защищенные пептиды кальцитонина

Классы МПК:C07K1/06 с использованием защитных групп или активирующих агентов
C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот
C07K14/585 кальцитонины
A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот
A61K38/23 кальцитонины
A61P19/10 остеопороза
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор",
Общество с ограниченной ответственностью "Фармсинтез"
Приоритеты:
подача заявки:
2000-09-14
публикация патента:

Изобретение относится к соединениям формулы Х1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y, где Х1 - H-, A1O-CO-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-; Y - -OH, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2; А1 есть трет-бутил; R1 - защитная группа формулы В1О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys, R2 - защитная группа формулы В2О-СО- для гидроксильной группы остатка Туr, R3 - защитная группа формулы В3О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys, В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu, причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил. Использование указанных защищенных пептидов позволяет упростить получение кальцитонина лосося. 2 табл.

Рисунки к патенту РФ 2193567

Рисунок 1, Рисунок 2

Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения кальцитонина лосося и его аналогов, а именно к защищенным пептидам общей формулы

X1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y,

где Х1 - Н-, А1O-СО-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-;

Y - -ОН, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2;

А1 - трет-бутил;

R1 - защитная группа формулы В1O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

R2 - защитная группа формулы В2O-СО- для гидроксильной группы остатка Тyr,

R3 - защитная группа формулы В3O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,

причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.

Гипокальциемический гормон кальцитонин является важнейшим лекарственным средством, применяемым для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме: гиперкальциемии различного происхождения, острой дистрофии костей, остеопороза, болезни Паже, замедленного сращивания костей после переломов или хирургических операций. В медицинской практике наибольшее применение находит кальцитонин лосося, по биологической активности более чем в 40 раз превосходящий кальцитонины человека и млекопитающих.

Кальцитонин лосося представляет собой полипептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков, содержащий дисульфидный мостик между остатками цистеина в положениях 1 и 7 и амидированный С-концевой остаток пролина:

защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567

Основным источником кальцитонина медицинского назначения является химический синтез. Для химического синтеза кальцитонина используются два основных подхода, существующих в химии пептидов: твердофазный, или синтез на нерастворимом полимерном носителе, и жидкофазный, или синтез в растворе. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, твердофазный синтез по-прежнему остается мало приспособленным для получения пептидов в больших количествах, требуемых для клинических испытаний и серийного производства лекарственных средств. В этом отношении к недостаткам твердофазного синтеза можно отнести: а) необходимость применения полной постоянной защиты три функциональных аминокислот; б) использование больших избытков защищенных аминокислот, как правило, не подлежащих регенерации; в) ограниченные возможности контроля хода синтеза, невозможность очистки промежуточных продуктов; г) трудность масштабирования; д) опасность загрязнения целевого пептида близкими по структуре примесями, трудоемкость и многостадийность очистки конечного продукта; е) высокую стоимость исходных материалов - защищенных аминокислот, реагентов и полимеров.

Поэтому жидкофазный синтез, несмотря на относительно высокую трудоемкость, является основным методом пилотного и промышленного производства пептидов, так как он обеспечивает тактическую гибкость в выборе схем защиты (от минимальной до полной) и методов конденсации, полный контроль хода синтеза, возможность очистки промежуточных продуктов, а также возможность масштабирования всего процесса. Однако эффективность процесса, выходы и качество конечных продуктов существенным образом зависят от оптимальности тактической схемы синтеза.

Синтез кальцитонина в растворе осуществляют путем сборки его полной последовательности из соответствующим образом защищенных пептидных сегментов, удаления защитных групп, последующей очистки и выделения целевого продукта. Защищенные пептидные сегменты, в свою очередь, синтезируют из защищенных аминокислот и/или более коротких пептидных сегментов. Аминокислотные последовательности сегментов, природа и расположение в их структуре защитных групп, порядок и способы сборки из сегментов полной последовательности кальцитонина определяются выбранной тактической схемой синтеза. Чтобы схема была эффективной и масштабируемой, при ее разработке необходимо следовать некоторым общим правилам: а) разбиение на сегменты нужно проводить таким образом, чтобы риск рацемизации при конденсации сегментов в единую цепь был минимальным; б) сегменты должны быть достаточно длинными, чтобы уменьшить число последовательных стадий при сборке молекулы кальцитонина; в) постоянные и временные защитные группы сегментов должны, с одной стороны, обеспечить необходимый уровень защиты от побочных реакций при синтезе сегментов и последующей их конденсации в единую цепь, с другой стороны, легко удаляться на финальной стадии процесса без повреждения структуры целевого продукта; г) защищенные пептидные сегменты должны быть хорошо растворимы в растворителях, используемых для конденсации сегментов. Эти требования во многом являются противоречащими друг другу, поэтому добиться их полного выполнения на практике очень трудно.

Структурной особенностью молекулы кальцитонина лосося является наличие всего трех аминокислотных остатков (кроме двух остатков Cys), требующих обязательной постоянной защиты, - Lys11, Lys18 и Glu15, высокое содержание гидроксиаминокислот, а также наличие остатков His и Arg, постоянная защита которых при жидкофазном синтезе не является строго обязательной. Это открывает возможности для осуществления синтеза кальцитонина с применением разнообразных схем защиты - от минимальной до полной.

Известны способы получения кальцитонина лосося и его аналогов из пептидных сегментов с полной постоянной защитой бензильного типа (патент Швейцарии 624660, Cl. C 07 C 103/52) и трет-бутильного типа (патент Японии 0616694, Cl. C 07 K 7/06; Европейский патент 606816, Cl. C 07 K 001/06). Полная защита позволяет минимизировать возможные побочные реакции при сборке последовательности кальцитонина. Вместе с тем, отщепление большого числа защитных групп кислотными реагентами по окончании синтеза само по себе часто является источником побочных реакций. Кроме того, растворимость полностью защищенных пептидов в органических растворителях существенно снижается с увеличением их длины. Это затрудняет проведение синтеза и делает почти невозможными очистку и контроль чистоты промежуточных продуктов. Тем самым теряется одно из основных преимуществ жидкофазного синтеза пептидов.

Схемы синтеза кальцитонина и его аналогов из пептидных сегментов с минимальной постоянной защитой трет-бутильного типа, описанные, например, в статье Guttmann S., Pless J., Huguenin R.L., Sandrin E., Bossert H., Zehnder K. Helv. Chim. Acta, 1969, v. 52, p.1788-1795, в патентной заявке Германии 2025791, Cl. C 07 C, а также промежуточные (неполные) варианты постоянной защиты (например, патент Японии 0616694, Cl. C 07 К 7/06) позволяют улучшить ситуацию с растворимостью синтезируемого полипептида. Отщепление в мягких условиях небольшого числа защитных групп на финальной стадии процесса дает высокий выход целевого продукта, который не требует многостадийной очистки. Однако применение в качестве постоянной защиты кислотолабильных групп трет-бутильного типа исключает возможность одновременного использования групп аналогичного типа (например, трет-бутоксикарбонильной и трет-бутильной) в качестве высокоэффективных временных защитных групп для защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-амино- и защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-карбоксильных групп защищенных пептидных сегментов. Это существенно усложняет синтетические подходы к получению пептидных сегментов, перекрывающих область с 11-го по 23-й аминокислотный остаток последовательности кальцитонина лосося.

Таким образом, разработка эффективной и масштабируемой схемы жидкофазного синтеза кальцитонина является, по существу, разработкой набора оптимально защищенных пептидных сегментов и способов их соединения в единую аминокислотную последовательность.

Задачей изобретения является изыскание новых защищенных пептидов, которые можно было бы использовать в качестве исходных соединений для эффективного и масштабируемого синтеза кальцитонина лосося.

Поставленная задача достигается тем, что предлагаются новые соединения, а именно защищенные пептиды кальцитонина общей формулы

X1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y,

где Х1 - Н-, А1O-СО-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-;

Y - -ОН, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2;

А1 - трет-бутил;

R1 - защитная группа формулы В1O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

R2 - защитная группа формулы В2O-СО- для гидроксильной группы остатка Тyr,

R3 - защитная группа формулы В3O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,

В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,

причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.

Предметом изобретения, таким образом, являются пептидные сегменты 16-23, 11-23, 16-32 и 11-32 (I-IV) последовательности кальцитонина лосося, имеющие защитные группы на боковых радикалах аминокислотных остатков Lys11, Lys18, Glu15 и Тyr22 (табл.1).

Сегменты I-IV могут иметь свободную защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппу (X2 - Н) либо блокированную уретановой защитной группой (X2 - А1O-СО-), предпочтительно трет-бутоксикарбонильной (А1 - трет-бутил). Боковые защитные группы R1-R3, В4 представляют собой удаляемые основаниями группировки 2-алкил- или 2-арилсульфонилэтильного типа: карбаматные (уретановые) для остатков Lys11 и Lys18 (R1 - В1O-СО-, R3 - В3O-СО-); карбонатные для остатка Тyr22 (R2 - В2O-СО-); сложноэфирные для остатка Glu154). Применение защитных групп 2-алкил- и 2-арилсульфонилэтильного типа для блокирования функциональных групп аминокислот описано в литературе. 2-Алкил(арил)сульфонилэтильные заместители В14 в соединениях I-IV могут присутствовать в различных сочетаниях, быть одинаковыми или разными.

Пептидные сегменты I-IV являются новыми, не описанными ранее веществами.

Для синтеза пептидных сегментов I-IV могут быть использованы приемы и методы пептидного синтеза, описанные в литературе. Сегмент I (16-23) можно синтезировать методом ступенчатого наращивания пептидной цепи от С-конца к N-концу с использованием Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенных аминокислот. В качестве временной Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защиты в данном случае можно применять группу, удаляемую каталитическим гидрогенолизом, например карбобензоксигруппу, либо мягким ацидолизом, например трет-бутоксикарбонильную или 4-метоксибензилоксикарбонильную. Для постоянного блокирования С-концевой карбоксильной группы синтезируемого пептида можно использовать сложноэфирную защиту, например, в виде бензилового или 2,2,2-тригалогенэтилового эфира. Для активации карбоксильных групп аминокислотных остатков, вводимых в пептидную цепь, можно использовать разнообразные методы, описанные в литературе, например метод активированных эфиров, метод смешанных ангидридов, азидный метод, карбодиимидный метод. Полученный сегмент 16-23 имеет защищенные защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-амино- и защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-карбоксильную группы.

Для синтеза сегмента II (11-23) с полученного Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567,Cзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенного сегмента 16-23 удаляют Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защитную группу и наращивают его далее ступенчато до последовательности 11-23, как описано выше, либо конденсируют его известными способами с предварительно синтезированным сегментом 11-15 общей формулы

X2-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-OH (V),

где Х2 есть уретановая защитная группа, предпочтительно трет-бутоксикарбонильная, а R3 и В4 принимают значения, указанные выше. Удаление Cзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защиты с полученного Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567,Cзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенного сегмента 11-23 дает целевой Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенный сегмент II.

Для синтеза сегмента III (16-32) с Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567,Cзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенного сегмента 16-23 удаляют Cзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защитную группу, и полученный Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенный сегмент I конденсируют известными способами с описанным в литературе сегментом 24-32 формулы

H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (VI).

Сегмент IV (11-32) можно синтезировать двумя путями: 1) Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-эащищенный сегмент II конденсируют с сегментом VI; 2) сегмент III со свободной защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппой конденсируют с сегментом V.

Очевидно, что практически осуществимо получение сегментов I-1V с любыми сочетаниями заместителей В14 при указанных выше значениях В14. В качестве защитных групп R1-R3, В4 для сегментов I-1V могут, в частности, использоваться группы, выбранные из числа описанных в литературе (табл.2).

Описанные выше сегменты I-IV могут быть использованы в качестве полупродуктов для получения кальцитонина лосося. Для синтеза полной аминокислотной последовательности кальцитонина лосося сегмент IV со свободной защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппой, полученный из сегмента II либо из сегмента III, как описано выше, конденсируют известными способами с защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-защищенным сегментом 1-10 аминокислотной последовательности кальцитонина лосося, например с описанным в литературе пептидом формулы

защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567

С продукта конденсации удаляют Nзащищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-Вос-защиту, например, действием трифторуксусной кислоты, и получают пептид, имеющий аминокислотную последовательность кальцитонина лосося 1-32 и содержащий четыре аминокислотных остатка, блокированных защитными группами 2-алкил(арил)сульфонилэтильного типа:

защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567

Для удаления защитных групп пептид VIII подвергают кратковременному действию разбавленного раствора основания, например обработке 0.1 н. водным раствором гидроксида натрия в течение 3-20 мин при температуре от 0 до 20oС, смесь нейтрализуют, например, добавлением избытка уксусной кислоты, после чего выделяют из полученного раствора кальцитонин лосося известными способами, например ионообменной или/и обращенно-фазовой хроматографией.

Сущность изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:

ДМФА - диметилформамид,

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид,

ОБТ - 1-гидроксибензотриазол,

ТФУ - трифторуксусная кислота,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

Cpsc - 2-(4-хлорфенил)сульфонилэтоксикарбонил,

Msc - 2-метилсульфонилэтоксикарбонил,

Psc - 2-фенилсульфонилэтоксикарбонил,

Pse - 2-фенилсульфонилэтил,

Tse - 2-(4-толил)сульфонилэтил,

Tce - 2,2,2-трихлорэтил.

Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem., 1984, v. 138, N 1, pp. 9-37. Оптически активные аминокислоты, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию.

Значения хроматографических подвижностей Rf приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufolien Kieselgel 60 F254 (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота 95:5:3 (А) или 90:10:3 (Б); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 60: 5: 15:10 (В). Обнаружение пятен на пластинках проводили в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (М+H)+ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина) или на масс-спектрометре MALDI-TOF VISION 2000 (Thermo Bioanalysis, Англия). Анализ аминокислотного состава проводили на анализаторе Biotronik LC5001 после кислотного гидролиза образцов пептидного материала в запаянных ампулах (6 н. НС1, 24 ч, 110oС).

Пример 1. Получение Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Iа).

а. Вос-Рrо-ОТсе. 3.9 г Вос-Рrо-ОН растворяют в 20 мл сухого этилацетата, добавляют 50 мг 4-диметиламинопиридина и 2 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 4.2 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0oС и 30 мин при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат экстрагируют 50 мл воды, 50 мл насыщенного NaHCО3 и 50 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Получают 6.1 г бесцветного масла, Rf 0.65-0.7 (А).

б. Boc-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Масло Вос-Рrо-ОТсе (пример Iа) растворяют в 30 мл 2 М НСl в уксусной кислоте, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток переупаривают с толуолом, промывают эфиром и растворяют в 50 мл ДМФА. К раствору добавляют 9.5 г Boc-Tyr(Psc)-OH, 2.0 мл N-метилморфолина и 2.2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.5 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 2 ч при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату добавляют 150 мл этилацетата и экстрагируют 100 мл воды, 100 мл насыщенного NаНСО3, 100 мл 0.5 М KHSO4 и 50 мл насыщенного NaCl. Органический слой упаривают досуха и обрабатывают остаток петролейным эфиром. Получают 10.5 г бесцветного кристаллического продукта, Rf 0.7-0.75 (А); масс-спектр: (М+H)+ 724.2 (вычислено: 723.08).

в. Boc-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1б) растворяют в 40 мл 2 М НСl в уксусной кислоте, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток переупаривают с толуолом, промывают эфиром и растворяют в 70 мл ДМФА. К раствору добавляют 4 г Boc-Thr-OH, 1.8 мл N-метилморфолина и 2.4 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.5 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 3 ч при 20oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1б. Получают 11 г бесцветного аморфного вещества, Rf 0.40-0.45 (А); масс-спектр: (М+Н)+ 823.5 (вычислено: 823.19).

г. Boc-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1в) растворяют в 50 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 11 г трифторацетата H-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.95 г Boc-Gln-OH, 1.8 мл N-метилморфолина и 2.2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.3 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oC и 3 ч при 20oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1б. Остаток после упаривания экстракта обрабатывают эфиром и получают 10.4 г целевого продукта, Rf 0.15-0.20 (А), 0.50-0.55 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 921.5 (вычислено: 952.33).

д. Boc-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1г) растворяют в 50 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 9.8 г трифторацетата H-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3 г моногидрата Boc-Leu-OH, 1.4 мл N-метилморфолина и 2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 2.8 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 8 ч при 20oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1г. Получают 9.6 г целевого пентапептида, Rf 0.10-0.15 (А), 0.55-0.60 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 1067.3 (вычислено: 1065.50).

е. Boc-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-ОТсе (пример 1д) растворяют в 60 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 9.5 г трифторацетата H-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Рrо-ОТсе. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 6.5 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc), 1.4 мл N-метилморфолина и 1.4 г ОБТ. Перемешивают смесь 8 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 11.4 г гексапептида, Rf 0.35-0.40 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 1404.2 (вычислено: 1405.91).

ж. Boc-His(Boc)-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1е) растворяют в 60 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 11.5 г трифторацетата Н-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 5.4 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-His(Boc), 1.4 мл N-метилморфолина и 1.35 г ОБТ. Перемешивают смесь 12 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, переосаждают из ДМФА эфиром и получают 12.3 г гептапептида, f 0.30-0.40 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1444.1 (вычислено: 1442.94).

з. Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-His(Boc)-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1e) растворяют в 60 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 12 г бистрифторацетата H-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3 г N-гидроксисукцинимидного эфира Boc-Leu и 2.2 мл N-метилморфолина. Перемешивают смесь 18 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток этилацетатом. Осадок отфильтровывают, переосаждают из ДМФА эфиром и получают 11.6 г октапептида, f 0.10-0.15 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1554.6 (вычислено: 1556.11).

и. Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ia). К раствору 6.5 г Тсе-эфира сегмента Iа (пример 1з) в 60 мл тетрагидрофурана, 15 мл воды и 5 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 3 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 20 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 150 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Продукт переосаждают из уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 5.3 г целевого сегмента Ia, Rf 0.40-0.45 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1524.1 (вычислено: 1524.84); аминокислотный состав: Glx 0.93 (1); Thr 0.85 (1); Leu 2.00 (2); Pro 1.09 (1); Тyr 0.91 (1); His 1.13 (1); Lys 1.02 (1).

Пример 2. Получение Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-G1n-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ib).

a. Boc-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. 3.2 г трифторацетата H-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1е) растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 2 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Msc), 0.5 мл N-метилморфолина и 450 мг ОБТ. Перемешивают смесь 4 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 3.9 г гексапептида, Rf 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 1342.2 (вычислено: 1343.84).

б. Boc-His(Boc)-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 2а) растворяют в 15 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 4.0 г трифторацетата Н-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 20 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.8 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-His(Boc), 450 мкл N-метилморфолина и 400 мг ОБТ. Перемешивают смесь 12 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, переосаждают из уксусной кислоты эфиром и получают 4.0 г гептапептида, Rf 0.30-0.40 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1381.1 (вычислено: 1380.87).

в. Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-His(Boc)-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 2б) растворяют в 15 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 3.9 г бис-трифторацетата H-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 20 мл ДМФА, к раствору добавляют 900 мг N-гидроксисукцинимидного эфира Boc-Leu и 0.82 мл N-метилморфолина. Перемешивают смесь 24 ч при 20oС, затем обрабатывают смесь как описано в примере 1з и получают 3.8 г октапептида, Rf 0.08-0.15 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1495.1 (вычислено: 1494.04).

г. Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ib). К раствору 1.8 г Тсе-эфира сегмента Ib (пример 2в) в 20 мл тетрагидрофурана, 5 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 1 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 20 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 50 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Пептид переосаждают из уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 1.4 г целевого сегмента Ib, Rf 0.35-0.40 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1464.0 (вычислено: 1462.77); аминокислотный состав: Glx 1.04 (1); Thr 0.82 (1); Leu 2.00 (2); Pro 1.13 (1); Тyr 0.95 (1); His 1.08 (1); Lys 1.01 (1).

Пример 3. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент IIа).

a. Boc-Glu(OPse)-OTce. 4.2 г Boc-Glu(OPse)-OH растворяют в 20 мл сухого этилацетата, добавляют 20 мг 4-диметиламинопиридина и 1.2 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 2.3 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0oС и 60 мин при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат экстрагируют 20 мл воды, 30 мл насыщенного NaHCО3 и 30 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.0 г бесцветного кристаллического продукта, Rf 0.55-0.6 (А).

б. Boc-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Glu(OPse)-OTce (пример 3а) растворяют в 20 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 4.8 г трифторацетата H-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 2.6 г Boc-Gln-OH, 1.1 мл N-метилморфолина и 1.35 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 2.3 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 7 ч при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривают. Остаток промывают водой, упаривают с этанолом и кристаллизуют из эфира. Получают 5.4 г дипептида, Rf 0.15-0.20 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 676.3 (вычислено: 676.02).

в. Boc-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3б) растворяют в 20 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.4 г трифторацетата H-Gln-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.4 г пентафторфенилового эфира Boc-Ser и 1.1 мл N-метилморфолина. Перемешивают 1.5 ч при 20oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают гексаном, затем обрабатывают эфиром и получают 5.5 г трипептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 762.9 (вычислено: 763.10).

г. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTcc. Boc-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3в) растворяют в 20 мл ТФУ, через 50 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.4 г трифторацетата H-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.4 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Вос-Leu, 450 мг ОБТ и 1.1 мл N-метилморфолина. Перемешивают 5 ч при 20oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают водой, упаривают с этанолом, затем обрабатывают эфиром и получают 5.2 г тетрапептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 877.4 (вычислено: 876.28).

д. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3г) растворяют в 20 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.3 г трифторацетата H-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-ОТсе. Его растворяют в 25 мл ДМФА, к раствору добавляют 4.3 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc), 450 мг ОБТ и 1.4 мл N-метилморфолина. Перемешивают 2 ч при 20oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают водой, эфиром, упаривают с этанолом, затем обрабатывают эфиром и получают 6.5 г пентапептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1117.4 (вычислено: 1116.56).

e. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OH (сегмент Va). К раствору 6.0 г Тсе-эфира сегмента Va (пример 3д) в 50 мл тетрагидрофурана, 10 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 2 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 30 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 100 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Пептид переосаждают из смеси метанола и уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 4.2 г целевого сегмента Va, Rf 0.55-0.60 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1084.6 (вычислено: 1085.30); аминокислотный состав: Glx 2.04 (2); Ser 0.85 (1); Leu 1.00 (1); Lys 1.06 (1).

ж. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Рго-ОТсе (Тсе-эфир сегмента IIа). 1.65 г Тсе-эфира сегмента Ia (пример 1з) растворяют в 15 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 1.7 г бис-трифторацетата H-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 10 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.2 г сегмента Va (пример 3е), 270 мг ОБТ, 230 мкл N-метилморфолина и, при охлаждении в ледяной бане, 300 мг ДЦГК. Смесь перемешивают 2 ч при охлаждении, затем 18 ч при 20oС. Отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривают до масла и остаток обрабатывают 100 мл этилацетата. Осадок отделяют фильтрованием, переосаждают из ДМФА этилацетатом, промывают эфиром и получают 2.32 г тридекапептида; масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 2524.2 (вычислено: 2522.26).

з. Сегмент IIа. К 2.3 г Тсе-эфира IIа (пример 3ж) в смеси 10 мл ДМФА, 20 мл тетрагидрофурана, 5 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 1 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 50 мин, затем обрабатывают как описано в примере 3е. Получают 2 г сегмента IIа; масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 2389.6 (вычислено: 2390.87); аминокислотный состав: Glx 2.73 (3); Ser 0.83 (1); Thr 0.87 (1); Leu 3.00 (3); Pro 1.11 (1); Тyr 0.91 (l); His l.06 (l); Lys 2.02 (2).

Пример 4. Получение Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IIIa).

К раствору 770 мг сегмента Ia (пример 1и), 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI (Helv. Chim. Acta, 1969, v. 52, 1788-1795), 135 мг ОБТ и 100 мкл N-метилморфолина в 6 мл ДМФА добавляют 140 мг ДЦГК и перемешивают смесь 24 ч при 20oС. Реакционную смесь обрабатывают как описано в примере 1ж, полученный осадок сырого гептадекапептида растворяют в 20 мл смеси ацетонитрил-вода (1:4) и хроматографируют на колонке 4защищенные пептиды кальцитонина, патент № 219356715 см с LiChroprep RP18 (Merck, Германия) в градиенте ацетонитрила (от 10 до 50%) в воде, содержащей 0.2% ТФУ. Фракции, содержащие чистый продукт (более 90% по ВЭЖХ), объединяют и упаривают досуха, остаток обрабатывают эфиром и получают 0.94 г трифторацетата сегмента IIIа; масс-спектр: (М+Н)+ 2394.9 (вычислено: 2395.83); аминокислотный состав: Asx 1.01 (1); Glx 1.05 (1); Ser 0.81 (1); Thr 3.57 (4); Gly 1.94 (2); Leu 2.00 (2); Pro 2.08 (2); Тyr 0.90 (1); His 1.06 (l); Lys 1.08 (l); Arg 1.01 (1).

Пример 5. Получение Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IIIb)/

Получают из 750 мг сегмента Ib (пример 2) и 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI, как описано для сегмента IIIa в примере 4. После хроматографической очистки выделяют 0.86 г трифторацетата сегмента IIIb; масс-спектр: (М+Н)+ 2334.2 (вычислено: 2333.76); аминокислотный состав: Asx 1.08 (1); Glx 1.00 (1); Ser 0.84 (1); Thr 3.50 (4); Gly 1.96 (2); Leu 2.00 (2); Pro 1.88 (2); Туr 0.95 (1); His 1.09 (1); Lys 1.03 (1); Arg 1.00 (1).

Пример 6. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IVa). Вариант 1.

К раствору 1.25 г сегмента IIа (пример 3), 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI, 135 мг ОБТ и 120 мкл М-метилморфолина в 10 мл ДМФА добавляют 160 мг ДЦГК и перемешивают смесь 40 ч при 20oС. Реакционную смесь обрабатывают как описано в примере 1ж, полученный осадок сырого 22-пептида растворяют в 30 мл смеси ацетонитрил-вода (1:4) и хроматографируют на колонке защищенные пептиды кальцитонина, патент № 219356715 см с LiChroprep RP18 (Merck, Германия) в градиенте ацетонитрила (от 10 до 70%) в воде, содержащей 0.2% ТФУ. Фракции, содержащие чистый продукт (более 90% по ВЭЖХ), объединяют и упаривают досуха, остаток обрабатывают эфиром и получают 1.15 г трифторацетата сегмента IVa; масс-спектр: (М+H)+ 3363.1 (вычислено: 3361.97); аминокислотный состав: Asx 1.04 (1); Glx 3.15 (3); Ser 1.80 (2); Thr 3.48 (4); Gly 1.96 (2); Leu 3.00 (3); Pro 2.01 (2); Туr 0.88 (1); His 1.07 (1); Lys 2.10 (2); Arg 1.00 (1).

Пример 7. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IVa). Вариант 2.

С 1.30 г сегмента IIIa (пример 4) удаляют Вос-защиту действием ТФУ, как описано в примере 3ж, и получают 1.33 г трис-трифторацетата сегмента IIIа со свободной защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппой, (М+Н)+ 2295.3. Его конденсируют с 600 мг сегмента Va (пример 3е), как описано в примере 6. После хроматографической очистки выделяют 1.28 г трифторацетата сегмента IVa, идентичного полученному в примере 6.

Пример 8. Получение Boc-Lys(Cpsc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-GIn-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IVb).

a. Boc-Glu(OTse)-OTce. 2.2 г Boc-Glu(OTse)-OH растворяют в 10 мл сухого этилацетата, добавляют 10 мг 4-диметиламинопиридина и 0.65 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 1.2 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0oС и 60 мин при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат разбавляют 15 мл этилацетата и экстрагируют 20 мл воды, 30 мл насыщенного NaHCO3 и 30 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира и получают 2.5 г бесцветного кристаллического продукта, Rf 0.55-0.6 (А).

б. Boc-Gln-Glu(OTse)-OTce. Boc-Glu(OTse)-OTce (пример 8а) растворяют в 10 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 2.5 г трифторацетата H-Glu(OTse)-OTce. Его растворяют в 10 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.3 г Boc-Gln-OH, 600 мкл N-метилморфолина и 0.65 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 1.2 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 10 ч при 20oС, затем обрабатывают смесь как описано в примере 3б. Получают 2.8 г дипептида, Rf 0.15-0.20 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 689.4 (вычислено: 690.05).

в. Boc-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce. С дипептида Boc-Gln-Glu(OTse)-OTce (пример 8б) удаляют Вос-защиту и конденсируют его с 1.7 г пентафторфенилового эфира Boc-Ser, как описано в примере 3в. Получают 2.8 г трипептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 777.9 (вычислено: 777.11).

г. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce. С пептида Boc-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce (пример 8в) удаляют Вос-защиту и конденсируют его с 1.8 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Leu, как описано в примере 3г. Получают 2.7 г тетрапептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 892.0 (вычислено: 890.29).

д. Boc-Lys(Cpsc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce. С тетрапептида Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OTce (пример 8г) удаляют Вос-защиту и конденсируют его с 2.3 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Cpsc), как описано в примере 3д. Получают 3.3 г пентапептида (Тсе-эфира сегмента Vb), Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+H)+ 1166.4 (вычислено: 1165.04).

е. Boc-Lys(Cpsc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTse)-OH (сегмент Vb). С 3 г Тсе-эфира сегмента Vb (пример 8д) удаляют Tce-защиту обработкой цинковой пылью, как описано в примере 3е. Получают 2.3 г сегмента Vb, Rf 0.55-0.60 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1132.0 (вычислено: 1133.78); аминокислотный состав: Glx 1.86 (2); Ser 0.89 (1); Leu 1.00 (l); Lys 1.03(1).

ж. Сегмент IVb. С 600 мг трифторацетата сегмента IIIb (пример 5) удаляют Вос-защиту действием ТФУ и получают 620 мг трис-трифторацетата сегмента IIIb со свободной защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппой, (М+Н)+ 2232.3. Его конденсируют с 330 мг сегмента Vb (пример 8е), как описано в примере 6. После хроматографической очистки выделяют 630 мг трифторацетата сегмента IVb; масс-спектр: (М+Н)+ 3350.1 (вычислено: 3348.39); аминокислотный состав: Asx 1.01 (1); Glx 3.20 (3); Ser 1.88 (2); Thr 3.63 (4); Gly 2.04 (2); Leu 3.00 (3); Pro 2.03 (2); Тyr 0.94 (1); His 1.07 (1); Lys 2.01 (2); Arg 1.05 (1).

Пример 9. Получение кальцитонина лосося (с использованием сегмента IVa).

360 мг сегмента IVa растворяют в 3 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают досуха и обрабатывают остаток эфиром. Получают 365 мг трис-трифторацетата сегмента IVa со свободной защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппой, (М+Н)+ 3262.4. Его растворяют в 3 мл диметилсульфоксида, добавляют 130 мг сегмента VII (Helv. С him. Acta, 1969, v. 52, 1788-1795), 30 мкл N-метилморфолина, 27 мг ОБТ и 40 мг ДЦГК, смесь перемешивают 24 ч при 20oС. Отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату добавляют 40 мл этилацетата, выпавший осадок отделяют, получают 480 мг сырого защищенного 32-пептида VIIIa. Его обрабатывают ТФУ для удаления Вос-защиты, как описано выше, затем растворяют в 20 мл смеси ДМФА-вода (1:4). К раствору при сильном перемешивании в течение 30 с добавляют по каплям 2 мл 1 н. водного раствора гидроксида натрия и перемешивают еще 5 мин, затем добавляют 0.5 мл уксусной кислоты. Смесь разбавляют водой до 50 мл и наносят на колонку 4защищенные пептиды кальцитонина, патент № 219356715 см с целлюлозой СМ-52 (Whatman, Англия), уравновешенную 0.05 М ацетатом аммония (рН 5.9). Проводят элюцию градиентом от 0.1 до 0.7 М ацетата аммония (рН 5.9), фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и лиофилизуют. Получают 182 мг кальцитонина лосося; хроматографическая чистота по ВЭЖХ 92%, массовое содержание пептидного материала 76%. Масс-спектр: (М+Н)+ 3432.8 (вычислено: 3433.15); аминокислотный состав: Asx 2.01 (2); Glx 3.22 (3); Ser 3.58 (4); Thr 4.63 (5); Gly 3.04 (3); Val 0.94 (1); Leu 5.00 (5); Pro 2.11 (2); Туr 0.94 (1); His 1.07 (1); Lys 2.01 (2); Arg 1.05 (1); Cys не определяется.

Пример 10. Получение кальцитонина лосося (с использованием сегмента IVb).

360 мг сегмента IVb растворяют в 3 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают досуха и обрабатывают остаток эфиром. Получают 360 мг трис-трифторацетата сегмента IVb со свободной защищенные пептиды кальцитонина, патент № 2193567-аминогруппой, (М+Н)+ 3249.3. Его растворяют в 3 мл диметилсульфоксида, добавляют 130 мг сегмента VII и далее проводят конденсацию и обработку реакционной смеси, как описано в примере 9. Получают 510 мг сырого защищенного 32-пептида VIIIb. Его обрабатывают ТФУ для удаления Вос-защиты, как описано выше, затем деблокируют гидроксидом натрия, как описано в примере 9, в течение 20 мин. Хроматографией на целлюлозе СМ-52 выделяют 131 мг кальцитонина лосося, идентичного полученному в примере 9; хроматографическая чистота по ВЭЖХ 91%, массовое содержание пептидного материала 78%.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Защищенные пептиды общей формулы

Х1-Ley-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y,

где Х1= H-, A1O-CO-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-;

Y= -OH, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2;

А1 есть треть-бутил;

R1 - защитная группа формулы В1О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys;

R2 - защитная группа В2О-СО- для гидроксильной группы остатка Туr;

R3 - защитная группа формулы В3О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys;

В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,

причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.

Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K1/06 с использованием защитных групп или активирующих агентов

Патенты РФ в классе C07K1/06:
полипептиды, конкурентно ингибирующие gq- белок, способы их получения и применение -  патент 2487135 (10.07.2013)
способ получения пептида эксенатида -  патент 2458066 (10.08.2012)
пептидоподобное соединение, обладающее противовирусной активностью, и способ его получения -  патент 2450806 (20.05.2012)
способ получения нонапептидэтиламида и промежуточные соединения для его получения -  патент 2444525 (10.03.2012)
способ получения бусерелина и промежуточные соединения для его получения -  патент 2442791 (20.02.2012)
способ получения циклического пептида - октреотида -  патент 2435780 (10.12.2011)
способ ацилирования пептидов -  патент 2345062 (27.01.2009)
способ получения бициклических пептидных соединений -  патент 2330045 (27.07.2008)
способ получения аналогов аденокортикотропного гормона (актг), последовательности (4-10), обладающих нейротропной активностью, и тетрапептид для его получения -  патент 2315057 (20.01.2008)
способ получения гептапептида и промежуточные соединения для его получения -  патент 2303603 (27.07.2007)

Класс C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот

Патенты РФ в классе C07K7/06:
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
конъюгаты, содержащие гидрофильные спейсеры линкеров -  патент 2523909 (27.07.2014)
конъюгаты антагониста пептида аналога бомбезина -  патент 2523531 (20.07.2014)
применение производных пептида wnt5-a для лечения меланомы и рака желудка -  патент 2517190 (27.05.2014)
способ получения дегареликса -  патент 2515555 (10.05.2014)
композиции для лечения боли и/или воспаления -  патент 2515054 (10.05.2014)

Класс C07K14/585 кальцитонины

Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот

Патенты РФ в классе A61K38/08:
применение пептида актг (4-7)-пгп гепатопротекторного воздействия -  патент 2528741 (20.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
содежащий октреотид состав с замедленным высвобождением со стабильно высоким уровнем воздействия -  патент 2526822 (27.08.2014)
применение опиорфина в качестве психостимулирующего агента -  патент 2526819 (27.08.2014)
способ хирургического лечения острого панкреатита с ранним энтеральным интраоперационным питанием пациента -  патент 2526247 (20.08.2014)
способ лечения болезни альцгеймера -  патент 2526155 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
ингибиторы протеазы вируса гепатита с и их применение -  патент 2523790 (27.07.2014)
применение аналогов соматостатина при менингиоме -  патент 2523416 (20.07.2014)

Класс A61K38/23 кальцитонины

Патенты РФ в классе A61K38/23:
применение кальцитонина для лечения ревматоидного артрита -  патент 2453330 (20.06.2012)
способствующие растворению, содержащие бигуанид средства для пероральной доставки пептида -  патент 2433830 (20.11.2011)
применение кальцитонина в качестве комбинированной терапии для лечения воспалительных болезненных состояний -  патент 2394591 (20.07.2010)
способ увеличения массы костной ткани -  патент 2392981 (27.06.2010)
пептид, обладающий свойствами амилина (варианты), и его применение (варианты) -  патент 2385878 (10.04.2010)
гибридные полипептиды с селектируемыми свойствами -  патент 2378285 (10.01.2010)
способ лечения пациентов с атрофией альвеолярной части или отростка челюстей при остеопеническом синдроме -  патент 2377012 (27.12.2009)
применение кальцитонина при остеоартрите -  патент 2368390 (27.09.2009)
пероральное введение кальцитонина -  патент 2355417 (20.05.2009)
поглощение макромолекул -  патент 2349344 (20.03.2009)

Класс A61P19/10 остеопороза

Патенты РФ в классе A61P19/10:
2-пиридилзамещенные имидазолы в качесиве терапевтических ингибиторов alk5 и/или alk4 -  патент 2518069 (10.06.2014)
способ получения костного минерального компонента и костный минеральный компонент для замещения и восстановления дефектов костной ткани -  патент 2517037 (27.05.2014)
фармацевтические композиции на основе ипидакрина и их применение для лечения и профилактики нарушений целостности кости -  патент 2512743 (10.04.2014)
сульфонамидные соединения и их применение -  патент 2502730 (27.12.2013)
способ профилактики и лечения остеопороза и переломов костей и препарат для профилактики и лечения остеопороза и переломов костей -  патент 2498811 (20.11.2013)
способ и препарат для профилактики и лечения атипичного остеопороза с нормальной или повышенной минерализацией костной ткани с наличием полостных образований в трабекулярных отделах костей (и ему близких состояниях при избыточной массе и метаболическом синдроме) -  патент 2497533 (10.11.2013)
новые соединения со спирохиральной углеродной основой, способы их получения и фармацевтические композиции, содержащие такие соединения -  патент 2492173 (10.09.2013)
новые имидазолидиновые соединения как модуляторы андрогенных рецепторов -  патент 2488584 (27.07.2013)
способ увеличения минеральной плотности костной ткани -  патент 2481815 (20.05.2013)
антитело, направленное на белок siglec-15, связанный с остеокластами -  патент 2475499 (20.02.2013)


Наверх