов для получения кальцитонина лосося. Для синтеза полной аминокислотной последовательности кальцитонина лосося сегмент IV со свободной -аминогруппой, полученный из сегмента II либо из сегмента III, как описано выше, конденсируют известными способами с -защищенным сегментом 1-10 аминокислотной последовательности кальцитонина лосося, например с описанным в литературе пептидом формулы



С продукта конденсации удаляют N-Вос-защиту, например, действием трифторуксусной кислоты, и получают пептид, имеющий аминокислотную последовательность кальцитонина лосося 1-32 и содержащий четыре аминокислотных остатка, блокированных защитными группами 2-алкил(арил)сульфонилэтильного типа:



Для удаления защитных групп пептид VIII подвергают кратковременному действию разбавленного раствора основания, например обработке 0.1 н. водным раствором гидроксида натрия в течение 3-20 мин при температуре от 0 до 20^oС, смесь нейтрализуют, например, добавлением избытка уксусной кислоты, после чего выделяют из полученного раствора кальцитонин лосося известными способами, например ионообменной или/и обращенно-фазовой хроматографией.

Сущность изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:

ДМФА - диметилформамид,

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид,

ОБТ - 1-гидроксибензотриазол,

ТФУ - трифторуксусная кислота,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

Cpsc - 2-(4-хлорфенил)сульфонилэтоксикарбонил,

Msc - 2-метилсульфонилэтоксикарбонил,

Psc - 2-фенилсульфонилэтоксикарбонил,

Pse - 2-фенилсульфонилэтил,

Tse - 2-(4-толил)сульфонилэтил,

Tce - 2,2,2-трихлорэтил.

Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem., 1984, v. 138, N 1, pp. 9-37. Оптически активные аминокислоты, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию.

Значения хроматографических подвижностей R_f приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufolien Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота 95:5:3 (А) или 90:10:3 (Б); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 60: 5: 15:10 (В). Обнаружение пятен на пластинках проводили в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (М+H)⁺ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина) или на масс-спектрометре MALDI-TOF VISION 2000 (Thermo Bioanalysis, Англия). Анализ аминокислотного состава проводили на анализаторе Biotronik LC5001 после кислотного гидролиза образцов пептидного материала в запаянных ампулах (6 н. НС1, 24 ч, 110^oС).

Пример 1. Получение Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Iа).

а. Вос-Рrо-ОТсе. 3.9 г Вос-Рrо-ОН растворяют в 20 мл сухого этилацетата, добавляют 50 мг 4-диметиламинопиридина и 2 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 4.2 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0^oС и 30 мин при 20^oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат экстрагируют 50 мл воды, 50 мл насыщенного NaHCО₃ и 50 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Получают 6.1 г бесцветного масла, R_f 0.65-0.7 (А).

б. Boc-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Масло Вос-Рrо-ОТсе (пример Iа) растворяют в 30 мл 2 М НСl в уксусной кислоте, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток переупаривают с толуолом, промывают эфиром и растворяют в 50 мл ДМФА. К раствору добавляют 9.5 г Boc-Tyr(Psc)-OH, 2.0 мл N-метилморфолина и 2.2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.5 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0^oС и 2 ч при 20^oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату добавляют 150 мл этилацетата и экстрагируют 100 мл воды, 100 мл насыщенного NаНСО₃, 100 мл 0.5 М KHSO₄ и 50 мл насыщенного NaCl. Органический слой упаривают досуха и обрабатывают остаток петролейным эфиром. Получают 10.5 г бесцветного кристаллического продукта, R_f 0.7-0.75 (А); масс-спектр: (М+H)⁺ 724.2 (вычислено: 723.08).

в. Boc-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1б) растворяют в 40 мл 2 М НСl в уксусной кислоте, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток переупаривают с толуолом, промывают эфиром и растворяют в 70 мл ДМФА. К раствору добавляют 4 г Boc-Thr-OH, 1.8 мл N-метилморфолина и 2.4 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.5 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0^oС и 3 ч при 20^oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1б. Получают 11 г бесцветного аморфного вещества, R_f 0.40-0.45 (А); масс-спектр: (М+Н)⁺ 823.5 (вычислено: 823.19).

г. Boc-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1в) растворяют в 50 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 11 г трифторацетата H-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.95 г Boc-Gln-OH, 1.8 мл N-метилморфолина и 2.2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.3 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0^oC и 3 ч при 20^oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1б. Остаток после упаривания экстракта обрабатывают эфиром и получают 10.4 г целевого продукта, R_f 0.15-0.20 (А), 0.50-0.55 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 921.5 (вычислено: 952.33).

д. Boc-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1г) растворяют в 50 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 9.8 г трифторацетата H-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3 г моногидрата Boc-Leu-OH, 1.4 мл N-метилморфолина и 2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 2.8 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0^oС и 8 ч при 20^oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1г. Получают 9.6 г целевого пентапептида, R_f 0.10-0.15 (А), 0.55-0.60 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1067.3 (вычислено: 1065.50).

е. Boc-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-ОТсе (пример 1д) растворяют в 60 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 9.5 г трифторацетата H-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Рrо-ОТсе. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 6.5 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc), 1.4 мл N-метилморфолина и 1.4 г ОБТ. Перемешивают смесь 8 ч при 20^oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 11.4 г гексапептида, R_f 0.35-0.40 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1404.2 (вычислено: 1405.91).

ж. Boc-His(Boc)-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1е) растворяют в 60 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 11.5 г трифторацетата Н-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 5.4 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-His(Boc), 1.4 мл N-метилморфолина и 1.35 г ОБТ. Перемешивают смесь 12 ч при 20^oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, переосаждают из ДМФА эфиром и получают 12.3 г гептапептида, _f 0.30-0.40 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 1444.1 (вычислено: 1442.94).

з. Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-His(Boc)-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1e) растворяют в 60 мл ТФУ, через 40 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 12 г бистрифторацетата H-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3 г N-гидроксисукцинимидного эфира Boc-Leu и 2.2 мл N-метилморфолина. Перемешивают смесь 18 ч при 20^oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток этилацетатом. Осадок отфильтровывают, переосаждают из ДМФА эфиром и получают 11.6 г октапептида, _f 0.10-0.15 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 1554.6 (вычислено: 1556.11).

и. Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ia). К раствору 6.5 г Тсе-эфира сегмента Iа (пример 1з) в 60 мл тетрагидрофурана, 15 мл воды и 5 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 3 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 20 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 150 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Продукт переосаждают из уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 5.3 г целевого сегмента Ia, R_f 0.40-0.45 (В); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1524.1 (вычислено: 1524.84); аминокислотный состав: Glx 0.93 (1); Thr 0.85 (1); Leu 2.00 (2); Pro 1.09 (1); Тyr 0.91 (1); His 1.13 (1); Lys 1.02 (1).

Пример 2. Получение Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-G1n-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ib).

a. Boc-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. 3.2 г трифторацетата H-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1е) растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 2 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Msc), 0.5 мл N-метилморфолина и 450 мг ОБТ. Перемешивают смесь 4 ч при 20^oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 3.9 г гексапептида, R_f 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1342.2 (вычислено: 1343.84).

б. Boc-His(Boc)-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 2а) растворяют в 15 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 4.0 г трифторацетата Н-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 20 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.8 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-His(Boc), 450 мкл N-метилморфолина и 400 мг ОБТ. Перемешивают смесь 12 ч при 20^oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, переосаждают из уксусной кислоты эфиром и получают 4.0 г гептапептида, R_f 0.30-0.40 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 1381.1 (вычислено: 1380.87).

в. Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-His(Boc)-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 2б) растворяют в 15 мл ТФУ, через 40 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 3.9 г бис-трифторацетата H-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 20 мл ДМФА, к раствору добавляют 900 мг N-гидроксисукцинимидного эфира Boc-Leu и 0.82 мл N-метилморфолина. Перемешивают смесь 24 ч при 20^oС, затем обрабатывают смесь как описано в примере 1з и получают 3.8 г октапептида, R_f 0.08-0.15 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 1495.1 (вычислено: 1494.04).

г. Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ib). К раствору 1.8 г Тсе-эфира сегмента Ib (пример 2в) в 20 мл тетрагидрофурана, 5 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 1 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 20 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 50 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Пептид переосаждают из уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 1.4 г целевого сегмента Ib, R_f 0.35-0.40 (В); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1464.0 (вычислено: 1462.77); аминокислотный состав: Glx 1.04 (1); Thr 0.82 (1); Leu 2.00 (2); Pro 1.13 (1); Тyr 0.95 (1); His 1.08 (1); Lys 1.01 (1).

Пример 3. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент IIа).

a. Boc-Glu(OPse)-OTce. 4.2 г Boc-Glu(OPse)-OH растворяют в 20 мл сухого этилацетата, добавляют 20 мг 4-диметиламинопиридина и 1.2 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 2.3 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0^oС и 60 мин при 20^oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат экстрагируют 20 мл воды, 30 мл насыщенного NaHCО₃ и 30 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.0 г бесцветного кристаллического продукта, R_f 0.55-0.6 (А).

б. Boc-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Glu(OPse)-OTce (пример 3а) растворяют в 20 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 4.8 г трифторацетата H-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 2.6 г Boc-Gln-OH, 1.1 мл N-метилморфолина и 1.35 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 2.3 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0^oС и 7 ч при 20^oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривают. Остаток промывают водой, упаривают с этанолом и кристаллизуют из эфира. Получают 5.4 г дипептида, R_f 0.15-0.20 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 676.3 (вычислено: 676.02).

в. Boc-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3б) растворяют в 20 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.4 г трифторацетата H-Gln-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.4 г пентафторфенилового эфира Boc-Ser и 1.1 мл N-метилморфолина. Перемешивают 1.5 ч при 20^oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают гексаном, затем обрабатывают эфиром и получают 5.5 г трипептида, R_f 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 762.9 (вычислено: 763.10).

г. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTcc. Boc-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3в) растворяют в 20 мл ТФУ, через 50 мин при 20^oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.4 г трифторацетата H-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.4 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Вос-Leu, 450 мг ОБТ и 1.1 мл N-метилморфолина. Перемешивают 5 ч при 20^oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают водой, упаривают с этанолом, затем обрабатывают эфиром и получают 5.2 г тетрапептида, R_f 0.05-0.10 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 877.4 (вычислено: 876.28).

д. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3г) растворяют в 20 мл ТФУ, через 40 мин при 20^oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.3 г трифторацетата H-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-ОТсе. Его растворяют в 25 мл ДМФА, к раствору добавляют 4.3 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc), 450 мг ОБТ и 1.4 мл N-метилморфолина. Перемешивают 2 ч при 20^oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают водой, эфиром, упаривают с этанолом, затем обрабатывают эфиром и получают 6.5 г пентапептида, R_f 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 1117.4 (вычислено: 1116.56).

e. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OH (сегмент Va). К раствору 6.0 г Тсе-эфира сегмента Va (пример 3д) в 50 мл тетрагидрофурана, 10 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 2 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 30 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 100 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Пептид переосаждают из смеси метанола и уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 4.2 г целевого сегмента Va, R_f 0.55-0.60 (В); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1084.6 (вычислено: 1085.30); аминокислотный состав: Glx 2.04 (2); Ser 0.85 (1); Leu 1.00 (1); Lys 1.06 (1).

ж. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Рго-ОТсе (Тсе-эфир сегмента IIа). 1.65 г Тсе-эфира сегмента Ia (пример 1з) растворяют в 15 мл ТФУ, через 40 мин при 20^oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 1.7 г бис-трифторацетата H-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 10 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.2 г сегмента Va (пример 3е), 270 мг ОБТ, 230 мкл N-метилморфолина и, при охлаждении в ледяной бане, 300 мг ДЦГК. Смесь перемешивают 2 ч при охлаждении, затем 18 ч при 20^oС. Отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривают до масла и остаток обрабатывают 100 мл этилацетата. Осадок отделяют фильтрованием, переосаждают из ДМФА этилацетатом, промывают эфиром и получают 2.32 г тридекапептида; масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 2524.2 (вычислено: 2522.26).

з. Сегмент IIа. К 2.3 г Тсе-эфира IIа (пример 3ж) в смеси 10 мл ДМФА, 20 мл тетрагидрофурана, 5 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 1 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 50 мин, затем обрабатывают как описано в примере 3е. Получают 2 г сегмента IIа; масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)⁺ 2389.6 (вычислено: 2390.87); аминокислотный состав: Glx 2.73 (3); Ser 0.83 (1); Thr 0.87 (1); Leu 3.00 (3); Pro 1.11 (1); Тyr 0.91 (l); His l.06 (l); Lys 2.02 (2).

Пример 4. Получение Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (сегмент IIIa).

К раствору 770 мг сегмента Ia (пример 1и), 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI (Helv. Chim. Acta, 1969, v. 52, 1788-1795), 135 мг ОБТ и 100 мкл N-метилморфолина в 6 мл ДМФА добавляют 140 мг ДЦГК и перемешивают смесь 24 ч при 20^oС. Реакционную смесь обрабатывают как описано в примере 1ж, полученный осадок сырого гептадекапептида растворяют в 20 мл смеси ацетонитрил-вода (1:4) и хроматографируют на колонке 415 см с LiChroprep RP18 (Merck, Германия) в градиенте ацетонитрила (от 10 до 50%) в воде, содержащей 0.2% ТФУ. Фракции, содержащие чистый продукт (более 90% по ВЭЖХ), объединяют и упаривают досуха, остаток обрабатывают эфиром и получают 0.94 г трифторацетата сегмента IIIа; масс-спектр: (М+Н)⁺ 2394.9 (вычислено: 2395.83); аминокислотный состав: Asx 1.01 (1); Glx 1.05 (1); Ser 0.81 (1); Thr 3.57 (4); Gly 1.94 (2); Leu 2.00 (2); Pro 2.08 (2); Тyr 0.90 (1); His 1.06 (l); Lys 1.08 (l); Arg 1.01 (1).

Пример 5. Получение Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (сегмент IIIb)/

Получают из 750 мг сегмента Ib (пример 2) и 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI, как описано для сегмента IIIa в примере 4. После хроматографической очистки выделяют 0.86 г трифторацетата сегмента IIIb; масс-спектр: (М+Н)⁺ 2334.2 (вычислено: 2333.76); аминокислотный состав: Asx 1.08 (1); Glx 1.00 (1); Ser 0.84 (1); Thr 3.50 (4); Gly 1.96 (2); Leu 2.00 (2); Pro 1.88 (2); Туr 0.95 (1); His 1.09 (1); Lys 1.03 (1); Arg 1.00 (1).

Пример 6. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (сегмент IVa). Вариант 1.

К раствору 1.25 г сегмента IIа (пример 3), 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI, 135 мг ОБТ и 120 мкл М-метилморфолина в 10 мл ДМФА добавляют 160 мг ДЦГК и перемешивают смесь 40 ч при 20^oС. Реакционную смесь обрабатывают как описано в примере 1ж, полученный осадок сырого 22-пептида растворяют в 30 мл смеси ацетонитрил-вода (1:4) и хроматографируют на колонке 15 см с LiChroprep RP18 (Merck, Германия) в градиенте ацетонитрила (от 10 до 70%) в воде, содержащей 0.2% ТФУ. Фракции, содержащие чистый продукт (более 90% по ВЭЖХ), объединяют и упаривают досуха, остаток обрабатывают эфиром и получают 1.15 г трифторацетата сегмента IVa; масс-спектр: (М+H)⁺ 3363.1 (вычислено: 3361.97); аминокислотный состав: Asx 1.04 (1); Glx 3.15 (3); Ser 1.80 (2); Thr 3.48 (4); Gly 1.96 (2); Leu 3.00 (3); Pro 2.01 (2); Туr 0.88 (1); His 1.07 (1); Lys 2.10 (2); Arg 1.00 (1).

Пример 7. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (сегмент IVa). Вариант 2.

С 1.30 г сегмента IIIa (пример 4) удаляют Вос-защиту действием ТФУ, как описано в примере 3ж, и получают 1.33 г трис-трифторацетата сегмента IIIа со свободной -аминогруппой, (М+Н)⁺ 2295.3. Его конденсируют с 600 мг сегмента Va (пример 3е), как описано в примере 6. После хроматографической очистки выделяют 1.28 г трифторацетата сегмента IVa, идентичного полученному в примере 6.

Пример 8. Получение Boc-Lys(Cpsc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-GIn-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (сегмент IVb).

a. Boc-Glu(OTse)-OTce. 2.2 г Boc-Glu(OTse)-OH растворяют в 10 мл сухого этилацетата, добавляют 10 мг 4-диметиламинопиридина и 0.65 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 1.2 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0^oС и 60 мин при 20^oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат разбавляют 15 мл этилацетата и экстрагируют 20 мл воды, 30 мл насыщенного NaHCO₃ и 30 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира и получают 2.5 г бесцветного кристаллического продукта, R_f 0.55-0.6 (А).

б. Boc-Gln-Glu(OTse)-OTce. Boc-Glu(OTse)-OTce (пример 8а) растворяют в 10 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 2.5 г трифторацетата H-Glu(OTse)-OTce. Его растворяют в 10 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.3 г Boc-Gln-OH, 600 мкл N-метилморфолина и 0.65 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 1.2 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0^oС и 10 ч при 20^oС, затем обрабатывают смесь как описано в примере 3б. Получают 2.8 г дипептида, R_f 0.15-0.20 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 689.4 (вычислено: 690.05).

в. Boc-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce. С дипептида Boc-Gln-Glu(OTse)-OTce (пример 8б) удаляют Вос-защиту и конденсируют его с 1.7 г пентафторфенилового эфира Boc-Ser, как описано в примере 3в. Получают 2.8 г трипептида, R_f 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 777.9 (вычислено: 777.11).

г. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce. С пептида Boc-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce (пример 8в) удаляют Вос-защиту и конденсируют его с 1.8 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Leu, как описано в примере 3г. Получают 2.7 г тетрапептида, R_f 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)⁺ 892.0 (вычислено: 890.29).

д. Boc-Lys(Cpsc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce. С тетрапептида Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce (пример 8г) удаляют Вос-защиту и конденсируют его с 2.3 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Cpsc), как описано в примере 3д. Получают 3.3 г пентапептида (Тсе-эфира сегмента Vb), R_f 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+H)⁺ 1166.4 (вычислено: 1165.04).

е. Boc-Lys(Cpsc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OH (сегмент Vb). С 3 г Тсе-эфира сегмента Vb (пример 8д) удаляют Tce-защиту обработкой цинковой пылью, как описано в примере 3е. Получают 2.3 г сегмента Vb, R_f 0.55-0.60 (В); масс-спектр: (М+Н)⁺ 1132.0 (вычислено: 1133.78); аминокислотный состав: Glx 1.86 (2); Ser 0.89 (1); Leu 1.00 (l); Lys 1.03(1).

ж. Сегмент IVb. С 600 мг трифторацетата сегмента IIIb (пример 5) удаляют Вос-защиту действием ТФУ и получают 620 мг трис-трифторацетата сегмента IIIb со свободной -аминогруппой, (М+Н)⁺ 2232.3. Его конденсируют с 330 мг сегмента Vb (пример 8е), как описано в примере 6. После хроматографической очистки выделяют 630 мг трифторацетата сегмента IVb; масс-спектр: (М+Н)⁺ 3350.1 (вычислено: 3348.39); аминокислотный состав: Asx 1.01 (1); Glx 3.20 (3); Ser 1.88 (2); Thr 3.63 (4); Gly 2.04 (2); Leu 3.00 (3); Pro 2.03 (2); Тyr 0.94 (1); His 1.07 (1); Lys 2.01 (2); Arg 1.05 (1).

Пример 9. Получение кальцитонина лосося (с использованием сегмента IVa).

360 мг сегмента IVa растворяют в 3 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают досуха и обрабатывают остаток эфиром. Получают 365 мг трис-трифторацетата сегмента IVa со свободной -аминогруппой, (М+Н)⁺ 3262.4. Его растворяют в 3 мл диметилсульфоксида, добавляют 130 мг сегмента VII (Helv. С him. Acta, 1969, v. 52, 1788-1795), 30 мкл N-метилморфолина, 27 мг ОБТ и 40 мг ДЦГК, смесь перемешивают 24 ч при 20^oС. Отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату добавляют 40 мл этилацетата, выпавший осадок отделяют, получают 480 мг сырого защищенного 32-пептида VIIIa. Его обрабатывают ТФУ для удаления Вос-защиты, как описано выше, затем растворяют в 20 мл смеси ДМФА-вода (1:4). К раствору при сильном перемешивании в течение 30 с добавляют по каплям 2 мл 1 н. водного раствора гидроксида натрия и перемешивают еще 5 мин, затем добавляют 0.5 мл уксусной кислоты. Смесь разбавляют водой до 50 мл и наносят на колонку 415 см с целлюлозой СМ-52 (Whatman, Англия), уравновешенную 0.05 М ацетатом аммония (рН 5.9). Проводят элюцию градиентом от 0.1 до 0.7 М ацетата аммония (рН 5.9), фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и лиофилизуют. Получают 182 мг кальцитонина лосося; хроматографическая чистота по ВЭЖХ 92%, массовое содержание пептидного материала 76%. Масс-спектр: (М+Н)⁺ 3432.8 (вычислено: 3433.15); аминокислотный состав: Asx 2.01 (2); Glx 3.22 (3); Ser 3.58 (4); Thr 4.63 (5); Gly 3.04 (3); Val 0.94 (1); Leu 5.00 (5); Pro 2.11 (2); Туr 0.94 (1); His 1.07 (1); Lys 2.01 (2); Arg 1.05 (1); Cys не определяется.

Пример 10. Получение кальцитонина лосося (с использованием сегмента IVb).

360 мг сегмента IVb растворяют в 3 мл ТФУ, через 30 мин при 20^oС упаривают досуха и обрабатывают остаток эфиром. Получают 360 мг трис-трифторацетата сегмента IVb со свободной -аминогруппой, (М+Н)⁺ 3249.3. Его растворяют в 3 мл диметилсульфоксида, добавляют 130 мг сегмента VII и далее проводят конденсацию и обработку реакционной смеси, как описано в примере 9. Получают 510 мг сырого защищенного 32-пептида VIIIb. Его обрабатывают ТФУ для удаления Вос-защиты, как описано выше, затем деблокируют гидроксидом натрия, как описано в примере 9, в течение 20 мин. Хроматографией на целлюлозе СМ-52 выделяют 131 мг кальцитонина лосося, идентичного полученному в примере 9; хроматографическая чистота по ВЭЖХ 91%, массовое содержание пептидного материала 78%.